Radical basé sur la chimie biomimétique a été appliquée à la construction-up bibliothèques nécessaires pour le développement de biomarqueurs.
L'implication des radicaux libres dans les sciences de la vie n'a cessé d'augmenter avec le temps et a été relié à plusieurs processus physiologiques et pathologiques. Ce sujet englobe divers domaines scientifiques, allant de physique, de chimie biologique et bio-organique de la biologie et de la médecine, avec des applications à l'amélioration de la qualité de vie, la santé et le vieillissement. Compétences multidisciplinaires sont nécessaires pour une enquête complète sur les nombreuses facettes de processus radicaux dans l'environnement biologique et chimique des connaissances joue un rôle crucial dans les processus de dévoilement de base et les mécanismes. Nous avons développé une approche de biologie chimique capable de se connecter sans réactivité chimique radicale des processus biologiques, fournissant des informations sur les voies mécanistiques et des produits. Le cœur de cette approche est la conception de modèles biomimétiques pour étudier le comportement des biomolécules (lipides, les acides nucléiques et les protéines) dans les systèmes aqueux, l'obtention d'un aperçu de la réaction de voies ainsi unes la construction des bibliothèques moléculaires des produits de réaction du radical libre. Ce contexte peut être utilisé avec succès pour la découverte de biomarqueurs et des exemples sont fournis avec deux classes de composés: les mono-trans isomères d'esters de cholestérol, qui sont synthétisés et utilisés comme références pour la détection dans le plasma humain, et purines en 5 ',8-cyclo-2 '-désoxyribonucléosides, préparé et utilisé comme référence dans le protocole pour la détection de ces lésions dans des échantillons d'ADN, après radiations ionisantes ou obtenus à partir de différents problèmes de santé.
La réactivité des radicaux libres a révélé son énorme importance pour de nombreux événements biologiques, y compris le vieillissement et l'inflammation. De nos jours, il est de plus en plus évident que la clarification de chaque étape chimique impliquée dans cette réactivité est nécessaire, afin de comprendre les mécanismes sous-jacents et des stratégies efficaces pour envisager le contrôle des radicaux libres et de réparation des dommages. La contribution des études chimiques est fondamental, mais l'étude directe dans le milieu biologique peut être difficile, car la superposition des différents processus complique et perturbe l'examen des résultats et des conclusions connexes. Par conséquent, la stratégie de la modélisation des réactions radicalaires dans des conditions biologiquement voisines est devenu une étape fondamentale dans la recherche de mécanismes chimiques en biologie.
Dans la dernière décennie, notre groupe a développé des modèles de procédés radicalaires dans des conditions biomimétiques. En particulier, nous FRvisaged transformations biologiquement pertinentes d'acides gras insaturés, les nucléosides, et du soufre contenant des acides aminés et les mettre dans la bonne voie pour être évalué et validé en tant que biomarqueurs de l'état de santé 1-4.
Notre approche générale se compose de trois modules:
Nous avons choisi deux classes de biomarqueurs pertinents pour accréditer cette approche: les esters de cholestérol et de purines en 5 ',8-cyclo-2'-désoxyribonucléosides.
La conversion d'origine naturelle d'acides gras insaturés cis à trans isomères géométrique est une transformation liée à la production de stress radicalaire dans le milieu biologique. Lipides des membranes cellulaires, qui contiennent des acides gras, sont une cible biologique pertinent pour le stress radicale et nous avons d'abord étudié le endogène isomérisation cis-trans phospholipides dans les cultures cellulaires, les animaux et les humains évaluation des protocoles d'analyse dans chaque cas 8-10. Nous avons démontré que cette transformation peut se faire par divers composés contenant S, y compris les thiols, les thioéthers et les disulfures, qui, sous différentes conditions de stress radicalaire capables de générer des radicaux, c'est-à thiyles l'agent d'isomérisation (figure 3). L'exemple présenté dans cet article se concentre sur la classe des esters de cholestérol, ce qui représente une fraction bien connue des lipides plasmatiques, strictement impliquée dans le métabolisme des lipoprotéines. La liaison ester entre les acides gras et les cholestérol est synthétisée par le transfert des acides gras à partir de la position 2 du fragment de glycérol phosphatidylcholine et le cholestérol, une étape catalysée par la lécithine cholestérol acyl enzyme transférase (LCAT). Par conséquent, les taux plasmatiques esters de cholestérol sont strictement liés au chiffre d'affaires lipidique de la membrane, et contiennent des proportions relativement élevées d'acides gras polyinsaturés (AGPI) habituellement présents dans les phosphatidylcholines, linoléique et les acides arachidonique dire. Formation des lipoprotéines est impliqué dans les maladies cardiovasculaires et métaboliques. La réactivité des esters de cholestérol naturelles avec les radicaux libres peuvent se produire au niveau des doubles liaisons de linoléate et les résidus arachidonate, qui peuvent être transformés en les trans correspondants isomères géométriques (voir la figure 1 pour les structures). Caractérisation de la teneur en esters de cholestérol trans dans des échantillons biologiques est intéressante pour le développement de biomarqueurs. Une méthode indirecte consiste en la transformation de cholesteryl esters isolé du plasma des correspondants esters méthyliques d'acides gras (FAME) et la séparation par chromatographie en phase gazeuse protocoles. Dans ce cas, la calibration des références normalisées de cis et trans esters méthyliques d'acides gras est effectuée, afin de permettre la quantification de la teneur en trans dans les échantillons. Sur la base des études analytiques réalisées sur la bibliothèque des esters de cholestérol, nous avons proposé d'appliquer également une méthode basée sur la spectroscopie Raman, qui peut être effectué directement sur la fraction des esters de cholestérol isolé du plasma, sans dérivatisation à la suite de la FAME correspondant (voir les figures 2 et 9). Il est à noter que jusqu'à présent, aucune des méthodes efficaces sont décrits en cis et trans isomères séparés des acides gras contenant des lipides par HPLC, comme décrit par lieu hydroperoxydes d'ester de cholestérol. Jusqu'à présent, la méthode indirecte de gaz chromatographique est encore la meilleure méthode disponible à ce jour. Par cette méthode, la première quantitative évaation de la teneur en mono-trans dérivé d'esters de cholestérol, isolé à partir de plasma de sujets sains a été communiquée. Utilisation détecteur à ionisation de flamme (FID) la limite de détectabilité est satisfaisante (ppb) et les quantités nanomolaires des composés ont été détectés. 5. Avec différents systèmes de détection de cette limite peut être abaissée encore. L'effet des rayonnements ionisants sur la matière esters de cholestérol est d'autres études, que ce soit une réponse linéaire est obtenu par rapport à la dose appliquée.
Comme second exemple, nous avons choisi nucléosides modifiés qui peuvent être produites par les dommages des radicaux libres de l'ADN. Les radicaux hydroxyles (HO •) sont connus pour être les espèces les plus nuisibles réactives de l'oxygène (ROS) pour leur capacité à provoquer des modifications chimiques de l'ADN. Lésions uniques ou multiples peuvent se produire sur l'ADN, que dans les cellules eucaryotes est situé dans le noyau et les mitochondries. L'identification et la mesure des principales classes d'oxydation des dommages à l'ADN générées nécessitent appropriate bibliothèques moléculaires dans le but de mettre en place les protocoles d'analyse. Nous avons concentré notre intérêt sur les lésions les plus petites en tandem, qui sont purine 5 ',8-cyclo-2'-désoxyribonucléosides, ayant une liaison covalente supplémentaire entre la base et les fragments de sucre créés par l'attaque des radicaux libres. Les composés sont des 5 ',8-cyclo-2'-désoxyadénosine et 5 ',8-cyclo-2'-désoxyguanosine qui sont dans les 5'R et 5'S formes diastéréoisomères (Figure 5). Leur potentiel à devenir libre marqueur de stress radicalaire est question de la recherche fondamentale. 2 En effet, lorsque l'ADN est exposé à HO • abstraction radical hydrogène à partir de la position C5 'du sucre est l'un des événements possibles conduisant à la formation de ces lésions tandem. Purine 5 ',8-cyclonucleosides peut être mesuré comme la somme des diastéréoisomères par CLHP-SM/SM à une digestion enzymatique des échantillons d'ADN γ-irradiés variables de 1 à 12 lésions / 10 6 / Gy nucléosides va absence forme d'oxygène au niveau physiologique de l'oxygène Jetissus n, le rapport diastéréoisomérique 5'R / 5'S étant ~ 4 et ~ 3 pour 5 ',8-cdAdo et 5' ,8-cdGuo, respectivement (figure 11). 11 Il est intéressant de noter que la relation entre la dose de rayonnement et 5 ',8-cdAdo et 5' ,8-cdAdo lésions détectées dans l'ADN cellulaire est loin d'être compris. L'expérience unique fondée sur l'irradiation 2kGy signalés dans le groupe expérimental ne peut pas être considérée comme concluante. 11 D'autres expériences de ce genre et la quantification analytique des quatre lésions sont nécessaires pour définir une telle relation. La détection de ces lésions et les transformations les plus populaires oxydants (comme la 8-oxo-2'-désoxyguanosine, 8-oxodGuo) sont des matières de recherches intenses, mettant en évidence l'importance des deux lésions au cours du métabolisme oxydatif. 6,13 L'utilisation de HPLC -MS/MS (triple quadripôle) a une limite de détection proche de 30fmol pour les quatre lésions. Dernières améliorations sont demandées pour atteindre des limites de détection de niveaux attomol par le produ instrumentteurs. Sur la base de la littérature très récente, 6 procédures analytiques doivent inclure le nettoyage approprié de l'échantillon et d'enrichissement afin de respecter les limites de détection de la MS / MS / MS (piège à ions) ou de la MS / MS (triple quadripôle) utilisée dans notre cas.
Bio-inspirés des procédés de synthèse de composés 1-4 ont été développés à partir de 8-bromopurine dérivés dans ou photolyse. 7,12 Ces procédures impliquent une réaction en cascade radicale qui imite le mécanisme de dommages à l'ADN de formation de 5 ',8-cdAdo et 5' ,8-cdGuo lésions. Du point de vue biologique, il a été constaté que ces lésions s'accumulent avec l'âge de façon tissu-spécifique (foie> rein cerveau>), ce qui prouve que les mécanismes de réparation de l'ADN sont insuffisantes pour préserver le matériel génétique de ces lésions. 13 En effet, la réparation par excision de nucléotides (TNS) est la seule voie actuellement identifiées pour la réparation de ces lésions. 2
Le cours de deuxes par les composés montrés dans les figures 1 et 5 ne sont pas disponibles dans le commerce pour le moment, mais par les stratégies de synthèse décrites dans la littérature, il ne serait pas difficile de préparer ces composés à des fins commerciales.
L'approche multidisciplinaire fournie par des études de biologie chimique a non seulement une valeur énorme à l'identification de nouveaux mécanismes qui se produisent dans l'environnement biologique, mais donne aussi une contribution fondamentale à la découverte de biomarqueurs et des diagnostics, en fin de compte apporter la nouveauté dans les soins de santé et les stratégies de prévention. 14 L' contribution chimique est nécessaire pour un développement réussi de la médecine moléculaire, la création de plates-formes intégrées et panneaux pour le profilage métabolique qui devraient permettre une rationalisation optimale de conception de l'intervention, soit thérapeutique et nutritionnel, de réduire les incertitudes et les échecs quand ils ne peuvent être prévisibles.
The authors have nothing to disclose.
Le soutien financier du Ministero dell'Istruzione, dell'Universita della Ricerca (PRIN-2009K3RH7N_002) et Marie Curie Intra-European Fellowship (CYCLOGUO-298555), ainsi que le parrainage de l'Action COST CM0603 sur les «radicaux libres en biologie chimique et de l'Action COST CM1201 sur "Chimie biomimétique Radical" sont chaleureusement remerciés.
MATERIALS | |||
Cholesteryl linoleate ≥98% | Sigma-Aldrich | C0289-100 mg | |
Cholesteryl arachidonate≥95% | Sigma-Aldrich | C8753-25mg | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100 ml | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | |
Methanol 215 SpS | Romil | H409-2,5 L | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
Chloroform SpS | Romil | H135 2,5 L | |
n-Hexane 95% SpS | Romil | H389 2,5 L | |
Acetonitrile 230 SpS | Romil | H047 2,5 L | |
Dichloromethane SpS | Romil | H2022,5 L | |
Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 107344-1L | |
Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966-1L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
NaOH solid | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
NH4OH sol. 28%-30% | Sigma-Aldrich | 221228-1L-A | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | |
Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride | Sigma-Aldrich | 221759-100G | |
Ammonium Molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302-100G | |
Sulfuric Acid 95%-98% | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | 209139-25G | |
Sodium sulfate anhydrous | Sigma-Aldrich | 238597-500G | |
Nuclease P-I from penicillium citrinum | Sigma-Aldrich | N8630-1VL | |
Phosphodiesterase II type I-sa | Sigma-Aldrich | P9041-10UN | |
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc | Sigma-Aldrich | E114-25MG | |
Phosphatase alkaline type VII-t from*bov | Sigma-Aldrich | P6774-1KU | |
Phosphodiesterase I type VI | Sigma-Aldrich | P3134-100MG | |
Deoxyribonuclease II type IV from*porcin | Sigma-Aldrich | D4138-20KU | |
Trizma(r) base, biotechnology performanc ce | Sigma-Aldrich | T6066-100G | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644-100G | |
Succinic acid bioxtra | Sigma-Aldrich | S3674-250G | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670-100G | |
Formic acid, 98 % | Sigma-Aldrich | 06440-100ML | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Millipore | UFC500324 | |
8-Bromo-2′-deoxyguanosine | Berry & Associates | PR3290-1 g | |
8-Bromo-2′-deoxyadenosine | Berry & Associates | PR3300-1 g | |
Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
2′-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3899-CA-0.1 | |
2′-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3895-0.1 | |
Nitrous oxide (N2O) | Air Liquide | ||
Deoxyribonucleic acid from calf thymus | Sigma Aldrich | D4522-5MG | |
EQUIPMENT | |||
60Co-Gammacell | AECL- Canada | 220 | |
Immersion well reaction medium pressure 125 watts | Photochemical reactors ltd | Model 3010 | |
Evaporating flask 250 ml | Heidolph | P/N NS 29/32 514-72000-00 | |
Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm | Phenomenex | 00A-4252-E0 | |
Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm | Grace | 88081 | Semipreparative |
SecurityGuard Kit | Phenomenex | KJ0-4282 | Analytical holder kit and accessories |
Holder for 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7220 | Semipreparative holder |
10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7221 | |
High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1100 | |
LC/MS/MS | Applied Biosystems | 4000QTRAP System | |
Tandem mass ESI spectrometer | (Bruker Daltonics) | Esquire 3000 plus | |
Vial 2-4 ml | SUPELCO | Cod 27516 | |
Vial 4 ml | SUPELCO | Cod 27517 |