Summary
Usamos amostras de retina de retinectomy para uma análise transcriptomic de descolamento de retina. Foi desenvolvido um processo que permite a conservação de ARN entre os blocos cirúrgicos e laboratoriais. Temos um protocolo padronizado para purificar RNA por ultracentrifugação de cloreto de césio para assegurar que os ARN purificados são adequados para a análise de microarray.
Abstract
Descolamento da retina (RD) descreve a separação da retina neurosensorial do epitélio pigmentado da retina (RPE). O RPE é essencial para a função normal dos neurônios sensíveis à luz, os fotorreceptores. Descolamento de retina, a partir do RPE cria uma lacuna física que é preenchido com o fluido extracelular. RD inicia os eventos adversos celulares e moleculares que afectam tanto a retina neurosensorial e o RPE desde a troca fisiológico de iões e metabolitos é gravemente perturbada. A consequência de visão está relacionada com a duração do desprendimento desde um reapposition rápida dos dois tecidos resulta na restauração da visão 1. O tratamento de RD é exclusivamente cirúrgico. A remoção do gel vítreo (vitrectomia) é seguido pela remoção de parte não essencial da retina em torno da área individual para favorecer descolamento da retina. As amostras retiradas da retina são res nullius (nada) e, conseqüentemente, normalmente descartado.Para recuperar RNA desses espécimes cirúrgicos, desenvolvemos o processo diário que permite a conservação da RNA durante a transferência do bloco cirúrgico para o laboratório. Também um protocolo padronizado para purificar RNA por ultracentrifugação de cloreto de césio para assegurar que os ARN purificados são adequados para análise da expressão genética global. A qualidade do RNA foi validada tanto por RT-PCR e análise de microarray. A análise dos dados mostra uma participação simultânea da inflamação e degeneração de fotorreceptores durante RD.
Introduction
O principal objectivo terapêutico no descolamento da retina (DR) é a de encontrar uma maneira para limitar os danos de células fotorreceptoras da retina e inflamação resultante da separação dos fotorreceptores a partir das células epiteliais pigmentadas da retina. Durante RD, células de RPE são activados, migrar desdiferenciem, e proliferar na superfície da retina descolada, exercendo forças contrácteis levando a complicações. Análise transcriptômica de RD é uma maneira de identificar genes-alvo com expressão alterada na sequência RD e, portanto, futuros moléculas terapêuticas que poderiam melhorar o resultado visual final em combinação com a cirurgia. É bem sabido que o ácido ribonucleico (RNA) não é estável como é o ácido desoxirribonucleico (ADN), o último sendo amplamente utilizados para estudos genéticos, a sua estabilidade tinha permitido a sequenciação do genoma a partir de amostras neandertalense paleontológicos de mais de 30.000 anos de idade 2. A transcrição do DNA dos genes a partir do genoma em RNA mensageiro é oimportante no processo de expressão de genes, e o mRNA é instável, a fim de constituir um sinal. RNAs são muito rapidamente degradados pelas enzimas ARNase que terminam o sinal. Quando são isoladas a partir de tecidos de um organismo, os RNAs são muitas vezes degradados antes que a expressão é estudado num laboratório de investigação. RNA degradado não é adequado para análise de expressão génica. Porque o pessoal do laboratório não pode participar de cirurgia, foi desenvolvido um procedimento que é fácil e requer apenas que o cirurgião para recuperar os tecidos em uma solução de RNase apropriado. O ARN dos tecidos é estável e pode ser analisado sem qualquer sinal de desgaste, após 72 horas à temperatura ambiente nesta solução. Os ARN provenientes de amostras são purificados por um método normalizado que envolve uma ultracentrifugação em gradiente de cloreto de césio depois de ter sido transferido para o laboratório 3. Em seguida, a qualidade dos ARN são avaliados por electroforese em gel de agarose e por RT-PCR. O protocolo de purificação de RNA tem ovantagem de separar as moléculas de acordo com a sua densidade, que é diferente do DNA e RNA e assegura que o ARN não é contaminada por uma moléculas de ADN que irão gerar sinais artefatuais em estudos de expressão de genes. Além disso, os ARN de transferência (ARNt), que são quantitativamente o ARN mais abundantes no interior de uma célula, são separados de acordo com as mesmas propriedades físicas do RNA ribossomal (rRNAs) e o RNA mensageiro (mRNA), os dois últimos sendo um deles o o produto final do processo de purificação. A remoção de ARNt a partir da preparação é útil uma vez que a maioria dos protocolos analíticos microarray envolveu a utilização de transcriptase reversa e ARN polimerases que são inibidos pelo ARNt 4-6. O ARN purificado a partir de amostras cirúrgicas são rotulados usando o protocolo padrão e hibridado com um chip de microarray, e os resultados são analisados utilizando dois métodos complementares, o método de taxa de detecção falsa, e utilizando um novo método baseado na informação mútua e visualized no servidor web-based Retinobase 7,8.
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Protocol
1. Jornal: Procedimento para recuperar as amostras do Bloco Cirúrgico
No laboratório
- Obter um contrato de importação da empresa de transporte expresso.
- Preencha 10 (ou 25) formas de envio com o endereço postal do laboratório, indicando a pessoa de contato em laboratório (número de telefone e endereço de e-mail).
- Prepare a 10 (ou 25) em forma de amostras numeradas de 1 a 10 (ou 25). Estas formas incluem espaços dedicados a informar sobre a) identificação anônima do paciente, b) a data da cirurgia e c) quaisquer observações adicionais, o cirurgião gostaria de adicionar. Prepare a 10 (ou 25) envelopes almofadados (150 x 210 mm).
- Preparado utilizando ARNase isento de reagentes 25 (ou 65) ml de cloreto de guanidina 6 M em dietilpirocarbonato (DEPC) tratado com H 2 O (GHCL).
- Encher 10 ou 25 numerados de 5 ml de fundo redondo de polietileno tubos estéreis com 2,4 ml de solução GHCL.
- Usado gás árgon para preencher a parte de cima destes tubos, que prima tightly na tampa para evitar a oxidação da solução GHCL ao longo de vários anos de armazenagem no gabinete cirúrgico.
- Introduzir a cada 5 ml tubos em um ml de polipropileno tubo de fundo cônico 50 estéril com tampa de rosca. Use um pedaço de lenço de papel limpo para segurar o tubo de 5 ml para o tubo de 50 ml, fechar o tubo.
- Coloque os tubos de 50 ml em um rack de poliestireno e do rack em uma caixa de papelão com os envelopes almofadados, as formas de transporte, as formas de amostras.
- Cole as instruções (veja: 1,12-1,19) no interior da tampa da caixa de papelão para facilitar a sua leitura.
- Enviar a caixa de papelão pelo correio para a pessoa de contato no hospital.
No hospital
- Traga a caixa de papelão do gabinete cirúrgico para a sala cirúrgica. Cuidado Nota: Se o procedimento envolve um paciente imunológico comprometido, o papelão não devem ser trazidos para a sala cirúrgica.
- Durante a cirurgia, coloque o SPECIM retinaen numerado em 5 ml de polipropileno estéril preenchido com solução GHCL. Feche bem o tubo.
- Retorne o tubo rapidamente.
- Coloque o tubo sobre o roqueiro tubo de sangue por 10 min.
- Preencha o formulário numerado amostra que o acompanha.
- Informar o número de identificação para a numeração 50 ml tubo correspondente.
- Introduzir o tubo de 5 ml com o espécime cirúrgico no tubo de 50 ml, substituir o tecido de papel e aperte o tubo.
- Introduzir o tubo e a forma de exemplo para encher em um dos envelopes almofadados anexas. Fechá-lo.
- Ligue para a empresa de transporte expresso para pegar.
2. Purificação de RNA
No laboratório
- Homogeneizar a amostra em seu 5 ml de polipropileno tubo com a solução GHCL com um homogeneizador de 1 min enquanto se movimenta o tubo de cima e para baixo.
- Adicionar 270 ul de 2 M de acetato de potássio pH 5,0. Agita-se vigorosamente durante 10 min, colocando o tubo num agitador na suaposição horizontal (420 min -1).
- Centrifugar 10 min a 5000 rpm (6500 xg) a 20 ° C.
- Aspirar suavemente a fração solúvel, sem perturbar o sedimento.
- Transfira para um tubo estéril de 14 ml.
- Adicionar 5,3 mL de Tris 100 mM pH 8,0, N-lauroilsarcosina a 1%.
- Adicionar 3,2 g de cloreto de césio (CsCl) e o tubo de misturar em vortex.
- Adicionar 1,8 ml de ácido de CsCl / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) num tubo de centrífuga de polialómero ml estéril 11.
- Com 10 ml estéril pipeta Pasteur, transferir a solução de ARN para 1,8 ml de CsCl / EDTA, deslizando-se lentamente sobre a borda do tubo, para evitar perturbar a almofada de densidade.
- Colocar os tubos (um segundo tubo contendo os buffers sem retina, se necessário) no rotor.
- Centrifugar 24 horas a 32.000 rpm (225.000 xg) a 20 ° C.
- Remova a parte superior da solução com uma pipeta Pasteur estéril, e descartá-lo.
- Retire gradualmente durante a verificação damomento em que o ADN (viscoso) é aspirado com uma pipeta de Pasteur estéril, segundo, e descartá-lo.
- Remover a solução restante tendo o cuidado de não libertar o sedimento de ARN com uma terceira pipeta Pasteur estéril.
- A seção inferior do tubo com um bisturi chama-esterilizados, em seguida, colocar o restante do tubo de cabeça para baixo em um olhar estéril.
- Inverta o tubo e lave delicadamente com 160 ml de GHCL.
- Deixar o sedimento secar durante 10 min.
- Ressuspender o sedimento em 150 ul de (Tris 10 mM pH 7,5 - EDTA 1 mM - 0,1% de SDS).
- Transferir a solução para um tubo de microcentrífuga estéril ml 2, depois colher o sedimento residual com 30 ul de (Tris 10 mM pH 7,5 - EDTA 1 mM - 0,1% de SDS).
- Adicionar 150 ul de (Tris 10 mM pH 7,5 - EDTA 1 mM).
- Adicionar 30 ul de 3 M de acetato de sódio pH 5.0, o tubo de vórtice.
- Adicionar 900 ul de etanol a 100% (-20 ° C), o tubo de vórtice.
- Colocar o tubo de 30 min em gelo fundente.
- Centrifuge o tubo 30 min a 15.000 rpm a 4 ° C.
- Aspirar delicadamente a fração solúvel, e descartá-lo.
- Adicionar 500 ul de etanol a 70% (RT), o tubo de vórtice.
- Centrifugar o tubo de 20 min a 15.000 rpm (18.000 xg) a 4 ° C.
- Repetir o passo de enxaguamento (70% de etanol).
- Centrifugar brevemente e eliminar o etanol remanescente com uma pipeta P200.
- Deixar o sedimento secar durante 10 min.
- Ressuspender o sedimento em 50 ul tratada com DEPC H2O
- Misture vigorosamente em vortex.
- Incubar 15 min a 45 ° C num banho de água.
3. Análise de RNA por eletroforese em gel
- Despeje um gel de agarose dentro de um capuz química.
- Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril, adicionar 2 ul de RNA a ser analisado e de 6,4 mL de tampão de preparação de amostra.
- Num segundo tubo de 1,5 ml, adicionar 3 ml de padrões de RNA e de 9,6 mL de tampão de preparação de amostra.
- Aquece-se a tubos de 15 min a 65 ° C, Colocá-los no gelo.
- Adicionar 1 mL de brometo de etidio (EB), tampão de carregamento sem corante no tubo de amostra de ARN e 1 ul de tampão EB carga com corante no tubo de padrões de ARN.
- Executar o gel inferior a 80 - 100 V dentro de uma capa de química em tampão de funcionamento, até que um dos corantes (azul de bromofenol) atinge 2/3 do fundo do gel.
- Lavar o gel duas vezes, 15 min, com 250 ml de tratada com DEPC 2x SSC.
- Pegue uma imagem digitalizada sob iluminação UV.
- Calcular a relação entre a banda superior (23S rRNA) e a banda inferior (ARNr 16S).
4. A purificação final do ARN
- Ajustar o volume da amostra de RNA com 100 ul com tratada com DEPC H2O (se necessário).
- Adicionam-se 100 ul de ácido fenol (1 ml de fenol saturado em tratada com DEPC H2O + 130 ul de 50 mM de acetato de sódio, pH 5,2), vortex vigorosamente.
- Centrifugar a 10 min a 13.000 rpm (15.000 x g), à temperatura ambiente.
- Recover e transferir cuidadosamente a fase aquosa (fase superior) para um novo um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril.
- Adicionar 10 ul de acetato de sódio 3M, pH 5,2 e 250 ul de etanol a 100% (-20 ° C).
- Incubar o tubo 30 min em gelo fundente.
- Centrifugar o tubo de 30 min a 14.000 rpm (18.000 xg) a 4 ° C.
- Aspirar cuidadosamente a fração solúvel, e descartá-lo.
- Adicionar 500 ul de etanol a 70% (temperatura ambiente), e o tubo de vórtice.
- Centrifugar o tubo de 20 min a 14.000 rpm (18.000 xg) a 4 ° C.
- Repetir o passo de enxaguamento (70% de etanol).
- Centrifugar brevemente e eliminar o etanol remanescente com uma pipeta P200.
- Deixe o ar seco do sedimento para 10 min.
- Ressuspender o sedimento em 50 mL de tratada com DEPC H2O
- Incubar em seguida, tubo de 15 min a 45 ° C.
- Medir a absorvância (Abs) a 260 nm e 280 nm, em 2 mL da amostra de RNA. Calculado o Abs260/Abs280 ratio. <li> loja a amostra de ARN a -80 ° C (estável durante vários anos).
5. Soluções e procedimentos de limpeza
- Acetato de potássio 2 M, pH 5,0: Dissolver 19,6 g de acetato de potássio em 70 ml de DEPC-H2O tratada Limpar a sonda medidor de pH por imersão em com NaOH 1M durante 15 min, seguido de 5 lavagens com tratada com DEPC H2O Ajustar a pH 5,0 com ácido acético, em seguida, ajustar o volume para 100 ml com DEPC-H2O tratada
- Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, N-lauroilsarcosina 1%: Dissolve-se 2 g de N-lauroilsarcosina (sob um capuz) para 40 ml de 0,5 M de Tris base, pH 8,0. Ajustar o volume a 200 ml com DEPC-H2O tratada) de CsCl / EDTA: 96 g de CsCl em 50 ml de 10 mM EDTA pH 7,5, preparado com DEPC-H2O tratada Autoclave e ajustar o volume a 100 ml com tratada com DEPC H2O Verificar pH <7,5.
- Em gel de agarose 1%: Coloque 1 g de agarose em 62 ml de DEPC-H2O tratada Coza no forno de microondas. Adicionar 18 ml de 12,3 Mformaldeído, 20 ml de MOPS 5x. Verter dentro de uma capa de química.
- Preparação de amostras de buffer: Para ser extemporânea preparado. Misturar no interior de um produto químico cobertura 8 ul de MOPS 5x, 16 ml de formaldeído a 12,3 M e 40 ul de formamida.
- Tampão de carregamento EB (sem corante): Para ser extemporânea preparado. Adicionar 4 ul de 10 mg / ml de brometo de etídio em 20 ul de glicerol a 80% preparada com tratada com DEPC H2O
- Tampão de carregamento EB (com corante): Para ser extemporânea preparado. Adicionam-se 2 ul de 10 mg / ml de brometo de etídio em 10 ul de glicerol a 80% contendo 0,25% de xilema cianol, 0,25% de azul de bromofenol tratada com DEPC H2O
- O tampão de corrida: A 60 ml de MOPS 5x, adicionar 54 mL de 12,3 M de formaldeído e 186 ml de tratada com DEPC H2O
- Tratada com DEPC H2O: água destilada Incubar com 0,1% v / v de dietilpirocarbonato durante 2 horas a 37 ° C com agitação. Esterilizar em autoclave.
- Limpando o homogeneizador: Adicionar 25 ml de solução de limpeza (RBS) para 1 L de DEPCH2O tratada, e imergir o eixo 1 min com agitação. Incubar 2 horas a 60 ° C. Enxaguar abundantemente com DEPC tratados com H 2 O Enrole o instrumento em alumínio e colocar na caixa do instrumento. Embrulhe a caixa. Esterilizar em autoclave.
- A limpeza do dispositivo de electroforese: Lavar o aparelho, a bandeja e o pente de 15 poços. Incubar 15 minutos em 3% de peróxido de hidrogénio. Lavar uma vez com etanol a 100%. Ar seco.
- A limpeza dos pratos de vidro: Limpe os pratos de vidro RBS 2% durante toda a noite, em seguida, enxaguar com água destilada antes da esterilização a 200 ° C.
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Representative Results
O procedimento de revista (Figura 1) permite-nos recuperar amostras de retina do bloco cirúrgico para RNA purificado, e analisar o transcriptoma de descolamento de retina. Descolamento da retina resultados na regulação positiva do gene quimiotática de monócitos MCP1 CCL2, e na diminuição da expressão do gene da haste de fotorreceptores transdução GNAT1, o cone de ondas curtas opsina OPN1SW eo homeogene CRX (Figura 2). A indução de CCL2 é resultante da inflamação 9, enquanto que a redução concomitante do GNAT1, OPN1SW e CRX é o resultado de degeneração de fotorreceptores, ambos os bastonetes e cones. A perda de cones pode resultar da perda de expressão de NXNL1, que codifica para um factor rod-cone derivada Viabilidade 7,10, ou o seu RdCVF2 parálogo, que é codificada pelo gene NXNL2. Surpreendentemente, o NXNL2 mensageiro existas em duas versões diferentes. A versão 1 (NM_001161625.1) é uma sequência de codificação derivadas da análise filogenética, mas não foi previamente relatado para ser expresso 11, enquanto que a versão 2 (NM_145283.2), para o qual tenha sido identificado vários ESTs é um ARNm anormal que exclui o segundo exão do gene e contém um segundo exão alternativo, contendo uma sequência repetitiva Alu, localizado a mais de 40 kb na direcção 3 '(Figura 3a). Utilizando ARN purificados a partir da retina humana, podemos agora relatado que as duas versões do ARNm NXNL2 são expressos (Figura 3b).
Figura 1. Imagem da caixa de papelão contendo o material fornecido pela revista.
Figura 2. Representação da expressão de um subconjunto de genes que utilizam Retinobase. Para os genes mostrados nestes gráficos de radar, CCL2, GNAT1, OPN1SW CRX, e, no lado direito da figura corresponde ao ARN a partir de amostras de descolamentos de retina (RD1-18), enquanto a parte esquerda (NR1-18) são RNA controles de idade comparável preparados com retinas post-mortem. O método gráfico radar está descrito no ponto 8.
Figura 3. Expressão das duas versão do gene NXNL2 na retina. uma representação. esquemático do gene NXNL2 no cromossoma 9. NXNL2v1 possui dois exões, que estão previstos por alinhamento múltiplo e análise filogenética. NXNL2v2 está ausente segundo exão e que inclui uma alternativa exão 2 ', localizado> 40 kb na direcção 3'. Tele setas indicam a posição do iniciador utilizado. b. de RT-PCR que mostra a expressão de ambos NXNL2v1 NXNL2v2 e na retina. As faixas da direita correspondem a reacção na ausência de transcriptase inversa. ACTB, actina citoplasmática. Iniciadores utilizados: NXNL2v1: 5'-GCATGAGCTGAGGAAGAGGT-3 ', 5'-CTCA AACGGAGAAATTCTGGA-3', 5'-NXNLv2: TCTGCACCCCCACGTTTATT-3 ', 5'-AGGGCCTCCT TTTCCATCTA-3'.
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Discussion
O desenvolvimento de um processo para a recuperação do tecido a partir do bloco cirúrgico tem sido essencial para a análise do transcriptoma de descolamento da retina. Deve-se notar que este tipo de cirurgia é praticada em situações de emergência e que o oftalmologista operacional têm pouco tempo para participar de um programa de pesquisa biológica quando operam. Este é também realizada retinectomy estocasticamente em cada serviço, de modo que a maneira mais fácil de atingir números estatísticos é trabalhar com uma rede. Em tal rede, a normalização da recolha de tecidos é essencial do sucesso da análise biológica. Ao fornecer um material, muito fácil de usar e instruções precisas, que podem ser armazenadas à temperatura ambiente num armário de cirurgia, fim para o bloco cirúrgico, os cirurgiões têm estimulado a participar neste estudo.
Além disso, a normalização da purificação do RNA foi realizada para obter o melhor destes precioso clespécimes inical. As colecções de RNAs puros podem ser armazenadas durante anos a -80 ° C e seria usado para estudos adicionais como novas tecnologias genómicas emergir. O protocolo é fornecido para material cirúrgico de retina, mas também pode ser utilizado com êxito para isolar RNA a partir de roedor retina após a dissecação. Se o ARN são degradadas, a) verificar o pH da solução de CsCl / EDTA. b) fazer todas as soluções de produtos químicos não utilizados. A principal limitação da técnica é a quantidade de material de partida o qual deve corresponder a pelo menos 50.000 células.
O que distingue o método aqui utilizado na maioria dos reagentes comerciais previstas para isolar o RNA total é o grau de pureza. RNA está descarregada de qualquer contaminação de DNA que elimina a necessidade de usar o tratamento DNAse que pode ser prejudicial a qualquer outro procedimento. Além disso, as preparações de ARN totais são aqui empobrecido em ARNt, que são conhecidos por serem inibidores potentes de ARN-polimerases que são comumente utilizados nao passo de amplificação antes de hibridação com chips de microarray. Observou-se que as sondas sintetizadas a partir destas preparações de RNA tem uma actividade específica muito elevada. O grau de pureza do RNA preparado seguindo o método aqui descrito é muito bem adequado para a hibridação de microarray, mas também para a construção de bibliotecas de cDNA de alta qualidade e de sequenciação de ARN como já observado. O laboratório deve ser RNAse livre. O pH da CsCl / EDTA deve ser ácido para evitar a degradação do ARN através de lise alcalina. A densidade de CsCl / EDTA devem ser cuidadosamente verificados, a fim de não ser demasiado elevada e para impedir a sedimentação de ARN.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Sacha Reichman e Dominique Santiard-Baron pela ajuda na edição do protocolo de purificação RNA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
References
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