Summary
Utilizamos muestras de la retina de retinectomía para un análisis transcriptomic de desprendimiento de retina. Hemos desarrollado un procedimiento que permite la conservación de RNA entre los bloques quirúrgicos y el laboratorio. Se estandarizó un protocolo para purificar el ARN mediante ultracentrifugación en cloruro de cesio para asegurar que los ARN purificados son adecuados para el análisis de microarrays.
Abstract
El desprendimiento de retina (DR) describe una separación de la retina neurosensorial del epitelio pigmentario de la retina (RPE). El RPE es esencial para la función normal de las neuronas sensibles a la luz, los fotorreceptores. Desprendimiento de la retina de la RPE crea una brecha física que se llena con el fluido extracelular. RD inicia los eventos adversos celulares y moleculares que afectan tanto a la retina neurosensorial y el EPR ya que el intercambio fisiológico de iones y metabolitos se ve gravemente perturbado. La consecuencia para la visión está relacionada con la duración de la separación desde una rápida reapposition de los dos tejidos en los resultados de la restauración de la visión 1. El tratamiento de la RD es exclusivamente quirúrgico. La eliminación del gel vítreo (vitrectomía) es seguido por la eliminación no parte esencial de la retina alrededor de la zona individual para favorecer el desprendimiento de retina. Las muestras de retina retirados son res nullius (nada) y por lo tanto normalmente se desechan.Para recuperar el ARN de estas piezas quirúrgicas, desarrollamos el Diario procedimiento que permite la conservación de ARN durante la transferencia del bloque quirúrgico para el laboratorio. También estandarizado un protocolo para purificar el ARN mediante ultracentrifugación cloruro de cesio para asegurar que los ARN purificados son adecuados para el análisis de la expresión génica global. La calidad del ARN fue validado tanto por RT-PCR y análisis de microarrays. El análisis de los datos muestra una participación simultánea de la inflamación y degeneración de los fotorreceptores durante RD.
Introduction
El principal objetivo terapéutico en desprendimiento de retina (DR) es encontrar una manera de limitar el daño celular y la inflamación de la retina fotorreceptor resultante de la separación de los fotorreceptores de las células epiteliales pigmentadas de la retina. Durante RD, las células de RPE se activan, migran, dedifferentiate, y proliferan en la superficie de la retina desprendida, ejerciendo fuerzas contráctiles que conducen a complicaciones. Análisis Transcriptómica de RD es una manera de identificar los genes diana con la expresión modificada como consecuencia de RD y por lo tanto las futuras moléculas terapéuticas que podrían mejorar el resultado visual final en combinación con la cirugía. Es bien sabido ácido ribonucleico (ARN) no es estable como es el ácido desoxirribonucleico (ADN), este último siendo utilizado ampliamente para estudios genéticos, su estabilidad había permitido la secuenciación del genoma del Neandertal a partir de muestras paleontológicos de más de 30.000 años de edad 2. La transcripción de ADN de los genes del genoma en ARN mensajero es laimportante proceso en la expresión génica, y el ARNm es lábil con el fin de constituir una señal. RNAs son rápidamente degradados por las enzimas ARNasa que terminan la señal. Cuando los tejidos se aíslan a partir de un organismo, los ARN son muy a menudo degrada antes de la expresión se estudió en un laboratorio de investigación. ARN degradados no es adecuado para el análisis de la expresión génica. Debido a que el personal de laboratorio no puede participar en la cirugía, se desarrolló un procedimiento que es fácil y sólo requiere que el cirujano para recuperar los tejidos en una solución de RNasa libre apropiado. Los ARN de los tejidos es estable y pueden ser analizados sin ningún signo de degradación después de 72 horas a temperatura ambiente en esta solución. Los ARN a partir de muestras se purifican por un método normalizado que implica una ultracentrifugación en un gradiente de cloruro de cesio después de haber sido transferidos al laboratorio 3. Entonces, la calidad de los ARN se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa y por RT-PCR. El protocolo de purificación de ARN tiene laventaja de separar las moléculas de acuerdo con su densidad que es diferente para el ADN y el ARN y asegura que el ARN no está contaminado por unas moléculas de ADN que generarán señales de artefactos en estudios de expresión génica. Además, los ARN de transferencia (ARNt), que son cuantitativamente los ARN más abundantes dentro de una célula, se separan de acuerdo con la misma propiedad física a partir del ARN ribosómico (ARNr) y los ARN mensajeros (ARNm), estos dos últimos uno de ellos el el producto final del proceso de purificación. La eliminación de ARNt de la preparación es útil ya que la mayoría de los protocolos de análisis de microarrays implicado el uso de transcriptasas inversas y polimerasas de ARN que son inhibidas por el ARNt 4-6. El ARN purificado a partir de muestras quirúrgicas están etiquetadas utilizando el protocolo estándar y se hibridan a un chip de micromatriz y los resultados se analizaron usando dos métodos complementarios, el método de la tasa de falso descubrimiento, y el uso de un nuevo método basado en la información mutua y visualized en el servidor basado en web Retinobase 7,8.
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Protocol
1. Diario: Procedimiento para recuperar las muestras del Bloque Quirúrgico
En el laboratorio
- Obtenga un contrato de importación de la empresa de transporte expreso.
- Llenar 10 (o 25) Formas de envío a la dirección postal del laboratorio que indica la persona de contacto en el laboratorio (número de teléfono y dirección de correo electrónico).
- Preparar 10 (o 25) formas muestras numeradas del 1 al 10 (o 25). Estas formas incluyen espacios dedicados a informar sobre: a) la identificación anónima del paciente, b) la fecha de la cirugía y c) cualquier observación complementaria que el cirujano le gustaría añadir. Preparar 10 (o 25) sobres acolchados (150 x 210 mm).
- Elaborado a partir de RNasa libre de reactivos 25 (o 65) ml de guanidina 6 M de cloruro de dietilo (DEPC) tratados con H 2 O (GHCL).
- Llenar 10 o 25 números tubos de fondo 5 ml estériles de polietileno redondas con 2,4 ml de solución GHCL.
- Se utiliza gas argón para llenar la parte superior de los tubos, de prensa tightly en la tapa para evitar la oxidación de la solución GHCL lo largo de varios años de almacenamiento en el armario quirúrgica.
- Introducir todos los tubos de 5 ml en un ml de polipropileno tubo de fondo cónico de 50 estéril con tapón de rosca. Use un pedazo de pañuelo de papel limpio para mantener el tubo 5 ml en el tubo de 50 ml, cerrar el tubo.
- Coloque los tubos de 50 ml en un estante de poliestireno y el bastidor en una caja de cartón con los sobres acolchados, las formas, las formas de envío de muestras.
- Pegue las instrucciones (véase: 1.12 a 1.19) en el interior de la cubierta de la caja de cartón para facilitar su lectura.
- Envíe la caja de cartón por correo a la persona de contacto en el hospital.
En el hospital
- Trae la caja de cartón de la caja quirúrgica a la sala quirúrgica. Nota de precaución: si el procedimiento implica un paciente inmunodeprimidos, el cartón no debe ser llevado a la sala de cirugía.
- Durante la cirugía, coloque el Specim retinaes numerada en 5 ml de polipropileno estéril lleno con una solución de GHCL. Cerrar bien el tubo.
- Volver brevemente el tubo.
- Colocar el tubo en el eje de balancín tubo de la sangre durante 10 min.
- Rellene el formulario numerado ejemplo que lo acompaña.
- Informe el número de identificación en el correspondiente tubo de 50 ml numerados.
- Introducir el tubo de 5 ml con la pieza quirúrgica en el tubo de 50 ml, reemplazar el tejido de papel y enrosque el tubo.
- Introducir el tubo y el formulario de muestra lleno en ella en uno de los sobres acolchados acompañan. Cerrarla.
- Llame a la compañía de transporte express para recoger.
2. La purificación de ARN
En el laboratorio
- Homogeneizar la muestra en su tubo de polipropileno de 5 ml con solución GHCL con un homogenizador durante 1 min mientras se mueve el tubo hacia arriba y abajo.
- Añadir 270 l de acetato de potasio 2 M de pH 5,0. Agitar vigorosamente durante 10 min colocando el tubo en un agitador en suposición horizontal (420 min -1).
- Centrifugar 10 minutos a 5000 rpm (6500 xg) a 20 ° C.
- Aspirar suavemente la fracción soluble sin perturbar el sedimento.
- Transferir a un tubo estéril de 14 ml.
- Añadir 5,3 ml de Tris 100 mM, pH 8,0, N-lauroilsarcosina al 1%.
- Añadir 3,2 g de cloruro de cesio (CsCl) y mezclar el tubo por agitación.
- Añadir 1,8 ml de ácido CsCl / etilendiaminotetraacético (EDTA) en un tubo de centrífuga de 11 ml estéril polialómero.
- Con una pipeta Pasteur estéril ml 10, transferir la solución de ARN en 1,8 ml de CsCl / EDTA por deslizamiento lentamente en el borde del tubo para evitar perturbar el cojín densidad.
- Colocar los tubos (un segundo tubo que contiene los tampones sin retina si es necesario) en el rotor.
- Centrifugar 24 horas a 32.000 rpm (225.000 xg) a 20 ° C.
- Quite la parte superior de la solución con una pipeta Pasteur estéril y descartarlo.
- Eliminar gradualmente mientras se comprueba elmomento en que el ADN (viscoso) se aspira con una segunda pipeta Pasteur estéril y descartarla.
- Retirar la solución restante teniendo cuidado de no liberar el precipitado de ARN con una tercera pipeta Pasteur estéril.
- Sección de la parte inferior del tubo con una llama-bisturí esterilizado, a continuación, poner la parte restante del tubo boca abajo sobre una mirada estéril.
- Invierta el tubo y enjuagar delicadamente con 160 l de GHCL.
- Deje que el pellet seco durante 10 min.
- Resuspender el precipitado en 150 l de (Tris 10 mM, pH 7,5 a 1 mM de EDTA - 0.1% de SDS).
- Transferir la solución a un tubo de microcentrífuga de 2 ml estéril, a continuación, cosechar el sedimento residual con 30 l de (Tris 10 mM, pH 7,5 a 1 mM de EDTA - 0.1% de SDS).
- Añadir 150 l de (Tris 10 mM, pH 7,5 a 1 mM de EDTA).
- Añadir 30 l de 3 M de acetato sódico pH 5,0, el tubo de vórtice.
- Añadir 900 l de etanol al 100% (-20 ° C), el tubo de vórtice.
- Coloque el tubo de 30 min en hielo que se derrite.
- Centrifuge el tubo 30 min a 15.000 rpm a 4 ° C.
- Aspirar delicadamente la fracción soluble, y lo descarta.
- Añadir 500 l de etanol al 70% (RT), el tubo de vórtice.
- Centrifugar el tubo 20 min a 15.000 rpm (18.000 xg) a 4 ° C.
- Repetir la etapa de lavado (etanol al 70%).
- Centrifugar brevemente y eliminar el resto de etanol con una pipeta P200.
- Deje que el aire seco pellet durante 10 min.
- Resuspender el precipitado en 50 l tratada con DEPC H 2 O.
- Mezclar vigorosamente en vortex.
- Incubar 15 min a 45 ° C en un baño de agua.
3. Análisis de ARN mediante electroforesis en gel
- Vierta un gel de agarosa dentro de una campana química.
- En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril, añadir 2 l de ARN a analizar y 6,4 l de tampón de preparación de muestras.
- En un segundo tubo de 1,5 ml, añadir 3 l de estándares de ARN y 9,6 l de tampón de preparación de muestras.
- Calentar los tubos 15 min a 65 ° C, Ponlas en hielo.
- Añadir 1 l de bromuro de etidio (EB) tampón de carga sin colorante en el tubo de muestra de ARN y 1 l EB tampón de carga con colorante en el tubo de estándares de ARN.
- Ejecutar el gel en 80 a 100 V dentro de una campana química en funcionamiento de amortiguación, hasta que uno de los colorantes (azul de bromofenol) alcanza 2/3 de la parte inferior del gel.
- Enjuague el gel dos veces 15 minutos con 250 ml de DEPC tratada con 2x SSC.
- Tome una imagen digitalizada bajo iluminación UV.
- Calcular la relación entre la banda superior (23S rRNA) y la banda inferior (16S rRNA).
4. La purificación final de la ARN
- Ajustar el volumen de la muestra de ARN de 100 l con tratada con DEPC H2O (si es necesario).
- Añadir 100 l de ácido fenol (1 ml de fenol saturado en tratada con DEPC H 2 O + 130 l de 50 mM de acetato de sodio, pH 5.2) y agitar vigorosamente.
- Centrifugar el 10 min a 13.000 rpm (15.000 xg) a temperatura ambiente.
- Recover con cuidado y transferir la fase acuosa (fase superior) en una novela un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril.
- Añadir 10 l de acetato de sodio 3 M, pH 5,2 y 250 l de etanol al 100% (-20 ° C).
- Incubar el tubo 30 min en hielo de fusión.
- Centrifugar el tubo 30 min a 14.000 rpm (18.000 xg) a 4 ° C.
- Aspirar cuidadosamente la fracción soluble, y lo descarta.
- Añadir 500 l de etanol al 70% (temperatura ambiente), y el tubo de vórtice.
- Centrifugar el tubo 20 min a 14.000 rpm (18.000 xg) a 4 ° C.
- Repetir la etapa de lavado (etanol al 70%).
- Centrifugar brevemente y eliminar el resto de etanol con una pipeta P200.
- Deje secar al aire el precipitado durante 10 minutos.
- Resuspender el precipitado en 50 l de DEPC tratada con H 2 O.
- Se incuba entonces tubo de 15 min a 45 ° C.
- Medir la absorbancia (Abs) a 260 nm y 280 nm en 2 l de la muestra de ARN. Se calcula la relación Abs260/Abs280. <li> Guarde la muestra de ARN a -80 ° C (estable durante varios años).
5. Soluciones y Procedimientos de Limpieza
- Acetato de potasio 2 M, pH 5,0: Disolver 19,6 g de acetato de potasio en 70 ml de DEPC tratada con H 2 O. Limpiar la sonda medidor de pH por inmersión en con NaOH 1 M durante 15 min, seguido de 5 lavados con tratada con DEPC H 2 O. Ajustar el pH a 5,0 con ácido acético a continuación, ajustar el volumen a 100 ml con tratada con DEPC H 2 O.
- Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, N-lauroilsarcosina al 1%: Disolver 2 g de N-lauroilsarcosina (bajo una campana) para 40 ml de 0,5 M de Tris-base de pH 8,0. Ajustar el volumen a 200 ml con tratada con DEPC H2O) de CsCl / EDTA: 96 g de CsCl en 50 ml de 10 mM de EDTA pH 7,5 preparado con tratada con DEPC H 2 O. Esterilizar en autoclave y ajustar el volumen a 100 ml con tratada con DEPC H 2 O. Compruebe pH <7,5.
- Gel de agarosa al 1%: Poner 1 g de agarosa en 62 ml DEPC tratada con H 2 O. Hervir en un horno de microondas. Añadir 18 ml de 12,3 Mformaldehído, 20 ml de MOPS 5x. Vierta dentro de una campana química.
- Sample Buffer prep: Para ser extemporánea preparado. Mezclar dentro de una campana química 8 l de MOPS 5x, 16 l de 12,3 M de formaldehído y 40 l de formamida.
- Tampón de carga EB (sin colorantes): Para ser extemporánea preparado. Añadir 4 l 10 mg / ml de bromuro de etidio en 20 l de 80% de glicerol preparado con tratada con DEPC H 2 O.
- Tampón de carga EB (con tinte): Para ser extemporánea preparado. Añadir 2 l 10 mg / ml de bromuro de etidio en 10 l de 80% de glicerol que contiene 0,25% Xylen cianol, 0,25% de azul de bromofenol con tratada con DEPC H 2 O.
- El tampón: A 60 ml de MOPS 5x, añadir 54 ml de formaldehído 12,3 M y 186 ml de DEPC tratada con H 2 O.
- Tratada con DEPC H 2 O: agua destilada Incubar con pirocarbonato de dietilo 0,1% v / v durante 2 horas a 37 ° C con agitación. Esterilizar en autoclave.
- Limpieza del homogeneizador: Añadir 25 ml de solución de limpieza (RBS) a 1 l de DEPC-tratado H 2 O, y sumergir el eje 1 min con agitación. Incubar 2 horas a 60 ° C. Enjuague bien con DEPC tratada con H 2 O Envolver el instrumento en aluminio y poner en el cuadro de instrumentos. Envuelva la caja. Esterilizar en autoclave.
- Limpieza del dispositivo de electroforesis: Lavar el aparato, la bandeja y el peine 15-pozos. Incubar 15 minutos en peróxido de hidrógeno al 3%. Enjuagar una vez con etanol al 100%. Deje secar al aire.
- Limpieza de los platos de cristal: Limpie los platos de cristal RBS 2% durante toda la noche, y luego enjuague con agua destilada antes de la esterilización a 200 ° C.
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Representative Results
El procedimiento de auditoría (Figura 1) permite recuperar muestras de retina del bloque quirúrgico para ARN purificado, y para analizar el transcriptoma de desprendimiento de retina. Resultados de desprendimiento de retina en la regulación al alza de la quimiotáctica de monocitos MCP1 gen CCL2, y en la disminución de la expresión de la varilla fotorreceptor transducir gen GNAT1, el cono de onda corta opsina OPN1SW, y la homeogene CRX (Figura 2). La inducción de CCL2 es resultante de la inflamación 9, mientras que la reducción concomitante de GNAT1, OPN1SW y CRX es el resultado de la degeneración de los fotorreceptores, ambos conos y bastones. La pérdida de conos puede resultar de la pérdida de expresión de NXNL1, que codifica para una viabilidad Cono varilla derivado de Factor de 7,10, o su RdCVF2 paralogue, que está codificada por el gen NXNL2. Sorprendentemente, el ex mensajero NXNL2tas en dos versiones diferentes. Versión 1 (NM_001161625.1) es una secuencia de codificación derivada de un análisis filogenético, pero no se ha informado anteriormente que se expresa 11, mientras que la versión 2 (NM_145283.2), para el que ha sido identificado varias ESTs es un ARNm anormal que excluye la segunda exón del gen y contiene un segundo exón alternativo, que contiene una secuencia Alu repetitiva, situada a más de 40 kb en la dirección 3 '(Figura 3a). Uso de ARN purificadas a partir de retina humana, podemos ahora informado de que las dos versiones de la NXNL2 se expresan ARNm (Figura 3b).
Figura 1. Imagen de la caja de cartón que contiene el material proporcionado por el diario.
Figura 2. Representación de la expresión de un subconjunto de genes utilizando Retinobase. Para los genes mostrados en estos gráficos de radar, CCL2, GNAT1, OPN1SW, y CRX, la parte derecha de la figura corresponde al ARN a partir de muestras de desprendimientos de retina (RD1-18), mientras que la parte izquierda (NR1-18) son RNA controles de edad comparable elaborados con retinas post-mortem. El método gráfico de radar se describe en la 8.
Figura 3. La expresión de la versión de dos del gen NXNL2 en la retina. una representación. esquemática de la NXNL2 gen en el cromosoma 9. NXNL2v1 tiene dos exones que se predice por la alineación múltiple y análisis filogenético. NXNL2v2 falta segundo exón y que incluye un exón alternativo 2 ', situada> 40 kb en la dirección 3'. Tél flechas muestran la posición del cebador utilizado. b. RT-PCR que muestra la expresión de tanto NXNL2v1 y NXNL2v2 en la retina. Los carriles de la derecha corresponden a la reacción en ausencia de la transcriptasa inversa. ACTB, actina citoplasmática. Los cebadores usados: NXNL2v1: 5'-GCATGAGCTGAGGAAGAGGT-3 ', 5'-CTCA AACGGAGAAATTCTGGA-3', 5'-NXNLv2: TCTGCACCCCCACGTTTATT-3 ', 5'-AGGGCCTCCT TTTCCATCTA-3'.
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Discussion
El desarrollo de un procedimiento para la recuperación de los tejidos del bloque quirúrgico ha sido esencial para el análisis del transcriptoma de desprendimiento de retina. Uno debe darse cuenta de que este tipo de cirugía se practica en situaciones de emergencia y que el operativo oftalmólogos tienen poco tiempo para participar en un programa de investigación biológica cuando operan. Este retinectomía también se lleva a cabo estocásticamente en cada servicio, por lo que la forma más fácil de llegar a un número estadísticos es trabajar con una red. En tal red, la normalización de la colección de tejidos es esencial el éxito del análisis biológico. Al proporcionar un material muy fácil de usar y las instrucciones precisas, que pueden almacenarse a temperatura ambiente en un armario de la cirugía, junto al bloque quirúrgico, se ha alentado a los cirujanos que participan en nuestro estudio.
Además, la estandarización de la purificación del ARN se logró para obtener el mejor de estos preciosos clespecímenes inical. Las colecciones de los ARN puros pueden ser almacenados durante años a -80 ° C y se utilizan para estudios posteriores a medida que surgen nuevas tecnologías genómicas. El protocolo se proporciona pieza quirúrgica retina, pero también puede ser utilizado con éxito para aislar ARN a partir de retina de roedores después de la disección. Si el ARN se degradan, a) comprobar el pH de la solución de CsCl / EDTA. b) tomar todas las soluciones de los productos químicos utilizados. La principal limitación de la técnica es la cantidad de material que debe corresponder a las células, al menos, 50.000 de partida.
Lo que distingue el método utilizado aquí a partir de la mayoría de los reactivos comerciales previstas para aislar el ARN total es el grado de pureza. RNA se agota de cualquier contaminación de ADN que elimina la necesidad de utilizar el tratamiento con ADNasa que puede ser perjudicial para cualquier procedimiento ulterior. Además, las preparaciones de ARN total se agotan aquí en el tRNA, que se sabe que son potentes inhibidores de las polimerasas de ARN que se utilizan comúnmente en losla etapa de amplificación antes de la hibridación a chips de micromatriz. Hemos observado que las sondas sintetizadas a partir de estas preparaciones de ARN tienen una muy alta actividad específica. El grado de pureza del ARN preparó siguiendo el método descrito aquí está muy bien adaptado para la hibridación de microarrays, sino también para la construcción de bibliotecas de ADNc de alta calidad y para la secuenciación de ARN como hemos observado. El laboratorio debe estar libre de RNasa. El pH de la CsCl / EDTA deberá ser ácido para evitar la degradación del ARN por lisis alcalina. La densidad de la CsCl / EDTA debe ser verificada con cuidado a fin de no ser demasiado alta y para prevenir la sedimentación de ARN.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a Sacha Reichman y Dominique Santiard-Baron por su ayuda en la edición del protocolo de purificación de RNA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
References
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