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Medicine

पत्रिका का उपयोग मानव रेटिना सर्जिकल नमूने के transcriptomic विश्लेषण

Published: August 14, 2013 doi: 10.3791/50375
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 4, 1,2,3, 1,2,3
1U968, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2UMR S 968, Université Pierre et Marie Curie, 3UMR 7210, Centre National de la Recherche Scientifique, 4Départment d'Ophtalmologie, Centre Hospitalier Universitaire de Bordeaux

Summary

हम रेटिना टुकड़ी के एक transcriptomic विश्लेषण के लिए retinectomy से रेटिना नमूनों का इस्तेमाल किया. हम सर्जिकल ब्लॉक और प्रयोगशाला के बीच शाही सेना के संरक्षण की अनुमति देता है कि एक प्रक्रिया विकसित की है. हम शुद्ध RNAs के माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं विश्वास दिलाता हूं कि सीज़ियम क्लोराइड ultracentrifugation द्वारा शाही सेना को शुद्ध करने के लिए मानकीकृत एक प्रोटोकॉल.

Abstract

रेटिना टुकड़ी (आरडी) रेटिना वर्णक उपकला (RPE) से neurosensory रेटिना के एक जुदाई का वर्णन करता है. RPE के प्रकाश के प्रति संवेदनशील न्यूरॉन्स, photoreceptors के सामान्य कार्य के लिए आवश्यक है. RPE से रेटिना की टुकड़ी बाह्य तरल पदार्थ से भरा है कि एक भौतिक अंतर पैदा. आरडी neurosensory रेटिना और आयनों और मेटाबोलाइट्स के शारीरिक विनिमय गंभीर रूप से परेशान कर रहा है के बाद से RPE दोनों को प्रभावित करती है कि सेलुलर और आणविक प्रतिकूल घटनाओं आरंभ करता है. दर्शन के लिए परिणाम दृष्टि 1 की बहाली में दो ऊतकों परिणामों की एक तेजी से reapposition के बाद से सेना की टुकड़ी की अवधि से संबंधित है. आरडी के इलाज के लिए विशेष रूप से शल्य चिकित्सा है. कांच का जेल (vitrectomy) को हटाने के रेटिना टुकड़ी के पक्ष में अलग क्षेत्र के आसपास रेटिना को हटाने गैर अनिवार्य हिस्सा द्वारा पीछा किया जाता है. हटा रेटिना नमूनों को छोड़कर nullius (कुछ नहीं) कर रहे हैं और इसके परिणामस्वरूप सामान्य रूप से खारिज कर दिया.इन शल्य नमूनों से शाही सेना को ठीक करने के लिए, हम प्रयोगशाला के लिए शल्य ब्लॉक से स्थानांतरण के दौरान शाही सेना के संरक्षण की अनुमति देता है कि प्रक्रिया पत्रिका का विकास किया. हम भी सीज़ियम क्लोराइड ultracentrifugation द्वारा शाही सेना को शुद्ध करने के लिए मानकीकृत एक प्रोटोकॉल शुद्ध RNAs के वैश्विक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं कि विश्वास दिलाता हूं. शाही सेना की गुणवत्ता दोनों RT-पीसीआर और माइक्रोएरे विश्लेषण द्वारा मान्य किया गया था. आंकड़ों के विश्लेषण से आरडी के दौरान सूजन और फोटोरिसेप्टर अध: पतन का एक साथ भागीदारी से पता चलता है.

Introduction

रेटिना टुकड़ी में मुख्य चिकित्सीय उद्देश्य (आरडी) रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं से photoreceptors के अलग होने से उत्पन्न फोटोरिसेप्टर कोशिका क्षति और रेटिना सूजन सीमित करने के लिए एक रास्ता खोजने के लिए है. आरडी के दौरान, RPE कोशिकाओं dedifferentiate, विस्थापित, सक्रिय कर रहे हैं, और जटिलताओं के लिए अग्रणी सिकुड़ा बलों exerting, अलग रेटिना की सतह पर पैदा करना. आरडी की Transcriptomics विश्लेषण आरडी और शल्य चिकित्सा के साथ संयोजन में अंतिम दृश्य परिणाम में सुधार सकता है इसलिए भविष्य चिकित्सकीय अणुओं का पालन संशोधित अभिव्यक्ति के साथ लक्ष्य जीन की पहचान करने के लिए एक रास्ता है. यह अच्छी तरह से deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) के रूप में ribonucleic एसिड (आरएनए) स्थिर नहीं है जाना जाता है, आनुवंशिक अध्ययन के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जा रहा है उत्तरार्द्ध, इसकी स्थिरता 2 पुराने 30,000 से अधिक वर्षों के paleontological नमूनों से निएंडरथल जीनोम का अनुक्रमण की अनुमति दी थी. दूत शाही सेना में जीनोम से जीन के डीएनए के प्रतिलेखन हैप्रमुख जीन अभिव्यक्ति में प्रक्रिया, और mRNA एक संकेत का गठन करने के क्रम में अस्थिर है. RNAs के संकेत समाप्त जो RNAse एंजाइमों से बहुत तेजी से अपमानित कर रहे हैं. अभिव्यक्ति एक अनुसंधान प्रयोगशाला में अध्ययन किया है पहले ऊतकों एक जीव से अलग कर रहे हैं, RNAs बहुत बार अपमानित कर रहे हैं. अपमानित शाही सेना विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति के लिए अनुकूल नहीं है. प्रयोगशाला स्टाफ सर्जरी में भाग नहीं ले सकते, क्योंकि हम आसान है कि एक प्रक्रिया विकसित की है और केवल सर्जन एक उपयुक्त RNase मुक्त समाधान में ऊतकों को ठीक करने की आवश्यकता है. ऊतकों की शाही सेना स्थिर है और इस समाधान में कमरे के तापमान पर 72 घंटे के बाद गिरावट के किसी भी हस्ताक्षर के बिना विश्लेषण किया जा सकता है. नमूनों से RNAs प्रयोगशाला 3 के लिए हस्तांतरित किया गया है के बाद एक सीज़ियम क्लोराइड ढाल पर एक ultracentrifugation शामिल मानकीकृत विधि द्वारा शुद्ध कर रहे हैं. फिर, RNAs के गुणवत्ता agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा और RT-पीसीआर द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं. शाही सेना शुद्धि प्रोटोकॉल हैडीएनए और आरएनए के लिए अलग है और आरएनए जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन में artifactual संकेतों उत्पन्न होगा एक डीएनए अणु से दूषित नहीं है कि भरोसा दिलाते हैं कि उनके घनत्व के अनुसार अणुओं को अलग करने का लाभ. इसके अलावा, मात्रात्मक एक कोशिका के भीतर सबसे प्रचुर मात्रा में आरएनए हैं जो हस्तांतरण RNAs (tRNAs), ribosomal शाही सेना (rRNAs) और दूत RNAs (mRNAs), किया जा रहा है उन दो पिछले एक से एक ही भौतिक संपत्ति के हिसाब से अलग हो रहे हैं शुद्धिकरण की प्रक्रिया के उत्पाद अंत. माइक्रोएरे विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल का सबसे tRNA 4-6 से हिचकते हैं जो रिवर्स transcriptases और आरएनए पीसीआर के उपयोग शामिल है के बाद से तैयारी से tRNA के हटाने उपयोगी है. शल्य नमूनों से शुद्ध आरएनए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग लेबल और एक माइक्रोएरे चिप को संकरित और परिणाम पूरक दो तरीकों, झूठे खोज दर पद्धति का उपयोग कर, और आपसी जानकारी और visuali पर आधारित एक उपन्यास विधि का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैंवेब आधारित सर्वर Retinobase 7,8 पर जेड.

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Protocol

1. जर्नल: सर्जिकल ब्लॉक से नमूने वसूल करने की प्रक्रिया

प्रयोगशाला में

  1. एक्सप्रेस शिपिंग कंपनी से एक आयात अनुबंध करें.
  2. प्रयोगशाला (फोन नंबर और ईमेल पते) में संपर्क व्यक्ति का संकेत प्रयोगशाला की डाक पते के साथ (या 25) शिपिंग रूपों 10 भरें.
  3. (या 25) 10 तैयार नमूने रूपों 10 (या 25) के लिए 1 गिने. इन रूपों), रोगी की) गुमनाम पहचान को सूचित करने के लिए सर्जरी की तारीख और ग) कोई अतिरिक्त टिप्पणी सर्जन जोड़ना चाहते हैं ख समर्पित रिक्त स्थान शामिल हैं. 10 (या 25) गद्देदार लिफाफे (150 x 210 मिमी) तैयार करें.
  4. (DEPC) एच 2 ओ (जीएचसीएल) का इलाज diethylpyrocarbonate में 6 एम guanidine क्लोराइड की RNase मुक्त अभिकर्मकों 25 (या 65) मिलीलीटर का उपयोग कर तैयार.
  5. भरें 10 या 25 जीएचसीएल समाधान के 2.4 मिलीलीटर के साथ 5 मिलीलीटर बाँझ पॉलीथीन दौर नीचे ट्यूब गिने.
  6. प्रेस ती से, इन ट्यूबों के शीर्ष भाग को भरने के लिए आर्गन गैस प्रयुक्तghtly शल्य कैबिनेट में भंडारण के कई वर्षों में जीएचसीएल समाधान के ऑक्सीकरण रोकने के लिए टोपी पर.
  7. एक 50 मिलीलीटर बाँझ पॉलीप्रोपाइलीन शंक्वाकार नीचे ट्यूब पेंच टोपी के साथ में हर 5 मिलीलीटर ट्यूबों का परिचय दें. 50 मिलीलीटर ट्यूब में 5 मिलीलीटर ट्यूब पकड़ के लिए स्वच्छ कागज ऊतक का एक टुकड़ा का उपयोग करें, ट्यूब बंद करें.
  8. गद्देदार लिफाफे, शिपिंग रूपों, नमूने रूपों के साथ एक गत्ता बॉक्स में एक polystyrene रैक और रैक पर 50 मिलीलीटर ट्यूबों रखें.
  9. उनके पढ़ने की सुविधा के लिए कार्डबोर्ड बॉक्स के कवर के अंदर: निर्देश (1.12-1.19 देखें) चिपकाएं.
  10. अस्पताल में संपर्क व्यक्ति से मेल द्वारा कार्डबोर्ड बॉक्स भेजें.

अस्पताल में

  1. शल्य चिकित्सा के कमरे में शल्य कैबिनेट से गत्ते का डिब्बा ले आओ. नोट सावधानी: प्रक्रिया एक प्रतिरक्षा समझौता रोगी शामिल है, गत्ता शल्य चिकित्सा के कमरे में नहीं लाया जाना चाहिए.
  2. सर्जरी के दौरान, रेटिना specim जगहगिने 5 मिलीलीटर बाँझ पॉलीप्रोपाइलीन में एन जीएचसीएल समाधान के साथ भरा. कसकर ट्यूब बंद करें.
  3. संक्षेप में ट्यूब लौटें.
  4. 10 मिनट के लिए रक्त ट्यूब घुमाव पर ट्यूब रखें.
  5. साथ नमूना गिने फार्म भरें.
  6. इसी गिने 50 मिलीलीटर ट्यूब पर पहचान संख्या रिपोर्ट.
  7. 50 मिलीलीटर ट्यूब में शल्य नमूना के साथ 5 मिलीलीटर ट्यूब का परिचय, कागज ऊतक की जगह और ट्यूब पेंच.
  8. साथ गद्देदार लिफाफे में से एक में ट्यूब और उसमें भरा नमूना प्रपत्र का परिचय दें. इसे बंद करो.
  9. लेने के लिए व्यक्त शिपिंग कंपनी को बुलाओ.

2. शाही सेना शोधन

प्रयोगशाला में

  1. ट्यूब ऊपर और नीचे जा रहा है, जबकि 1 मिनट के लिए एक homogenizer के साथ जीएचसीएल समाधान के साथ अपने 5 मिलीलीटर ट्यूब polypropylene में नमूना homogenize.
  2. 2 एम पोटेशियम एसीटेट 5.0 पीएच के 270 μl जोड़ें. अपने में एक प्रकार के बरतन पर ट्यूब रखकर 10 मिनट के लिए सख्ती से हिलाक्षैतिज स्थिति (420 मिनट -1).
  3. 20 डिग्री सेल्सियस से कम 5,000 आरपीएम (6,500 XG) पर 10 मिनट अपकेंद्रित्र
  4. गोली परेशान बिना आसानी से घुलनशील अंश महाप्राण.
  5. एक 14 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में स्थानांतरण.
  6. 100 मिमी Tris पीएच 8.0, एन Lauroylsarcosine 1% की 5.3 मिलीलीटर जोड़ें.
  7. सीज़ियम क्लोराइड (CSCL) की 3.2 ग्राम जोड़ें और vortexing द्वारा ट्यूब मिश्रण.
  8. एक बाँझ 11 मिलीलीटर polyallomer अपकेंद्रित्र ट्यूब में CsCl / ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के 1.8 मिलीलीटर जोड़ें.
  9. एक 10 मिलीलीटर बाँझ पाश्चर विंदुक के साथ, घनत्व गद्दी परेशान करने से बचने के लिए ट्यूब के किनारे पर धीरे फिसलने से 1.8 मिलीलीटर CsCl / EDTA पर शाही सेना समाधान हस्तांतरण.
  10. रोटर में ट्यूब (रेटिना यदि आवश्यक हो तो बिना बफ़र्स युक्त एक दूसरा ट्यूब) रखें.
  11. 20 डिग्री सेल्सियस से कम 32,000 आरपीएम (225,000 XG) पर 24 घंटा अपकेंद्रित्र
  12. एक बाँझ पाश्चर विंदुक के साथ समाधान का बेहतर हिस्सा निकालें, और यह त्यागें.
  13. जाँच के दौरान धीरे - धीरे निकालेंडीएनए (चिपचिपा) एक दूसरे बाँझ पाश्चर पिपेट साथ aspirated, और इसे त्यागने है जब पल.
  14. एक तिहाई बाँझ पाश्चर विंदुक के साथ शाही सेना गोली रिलीज करने के लिए नहीं ख्याल रख रही शेष समाधान निकालें.
  15. साथ ट्यूब की धारा नीचे एक छुरी लौ निष्फल, तो यह उल्टा एक बाँझ टकटकी पर ट्यूब के शेष भाग में डाल दिया.
  16. ट्यूब उल्टा और जीएचसीएल के 160 μl के साथ नाजुक कुल्ला.
  17. 10 मिनट के लिए गोली सूखी.
  18. के 150 μl (- 1 मिमी EDTA - 0.1% एसडीएस 10 मिमी Tris पीएच 7.5) में गोली Resuspend.
  19. एक 2 मिलीलीटर बाँझ microcentrifuge ट्यूब में समाधान स्थानांतरण, तब के 30 μl (- 1 मिमी EDTA - 0.1% एसडीएस 10 मिमी Tris पीएच 7.5) के साथ अवशिष्ट गोली फसल.
  20. के 150 μl (- 1 मिमी EDTA 10 मिमी Tris पीएच 7.5) जोड़ें.
  21. 3 एम सोडियम एसीटेट पीएच 5.0, भंवर ट्यूब के 30 μl जोड़ें.
  22. इथेनॉल 100% (-20 डिग्री सेल्सियस), भंवर ट्यूब के 900 μl जोड़ें.
  23. बर्फ पिघलने में ट्यूब 30 मिनट रखें.
  24. केंद्र4 पर 15,000 rpm पर ट्यूब 30 मिनट डिग्री सेल्सियस trifuge
  25. नाजुक घुलनशील अंश महाप्राण, और यह त्यागें.
  26. 500 μl 70% इथेनॉल (आर टी), भंवर ट्यूब जोड़ें.
  27. 4 पर 15,000 आरपीएम (18,000 XG) में ट्यूब 20 मिनट डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र
  28. Rinsing कदम (70% इथेनॉल) दोहराएँ.
  29. संक्षेप में अपकेंद्रित्र और एक P200 विंदुक के साथ शेष इथेनॉल खत्म.
  30. 10 मिनट के लिए गोली शुष्क हवा हैं.
  31. 50 μl DEPC इलाज एच 2 ओ में गोली Resuspend
  32. Vortexing द्वारा सख्ती से मिलाएं.
  33. एक पानी के स्नान में 45 पर 15 मिनट डिग्री सेल्सियस सेते हैं.

3. जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा शाही सेना विश्लेषण

  1. एक रासायनिक हुड के अंदर एक agarose जेल डालो.
  2. एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में विश्लेषण किया जा करने के लिए शाही सेना के 2 μl और नमूना प्रस्तुत करने का बफर के 6.4 μl जोड़ें.
  3. एक दूसरे की 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में शाही सेना के मानकों के 3 μl और नमूना प्रस्तुत करने का बफर के 9.6 μl जोड़ें.
  4. 65 में ट्यूबों 15 मिनट हीट डिग्री सेल्सियस, बर्फ पर डाल दिया.
  5. शाही सेना नमूना ट्यूब और आरएनए मानकों ट्यूब में डाई के साथ 1 μl ईबी लदान बफर में डाई बिना 1 μl ethidium ब्रोमाइड (ईबी) लोड हो रहा है बफर जोड़ें.
  6. रंगों में से एक (bromophenol नीला) जेल के नीचे से 2/3 पहुंचता है जब तक बफर चलाने में एक रासायनिक हुड के अंदर 100 वी, - 80 के तहत जेल चलाएँ.
  7. जेल 250 मिलीलीटर डे DEPC इलाज 2x एसएससी के साथ दो बार 15 मिनट कुल्ला.
  8. पराबैंगनी रोशनी के तहत एक digitalized छवि ले लो.
  9. ऊपरी बैंड (23S rRNA) और निचले बैंड (16S rRNA) के बीच अनुपात की गणना.

4. शाही सेना की अंतिम शोधन

  1. DEPC इलाज एच 2 ओ (यदि आवश्यक) के साथ 100 μl को शाही सेना के नमूने की मात्रा समायोजित करें.
  2. 100 फिनोल एसिड की μl (1 मिलीलीटर फिनोल सोडियम एसीटेट, पीएच 5.2 से 50 मिमी के DEPC इलाज एच 2 ओ + 130 μl में संतृप्त) सख्ती, भंवर. जोड़ें
  3. कमरे के तापमान पर 13,000 आरपीएम (15,000 XG) पर 10 मिनट अपकेंद्रित्र.
  4. Recoveआर एक उपन्यास एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जलीय चरण (ऊपरी चरण) ध्यान और हस्तांतरण.
  5. 3 एम सोडियम एसीटेट, पीएच 5.2 और इथेनॉल के 250 μl 100% (-20 डिग्री सेल्सियस) के 10 μl जोड़ें.
  6. बर्फ पिघलने में ट्यूब 30 मिनट सेते हैं.
  7. 4 पर 14,000 आरपीएम (18,000 XG) में ट्यूब 30 मिनट डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र
  8. ध्यान से घुलनशील अंश महाप्राण, और यह त्यागें.
  9. 500 70% इथेनॉल के μl (कमरे के तापमान), और भंवर ट्यूब जोड़ें.
  10. 4 पर 14,000 आरपीएम (18,000 XG) में ट्यूब 20 मिनट डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र
  11. Rinsing कदम (70% इथेनॉल) दोहराएँ.
  12. संक्षेप में अपकेंद्रित्र और एक P200 विंदुक के साथ शेष इथेनॉल खत्म.
  13. हवा 10 मिनट के लिए गोली सूखा.
  14. DEPC इलाज एच 2 ओ के 50 μl में गोली Resuspend
  15. तब 45 में ट्यूब 15 मिनट डिग्री सेल्सियस सेते
  16. शाही सेना नमूना के 2 μl पर 260 एनएम और 280 एनएम पर absorbance (पेट) उपाय. अनुपात Abs260/Abs280 की गणना.
    17. <ली> स्टोर -80 में शाही सेना नमूना डिग्री सेल्सियस (कई वर्षों के लिए स्थिर).

5. समाधान और सफाई प्रक्रियाओं

  1. पोटेशियम एसीटेट 2 एम, 5.0 पीएच: DEPC इलाज एच 2 ओ के 70 मिलीलीटर में 19.6 ग्राम पोटेशियम एसीटेट भंग DEPC इलाज एच 2 ओ के साथ 5 rinses, जिसके बाद 15 मिनट के लिए 1 एम NaOH के साथ में भिगोने से पीएच मीटर जांच साफ एसिटिक एसिड के साथ 5.0 पीएच को समायोजित करें तो DEPC इलाज एच 2 ओ के साथ 100 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें
  2. Tris-एचसीएल 100 मिमी, 8.0 पीएच, एन Lauroylsarcosine 1%: 0.5 एम Tris आधार पीएच 8.0 के 40 मिलीलीटर में एन Lauroylsarcosine की 2 ग्राम (एक हुड के अंतर्गत) भंग. ) DEPC इलाज एच 2 ओ के साथ 200 मिलीलीटर मात्रा समायोजित CsCl / EDTA: DEPC इलाज एच 2 ओ के साथ तैयार 50 मिलीलीटर 10 मिमी EDTA 7.5 पीएच में CsCl की 96 ग्राम आटोक्लेव और DEPC इलाज एच 2 ओ के साथ 100 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें पीएच <7.5 के लिए जाँच करें.
  3. Agarose जेल 1%: 62 मिलीलीटर DEPC इलाज एच 2 ओ में agarose के 1 ग्राम रखो एक माइक्रोवेव ओवन में उबाल लें. 12.3 एम के 18 मिलीलीटर जोड़ेंformaldehyde, 5x MOPS के 20 मिलीलीटर. एक रासायनिक हुड के अंदर डालो.
  4. नमूना प्रस्तुत करने का बफर: तैयार आशु हो. 5x MOPS, 12.3 एम formaldehyde और formamide के 40 μl के 16 μl के एक रासायनिक हुड 8 μl अंदर मिलाएं.
  5. ईबी लोडिंग बफर (डाई) के बिना: तैयार आशु हो. DEPC इलाज एच 2 ओ के साथ तैयार 80% ग्लिसरॉल के 20 μl में 4 μl 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर ethidium ब्रोमाइड जोड़ें
  6. ईबी लोडिंग बफर (डाई) के साथ: तैयार आशु हो. 0.25% xylen cyanol, DEPC इलाज एच 2 ओ के साथ 0.25% bromophenol नीले युक्त 80% ग्लिसरॉल के 10 μl में 2 μl 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर ethidium ब्रोमाइड जोड़ें
  7. बफर चल रहा है: 60 मिलीलीटर 5x MOPS करने के लिए, 12.3 एम formaldehyde के 54 मिलीग्राम और DEPC इलाज एच 2 ओ की 186 मिलीलीटर जोड़ें
  8. सरगर्मी के साथ 37 पर 2 घंटे के लिए 0.1% v / वी diethylpyrocarbonate साथ सेते आसुत जल डिग्री सेल्सियस: एच 2 ओ DEPC इलाज. आटोक्लेव द्वारा जीवाणुरहित.
  9. Homogenizer सफाई: का 1 एल को सफाई के समाधान के 25 मिलीलीटर (आरबीएस) जोड़ें DEPC-एच 2 ओ इलाज किया, और सरगर्मी के साथ धुरी 1 मिनट immerge. 60 पर 2 घंटा सेते डिग्री सेल्सियस एल्यूमीनियम में DEPC इलाज एच 2 ओ लपेटें साधन के साथ अच्छी तरह कुल्ला और साधन बॉक्स में डाल दिया. बॉक्स लपेटें. आटोक्लेव द्वारा जीवाणुरहित.
  10. वैद्युतकणसंचलन डिवाइस सफाई: तंत्र, ट्रे और 15 कुओं कंघी धो लें. 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में 15 मिनट सेते हैं. 100% इथेनॉल के साथ एक बार कुल्ला. शुष्क हवा.
  11. कांच के बर्तन साफ ​​सफाई: सारी रात कांच के बर्तन आरबीएस 2% स्वच्छ, तो 200 डिग्री सेल्सियस पर नसबंदी से पहले आसुत पानी से कुल्ला

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Representative Results

प्रक्रिया जर्नल (चित्रा 1) हमें शुद्ध शाही सेना को सर्जिकल ब्लॉक से रेटिना के नमूनों की वसूली, और रेटिना टुकड़ी के transcriptome विश्लेषण करने की अनुमति देता है. Monocyte chemotactic MCP1 जीन CCL2, की upregulation में और जीन GNAT1, शॉर्ट वेव कोन opsin OPN1SW, और homeogene CRX (चित्रा 2) transducing रॉड फोटोरिसेप्टर की अभिव्यक्ति में कमी के रेटिना टुकड़ी का परिणाम है. GNAT1, OPN1SW और CRX के सहवर्ती कमी फोटोरिसेप्टर अध: पतन, छड़ और शंकु दोनों का परिणाम है, जबकि CCL2 के शामिल होने, सूजन 9 से उत्पन्न है. शंकु के नुकसान NXNL2 जीन द्वारा इनकोडिंग है जो एक रॉड व्युत्पन्न कोन व्यवहार्यता फैक्टर 7,10, या अपने paralogue RdCVF2, के लिए encodes जो NXNL1 की अभिव्यक्ति की हानि, से परिणाम हो सकता है. हैरानी की बात है, NXNL2 दूत पूर्वदो अलग अलग संस्करणों में ists. संस्करण 1 (NM_001161625.1) phylogenic विश्लेषण से व्युत्पन्न एक कोडन अनुक्रम है लेकिन कई ESTs पहचान की गई है, जिसके लिए 2 संस्करण (NM_145283.2), दूसरी शामिल नहीं है कि एक असामान्य mRNA है जबकि पहले 11 व्यक्त होने की सूचना नहीं किया गया है जीन की एक्सॉन और 3 'दिशा (चित्रा 3a) में 40 से अधिक केबी स्थित एक दोहराव Alu के अनुक्रम, जिसमें एक वैकल्पिक दूसरे एक्सॉन होता है. मानव रेटिना से शुद्ध शाही सेना का उपयोग करना, हम अब NXNL2 mRNA के दो संस्करणों (चित्रा 3b) व्यक्त कर रहे हैं कि रिपोर्ट में कर सकते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. पत्रिका द्वारा उपलब्ध कराई गई सामग्री युक्त कार्डबोर्ड बॉक्स का चित्र.

चित्रा 2
चित्रा 2. Retinobase का उपयोग जीन की एक सबसेट की अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व. इन रडार रेखांकन में प्रदर्शित जीन, CCL2, GNAT1, OPN1SW, और CRX के लिए, आंकड़े के सही भाग, (RD1-18) रेटिना टुकड़ी के नमूनों से शाही सेना से मेल खाती है बाएं हिस्से (NR1-18) पोस्टमार्टम रेटिना का उपयोग कर तैयार से उम्र मिलान नियंत्रण आरएनए रहे हैं. रडार ग्राफ विधि 8 में वर्णित है.

चित्रा 3
चित्रा 3. रेटिना में NXNL2 जीन के दो संस्करण की अभिव्यक्ति. 9 गुणसूत्र पर NXNL2 जीन की. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. NXNL2v1 NXNL2v2 कि दूसरा एक्सॉन लापता है. कई संरेखण और phylogenic विश्लेषण ने भविष्यवाणी कर रहे हैं कि दो exons है और एक वैकल्पिक एक्सॉन 2 शामिल दिशा ', स्थित 3 में> 40 केबी'. टीवह तीर इस्तेमाल किया प्राइमर की स्थिति दिखाते हैं. ख. RT-पीसीआर रेटिना में NXNL2v1 और NXNL2v2 दोनों की अभिव्यक्ति दिखा. सही गलियों रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के अभाव में प्रतिक्रिया के अनुरूप हैं. ACTB, साइटोप्लाज्मिक एक्टिन. इस्तेमाल किया प्राइमर: NXNL2v1: 5'-GCATGAGCTGAGGAAGAGGT -3 ', 5'-CTCA AACGGAGAAATTCTGGA -3', NXNLv2: 5'-TCTGCACCCCCACGTTTATT -3 ', 5'-AGGGCCTCCT TTTCCATCTA -3'.

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Discussion

सर्जिकल ब्लॉक से ऊतक वसूली के लिए एक प्रक्रिया का विकास रेटिना टुकड़ी के transcriptome विश्लेषण करने के लिए आवश्यक हो गया है. एक सर्जरी के इस प्रकार की आपात स्थिति में और नेत्र रोग विज्ञानियों ऑपरेटिंग वे काम जब एक जैविक अनुसंधान कार्यक्रम में भाग लेने के लिए कम समय है कि अभ्यास है कि ध्यान देना चाहिए. इस retinectomy भी सांख्यिकीय संख्या तक पहुँचने के लिए आसान तरीका है एक नेटवर्क के साथ काम करने की है, जिससे कि प्रत्येक सेवा में stochastically किया जाता है. इस तरह के नेटवर्क में, ऊतकों संग्रह का मानकीकरण जैविक विश्लेषण की सफलता के लिए आवश्यक है. , बहुत उपयोग करने में आसान और एक सर्जरी कैबिनेट में कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है कि सटीक निर्देश, सर्जिकल ब्लॉक के करीब एक सामग्री प्रदान करके, हम सर्जन हमारे अध्ययन में भाग लेने के लिए प्रोत्साहित किया है.

इसके अलावा, शाही सेना की शुद्धि के मानकीकरण इन कीमती सीएल का सबसे अच्छा पाने के लिए हासिल की थीinical नमूनों. शुद्ध RNAs के संग्रह -80 डिग्री सेल्सियस पर साल के लिए भंडारित किया जा सकता है और उपन्यास जीनोमिक्स तकनीकों उभरने के रूप में आगे के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. प्रोटोकॉल रेटिना शल्य नमूना के लिए प्रदान की जाती है, लेकिन यह भी विच्छेदन के बाद कृंतक रेटिना से शाही सेना को अलग करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है. शाही सेना अपमानित कर रहे हैं, तो एक) CsCl / EDTA समाधान के पीएच की जाँच करें. ख) अप्रयुक्त रसायनों से सभी समाधान करना. तकनीक की मुख्य सीमा कम से कम 50,000 कोशिकाओं के अनुरूप होना चाहिए जो सामग्री शुरू करने की मात्रा है.

क्या कुल शाही सेना को अलग करने के लिए प्रदान सबसे वाणिज्यिक अभिकर्मकों से यहां इस्तेमाल विधि शुद्धता की डिग्री है अलग. शाही सेना किसी भी आगे की प्रक्रिया के लिए हानिकारक हो सकता है कि DNase उपचार का उपयोग करने की आवश्यकता समाप्त, जो किसी भी डीएनए संदूषण के समाप्त हो गया है. इसके अलावा, कुल शाही सेना की तैयारी यहां सामान्यतः में उपयोग किया जाता है कि शाही सेना पीसीआर की प्रबल inhibitors होने के लिए जाना जाता है, tRNA में समाप्त हो रहे हैंमाइक्रोएरे चिप्स के संकरण से पहले प्रवर्धन कदम. हम इन शाही सेना की तैयारी से संश्लेषित जांच एक बहुत उच्च विशिष्ट गतिविधि है कि देखा है. शाही सेना की शुद्धता की डिग्री पर भी उच्च गुणवत्ता की सीडीएनए पुस्तकालयों के निर्माण और हम देखा है के रूप में शाही सेना के लिए अनुक्रमण के लिए, बहुत अच्छी तरह से माइक्रोएरे संकरण के लिए अनुकूल है यहाँ वर्णित विधि से तैयार किया. प्रयोगशाला RNase मुक्त होना चाहिए. CsCl / EDTA के पीएच क्षारीय सेल द्वारा शाही सेना की गिरावट से बचने के अम्लीय होना चाहिए. CsCl / EDTA के घनत्व को ध्यान से बहुत अधिक हो और शाही सेना के अवसादन को रोकने के लिए नहीं आदेश में सत्यापित किया जाना चाहिए.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम शाही सेना शुद्धि प्रोटोकॉल संपादन में उनकी मदद के लिए सच्चा Reichman और डोमिनिक Santiard-दिग्गज धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Beckman Coulter Aventi J-E
Rotor Beckman Coulter JS-5.3
Ultracentrifuge Beckman Coulter LE 80K
Rotor Beckman Coulter SW41
Power supply Biorad Pac 3000
PolytronTM Kinematica PT 2100 Supplied with PT-DA 2105:2
Agarose gel electrophoresis device Biorad MiniGel Cell GT
Imaging System Biorad GelDoc-It Imager
5 ml sterile polyethylene tube Greiner 115261
Sterile polyallomer centrifuge tube Beckman Coulter 331372
Chemical reagents Sigma Molecular biology grade (RNase and DNase free products)
Cleaning Solution VWR RBS
Microarray chip Affymetrix Human U133 plus 2 array

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References

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Delyfer, M. N., Aït-Ali, N., Camara, H., Clérin, E., Korobelnik, J. F., Sahel, J. A., Léveillard, T. Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl. J. Vis. Exp. (78), e50375, doi:10.3791/50375 (2013).

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