Summary
وقد تم تطبيق الراديكالية القائمة على الكيمياء بيوميمتيك لبناء ما يصل المكتبات اللازمة لتطوير العلامات البيولوجية.
Abstract
وقد زاد تورط الجذور الحرة في علوم الحياة باستمرار مع مرور الوقت وتم توصيله عدة عمليات الفسيولوجية والمرضية. هذا الموضوع يشمل المجالات العلمية المتنوعة، والتي تمتد من الكيمياء الفيزيائية والبيولوجية وbioorganic لعلم الأحياء والطب، مع تطبيقات لتحسين حال نوعية الحياة والصحة والشيخوخة. مهارات متعددة التخصصات المطلوبة لتحقيق كامل في العديد من جوانب عمليات جذرية في البيئة البيولوجية والكيميائية المعرفة يلعب دورا حاسما في الكشف عن العمليات الأساسية والآليات. وضعنا نهجا البيولوجيا الكيميائية قادرا على الاتصال مجانا التفاعلات الكيميائية جذرية مع العمليات البيولوجية، وتوفير معلومات عن مسارات الآلي والمنتجات. جوهر هذا النهج هو تصميم نماذج لدراسة السلوك بيوميمتيك جزيء حيوي (الدهون والأحماض النووية والبروتينات) في النظم المائية، والحصول على رد فعل من رؤى وكذلك مسارات لق بناء المكتبات الجزيئي للمنتجات التفاعل الجذور الحرة. يمكن هذا السياق استخدمت بنجاح لاكتشاف العلامات البيولوجية وترد أمثلة مع فئتين من المركبات: أحادية غير المشبعة الايزومرات من استرات الكوليسترول، وقد تم تجميعها واستخدامها كمراجع للكشف في البلازما البشرية، والبيورين 5 '،8-2-سيكلو '-deoxyribonucleosides، أعدت وتستخدم كمرجع في البروتوكول للكشف عن الآفات من هذا القبيل في عينات من الحمض النووي، بعد الإشعاعات المؤينة أو تم الحصول عليها من ظروف صحية مختلفة.
Introduction
كشفت تفاعل الجذور الحرة أهميتها الهائلة للأحداث البيولوجية كثيرة، بما في ذلك الشيخوخة والالتهابات. في الوقت الحاضر، وهو أكثر وأكثر وضوحا أن هناك حاجة لتوضيح كل خطوة الكيميائية المشاركة في هذا التفاعل، من أجل فهم الآليات الكامنة واستراتيجيات فعالة تتوخى من أجل السيطرة على الجذور الحرة وإصلاح الضرر. مساهمة من الدراسات الكيميائية الأساسية، ولكن الدراسة مباشرة في البيئة البيولوجية يمكن أن يكون صعبا، لأن استعلاء من العمليات المختلفة ويعقد يشوش النظر في النتائج والاستنتاجات ذات الصلة. ولذلك، أصبحت استراتيجية النمذجة ردود فعل الجذور الحرة ذات الصلة في ظل ظروف بيولوجيا خطوة أساسية في البحث من الآليات الكيميائية في علم الأحياء.
في العقد الأخير نموا مجموعتنا نماذج العمليات الجذور الحرة في ظل ظروف بيوميمتيك. ولا سيما أننا أونvisaged التحولات ذات الصلة بيولوجيا من الأحماض الدهنية غير المشبعة، النيوكليوسيدات، والكبريت التي تحتوي على الأحماض الأمينية ووضعها في المسار الصحيح ليتم تقييمها والتحقق من صحة والمؤشرات الحيوية للحالة الصحية. 1-4
نهجنا العام يتكون من ثلاث وحدات:
- العضوية التوليف، الذي يوفر الوصول إلى الجزيئات الحيوية تعديل مناسب. ويمكن تصميم خطة الاصطناعية أيضا من أجل محاكاة العمليات الحرة الراديكالية التي تحدث في البيئة البيولوجية، وتطبيق الشروط وبالتالي قادرة على محاكاة عملية بيولوجية من الفائدة، والذي هو مبدأ الكيمياء جذرية بيوميمتيك. في نماذج بيوميمتيك وسط التفاعل هو الماء أو وسيلة غير متجانسة نظرا لتعايش حجرات المائية وغير المائية. ميزة للعمل مع النماذج بيوميمتيك هو أن تكون هناك بيئة مبسطة مع الشركاء رد فعل المعروف، حيث يمكن فحص تفاعل والمنتجات في مزيد من التفاصيل، ربما اكتشافمسارات الرواية الكيميائية. من هذه الخطوة يمكن أن تجمع المعلومات والآلية الحركية؛
- تنقية وتحليل وتوصيف المنتجات، وتوفير المعلومات الهيكلية والكيميائية للتعديل الجزيئات الحيوية من أجل تنظيم المكتبات الجزيئية وتسهيل recognition.in البيئة البيولوجية أكثر تعقيدا. وضعت البروتوكولات أيضا في ضوء حل مزيجا معقدا من المركبات مثل تلك المستمدة من العينات البيولوجية؛
- العلامات البيولوجية باستخدام التنمية العينات البيولوجية، والمستمدة إما عن طريق التجارب في المختبر باستخدام مزارع الخلايا، والدراسات المجراة من الحيوانات والبشر. ثم يتم تطبيق البروتوكولات وضعت في نماذج بيوميمتيك لتحليل العينات المعقدة، تصور التحولات الراديكالية الحرة في ظل ظروف مختلفة. المكتبات الجزيئية المتقدمة عن طريق التخليق هي من مساعدة كبيرة لاكتشافات علوم الحياة. جمع معلومات عن GIV التحولات الراديكالية الحرةه الفرصة لمعرفة الإصلاح والوقاية الاستراتيجيات. ويمكن استخدام قواعد البيانات من نتائج تقييم دقيق من قبل التحليل متعدد المتغيرات لأهمية العلامات البيولوجية وكذلك العوامل المرتبطة ممكن.
اخترنا فئتين من المؤشرات الحيوية ذات الصلة لاعتماد هذا النهج: استرات الكوليسترول والبيورين 5 '،8-سيكلو-2'-deoxyribonucleosides.
Protocol
1. توليف أحادي عبر الايزومرات من استرات الكوليسترول
- حل استرات الكوليسترول (ينولييت أو arachidonate استر الكوليسترول) في بروبانول-2 (15 مم). لرؤية أفضل الانحلالية، والعينات sonicated لمدة 15 دقيقة تحت الأرجون.
- الحل لنقل مفاعل الضوئية الكوارتز، إضافة 2-المركابتويثانول في بروبانول-2 (لتصل إلى 7 ملم التركيز، من الأسهم الحل 2 M من ثيول). تدفق خليط التفاعل مع الأرجون لمدة 20 دقيقة من أجل القضاء على وجود الأكسجين في الحل.
- أشرق خليط التفاعل من ضوء الأشعة فوق البنفسجية باستخدام 5.5W مصباح الزئبق الضغط المنخفض عند 22 ± 2 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. رصد بواسطة حج التحليلية-TLC (فضية رقيقة اللوني طبقة) على الأدلة تشكيل استرات الكوليسترول أحادية غير المشبعة (انظر الشكل 1 لالصيغ الكيميائية). ويتم تلطيخ TLC بها تتدفق لوحة في حل الأمونيوم السيريوم (CAM) molibdate، والبقع تظهر على التدفئةاللوحة. إخماد رد فعل في مرحلة مبكرة، من أجل استرداد المواد البداية، التي يمكن إعادة استخدامها لأداء جولات أخرى من ايزوميرة، والحصول على زيادة في العائد الكلي.
- جمع خليط التفاعل في قارورة مستديرة القاع، وغسل الجهاز مع قليل من مل بروبانول-2. إزالة المذيبات وتنقية أيزومرات أحادية غير المشبعة من استرات الكوليسترول بواسطة حج-TLC كما هو موضح في الأدب. 5 استخدام الهكسان-اثيل الأثير (09:01 ت / ت) كما شاطف لأحادية غير المشبعة أيزومرات ينولييت الكوليسترول، في حين أن استخدام الهكسان اثيل الأثير، وحمض الخل (9:1:0،1 ت / ت) لأحادية غير المشبعة أيزومرات arachidonate الكوليسترول.
2. كسر عزلة استرات الكوليسترول من مصل الإنسان
- تمييع 1 مل من مصل الإنسان (التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي للدم) مع 1 مل من محلول ملحي وتصب الحل في قمع separatory تحت تيار من الأرجون وذلك لتجنب الآثار (adducts الأكسدة على سبيل المثال). إضافة 10 مل كلوروفورم الميثانول (2: 1 ت / ت) ثلاث مرات. يهز قمع separatory ببطء شديد وذلك للحد من تشكيل مستحلب بسبب وجود الزلال.
- غسل الطبقات العضوية مرة واحدة مع محلول ملحي (10 مل)، ثم جمع في دورق مخروطي سعة التدفق تحت الأرجون وجافة أكثر من كبريتات الصوديوم اللامائية. إزالة المواد المتطايرة من المبخر الدوار على تحمل النفط الأصفر (المجموع جزء الدهون البلازما).
- تناول الخام مع 1 مل من الميثانول كلوروفورم (2:1 ت / ت)، تحميل الصعود إلى TLC إعدادي تحت تيار من الأرجون واستخدام خليط من الهكسان-اثيل الأثير (09:01 ت / ت) كما شاطف . كشط الجزء السيليكا التي تحتوي على نسبة الكوليسترول واستر تصب في قارورة. ثم، واستخراج السليكا (3 × 5 مل) مع الميثانول، الكلوروفورم (2:1 ت / ت)، جمع وإزالة الطبقات العضوية المذيب تبخر بعد على تحمل جزء من استرات الكوليسترول النقي (عادة ~ 1.5 ملغ).
- الحفاظ على استرات الكوليسترول في قارورة مظلمة يغطيها رقائق الألومنيوم تحت الأرجون وتخزينها في -20 درجة C. الكوليسترول هsters حساسة للضوء والأكسجين.
3. توصيف أحادي عبر استرات الكوليسترول عن طريق التحليل الطيفي رامان
- استخراج استرات الكوليسترول في الدم من الإنسان (≥ 0،7 ملغ) كما هو موضح في القسم 2، تذوب في كمية صغيرة من رابع كلوريد الكربون (≤ 10 ميكرولتر) ووضعت في قارورة. تم تحديد لجنة علم المناخ 4 كما المذيب بسبب اشارة رامان لا تتداخل مع المنطقة من مصلحة تحليل استر الكوليسترول.
- نقل الحل لصاحب العينة من خلال ماصة الزجاج القابل للتصرف، ثم إزالة بعناية المذيب بواسطة تيار بطيء من الأرجون. بمجرد تشكيل فيلم موحدة الزيتية على الجدار الداخلي للحامل العينة، ضع الأخيرة في الصك للقياس.
- تحولت فورييه والحصول عليها مباشرة من الطيف رامان استرات الكوليسترول على مقتطفات الدهون من دون أي رد فعل الاشتقاق. قوة الليزر على العينة <100 ميغاواط لتجنب الضرر العينة. العدد الإجمالي للعمليات التفحصلكل الطيف هو ≥ 800 إلى التقليل من الضوضاء في الخلفية.
- ويتم تحليل نطاق الطول 1،700-1،630 -1 من الطيف رامان لأنه يعكس مساهمة من السندات C C = المزدوجة موجودة في جزيء (C = C تمتد اسطة). يتم تنفيذ تحليل منحنى المناسب على هذه المنطقة، مما يسمح للالمميزة للمساهمات فرضه من رابطة الدول المستقلة وروابط ثنائية غير المشبعة في سلسلة ألكيل الدهنية والرابطة المزدوجة في حلقة من الكولسترول B (انظر الشكل 2).
- لتناسب بشكل صحيح نطاقات الذبذبات، ينبغي أن تكون ثابتة أو مقيدة بعض المعلمات ضمن حدود معقولة. ويرد وصف لمحات الذروة عنصر ومزيج من خطي Lorentzian وظائف جاوس، في حين يتم تحديد أفضل عرض نطاق ترددي نصف الطول من قبل الكمبيوتر الروتينية التحسين. ويتم الحصول على عدد والموقف من قمم مكون باستخدام أطياف 4 مشتقة، والتي تسمح أيضا للكشف عن بعض العصابات عنصرا ضعيفا. منذ إشارةإلى نسبة الضوضاء الذي يتردى على التفريق بين الإشارة يمكن أن يحول دون استخدام المشتقة الرابعة، ممهدة المشتقات الرابع مع وظيفة Savitsky-غولي ثلاثة عشر نقطة، هي الميزة، وبالتالي، يتم الحصول على حل وسط بين الحق والقرار إشارة إلى نسبة الضوضاء . ويتم الحصول على أفضل منحنى المناسب عند أدنى القيم الممكنة 2 ج.
- وكشفت وجود ايزومرات عبر من قبل مكون في 1671 ± 1 سم -1، بالإضافة إلى، على الأقل، العنصرين، تحولت قليلا نحو ترددات منخفضة نسبيا، ويرجع ذلك إلى سلسلة الأحماض الدهنية والكوليسترول C = C روابط مزدوجة. ويظهر الطيف رامان ممثل البلازما الكوليسترول استر في الشكل 9. أقحم في المقارنة يظهر من منطقة محددة مع ينولييت الكوليسترول وأحادية غير المشبعة حمض اللينوليك أيزومرات الكوليسترول.
4. الاشتقاق لالدهنية استرات الميثيل الحمضية (FAME) وتحليل بواسطة جهاز الكروماتوجرافي الغازي
- حلاسترات الكوليسترول (~ 1.5 ملغ) مع 0.5 مل من محلول M 1 من هيدروكسيد الصوديوم في الميثانول البنزين (2:3 ت / ت) ووضعت في قارورة مظلمة يغطيها رقائق الألومنيوم تحت الأرجون.
- ترك الخليط مع التحريك في درجة حرارة الغرفة ورصد من قبل TLC باستخدام مزيج من الهكسان-اثيل الأثير (09:01 ت / ت) كما شاطف. وقت رد الفعل هو عادة 30 دقيقة ولكن لا بد من رصد رد فعل حذرا. في الواقع، عندما يتم تشكيل استرات الميثيل المقابلة، يجب أن تطفئ رد فعل من أجل تجنب تكون نواتج التحلل والجانبية. وأظهرت TLC الكمي لتشكيل استرات الميثيل.
- إخماد خليط التفاعل بإضافة 1 مل من محلول ملحي واستخراج استرات الميثيل مع N-الهكسان (3 × 2 مل). جمع الطبقات العضوية إلى قارورة وإزالة المذيب عن طريق التبخر دوارة على تحمل جزء استر الميثيل، والذي يستخدم بعد ذلك لتحليل GC دون المزيد من التنقية.
- حل استرات الميثيل في الحد الأدنى من N-الهكسان (عادة 1 ملغ في 50 ميكرولتر) وحقن في GC مجهزة 60 م × 0.25 ملم × 0.25 ميكرومتر (50٪ cyanopropyl-)-methylpolysiloxane العمود. استخدام جهاز كشف اللهب التأين (FID) مع برنامج فرن التالية: بدء درجات الحرارة نحو 165 درجة مئوية، عقد لمدة 3 دقائق، تليها زيادة بنسبة 1 ° C / دقيقة تصل إلى 195 ° C، وعقد لمدة 40 دقيقة، تليها ثانية بزيادة قدرها 10 ° C / دقيقة تصل إلى 240 درجة مئوية، مع الاستمرار لمدة 10 دقيقة. يتم اختيار A وضع ضغط مستمر (29 رطل). ويمكن استخدام الهيليوم أو الهيدروجين والغاز الناقل. يتم تحديد استرات الميثيل بالمقارنة مع الزمن الاحتفاظ عينات أصلية. الشكل 10 يظهر تحليل GC ممثل من الشهرة استرات الكوليسترول تم الحصول عليها من البلازما.
5. توليف (5'R) - و (5'S) -5 "،8-سيكلو-2 '-deoxyadenosine
- حل 33 ملغم من 8-برومو-deoxyadenosine 2'(8-BR-دادو) في الأسيتونيتريل (100 مل) من أجل تركيز يصل إلى 1 ملم. تنظيم تدفق الغاز (سورة أو N2) في photoreactor وملء اباratus مع حل 8-BR-دادو.
- إعداد الحاجز مع الحجم المناسب لإدخال photoreactor وتمرير إبرة متصلة خط غاز خامل من خلال مركز عليه. إغلاق النظام مع الحاجز. تدفق غاز خامل لمدة 30 دقيقة.
- أشرق من ضوء الأشعة فوق البنفسجية باستخدام 125W مصباح الزئبق ذات الضغط المتوسط في 22 ± 2 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وجمع الحل في قارورة 250 مل جولة القاع. غسل photoreactor مع الأسيتونيتريل 10 مل وجمع الغسيل في نفس القارورة.
- إخماد خليط التفاعل مع الخام 1 حل M NH OH 4 و تتبخر المذيب في المبخر الدوار.
- تشغيل عالية الأداء التحليل الكروماتوغرافي السائل (HPLC-UV) مع العمود التحليلي (انظر القسم الأجهزة) في ظل الظروف المعروفة، ومقارنة مع المركبات الملف الشخصي المرجعية.
- تشغيل عالية الكروماتوغرافي السائل تحليل الأداء (HPLC-UV) مع عمود التحليلية (انظر القسم الأجهزة) باستخدام سول التاليةالمخارج والتدرجات: 2 فورمات الأمونيوم ملم والمذيبات والأسيتونيتريل A B. كما المذيبات تعيين معدل التدفق إلى 1 مل / دقيقة والتدرج من المذيبات B 0٪ إلى 0.3٪ B المذيبات التي سيتم التوصل إليها في 2.2 دقيقة. B ثم المذيبات 0.8٪ في 4.0 دقيقة في، B ثم المذيبات 1٪ في 4.8 دقيقة. البقاء في المذيبات B 1٪ لمدة 9 دقائق و من ثم اذهب إلى B المذيبات 8٪ في 6 دقائق. بعد الذهاب الى B المذيبات 10٪ في 4 دقائق وB المذيبات 30٪ في 5 دقائق وتبقى في المذيبات ب 30٪ لل5 دقائق أخرى. جمع القمم الكروماتوغرافي الموافق اثنين من المنتجات diastereomeric في اثنين قوارير مختلفة.
- قياس الامتصاصية للكسور 2 جمعها في طيفي الأشعة فوق البنفسجية وحساب التركيز المضبوط على أساس القانون لامبرت، البيرة (A = εlC، حيث A هي الامتصاص، ε معامل الانقراض وL طول الخلية). استخدام معامل ε انقراض deoxyadenosine-2'(دادو) (15400 M -1 سم -1 عند 260 نانومتر).
6. توليف (5'R) - وهود (5'S) -5 "،8-سيكلو-2 '-deoxyguanosine
- حل 35 ملغ من 8-برومو-deoxyguanosine 2'(8-BR-dGuo) و 30 ملغ من الصوديوم يوديد (NAI) في الماء المقطر (100 مل) من أجل الوصول إلى 1MM و2MM تركيز على التوالي. تنظيم خاملة الغاز (سورة أو N 2) تدفق متصلة photoreactor وملء photoreactor مع محلول التفاعل.
- Degass خليط التفاعل كما هو موضح في الإجراء 5 (الخطوة ب).
- أشرق من ضوء الأشعة فوق البنفسجية باستخدام 125W مصباح الزئبق ذات الضغط المتوسط في 22 ± 2 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وجمع الحل في قارورة 250 مل جولة القاع. غسل photoreactor مع 10 مل من الماء وجمع الغسيل في نفس القارورة.
- إخماد خليط التفاعل مع الخام 1 حل M NH OH 4 و تتبخر المذيب تحت الفراغ.
- لتحليل كما هو موضح في الإجراء 5 (ه خطوات لز). استخدام معامل ε انقراض deoxyguanosine-2'(dGuo) (11700 M -1 سم -1 عند 260 نانومتر).
7. توليف النظائر بيورين عليه (5'R) - و (5'S) -5 "،8-cyclonucleosides
- إعداد 2 مل من محلول مائي 1MM (الماء المقطر) من النيوكليوسيدات 15 N النظائر المسمى البيورين ([15N 5] دادو أو [15N 5] dGuo) في قارورة زجاج (4 مل) مع غطاء الحاجز.
- الاتصال القارورة مع غطاء الحاجز والاتصال خط الغاز (N 2 O لتشبع من الحل) من خلال إبرة في الحاجز الذي يصل إلى أسفل القارورة. آخر إبرة قصيرة في الحد الأقصى الحاجز يعمل خروج الغاز.
- مسح حل مع N 2 O لمدة 30 دقيقة. وينظم تدفق الغاز إلى أن تكون منخفضة للغاية.
- أخذ إبرة أولا الخروج من وبعد 1 'واحد طويل يلي، من أجل أن يكون لها الضغط داخل القارورة الصغيرة.
- وضع الحل في الجهاز عن الإنحلال الإشعاعي جاما ل8 (الحساب على أساس معدل جرعة كاليفورنيا. 4،5 غراي / دقيقة) ساعة.
- بعد إخماد رد فعل الخام مع NH M 1 4
- تشغيل عالية الأداء التحليل الكروماتوغرافي السائل (HPLC-UV) في ظل الظروف المعروفة و 6 و مقارنة مع كروماتوغرام المراجع القياسية.
8. الإنحلال الإشعاعي أشعة غاما من حلول DNA مائي
- إعداد 1 مل من 0.5 ملغ / مل حل (الماء المقطر) من الغدة الصعترية DNA العجل ووضع في قارورة زجاج (2 مل) مع غطاء الحاجز.
- Degass رد الفعل كما هو موضح في الإجراء 7 (خطوات دينار بحريني).
- وضع الحل في الجهاز عن الإنحلال الإشعاعي أشعة غاما لمدة 30 دقيقة (الحساب على أساس الجرعة / معدل كاليفورنيا. 4،5 غراي / دقيقة).
9. الأنزيمية الهضم من DNA
- إلى أنبوب إيبندورف تحتوي على 80 ميكروغرام من الحمض النووي، إضافة 8 U من P1 نوكلياز، 0.01 U الثاني فسفودايستراز، 20 نانومول من احنا في 20 ميكرولتر من 300 ملم خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.6) و 10 ملي كلوريد الزنك. احتضان الخليط في C ° 37 لمدة 48 ساعة.
- تالي إضافة خليط من 8 U من الفوسفاتيز القلوية، 0.02 U من phosphodiesterasه I، في 40 ميكرولتر من 0.5 العازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك M (الرقم الهيدروجيني 8.9) إلى خليط الهضم. وحضنت في العينة C ° 37 لمدة 2 ساعة.
- وتحييد خليط من حمض الفورميك إضافة 10٪.
- نقل العينة إلى جهاز الترا 0.5-Amicon تصفية الطرد المركزي (3 قطع كيلو دالتون)، أضف 200 ميكرولتر من 2 tridistilled O. H وضع الترا تصفية الطرد المركزي في الدوار في 14،000 XG لمدة 15 دقيقة. ثم فصل الجهاز الترا مرشح من أنبوب microcentrifuge. يجفد الحل انزيم خالية في أنبوب microcentrifuge.
10. DNA تحلية المياه عينة قبل التحليل
- تشغيل عالية الكروماتوغرافي السائل تحليل الأداء (HPLC-UV) مع العمود التحليلي (انظر القسم الأجهزة) بعد ظروف معروفة .. 6
- حل DNA مجفف بالتجميد هضمها في 20 ميكرولتر من H 2 O وحقن في HPLC-UV.
- جمع العينة في قارورة بعد شطف الملح (الدقائق الأولى) والحق قبل شطف تيم(ه) من نوكليوزيد الأول (5'R-cdGuo)، حتى نهاية البرنامج الكروماتوغرافي.
- ومجفف بالتجميد العينة وresolubilized في 20 ميكرولتر المياه.
11. LC-MS/MS التحليل الكمي
- إعداد HPLC-MS/MS (رباعي الثلاثي) قبل البدء في تحليل عن طريق تحميل المنهج التحليلي وأسلوب للكشف عن MS (ESI) 6
- إضافة 1 ميكرولتر من خليط النظائر المسمى المركبات في العينة أعد الداخلي 7.
- حقن 20 ميكرولتر من الحل ارتفعت DNA هضمها في الماء المقطر.
- ويرد تفصيل البيانات التي تم الحصول عليها الكروماتوغرافي على أساس المعايرة السابقة مع المركبات المرجعية. A HPLC ممثل تشغيل تحتوي يظهر الأدينوساين وغوانوزين 2'-deoxyribonucleosides والأكسدة ومشتقات سيكلو في الشكل 11.
Representative Results
وقد وصفت عملية ايزوميرة ولا سيما بالنسبة للاسترات الكوليسترول بتدبير أيزومرات أحادية غير المشبعة والأحماض اللينوليك من اراسيدونيك هو موضح في الشكل (1)، والمنتجات الأولى من هذا الهجوم، الذي يمكن أن يحدث في ظل ظروف الإجهاد الجذور الحرة في البيئة البيولوجية .. 5
في الشكل 3 يظهر آلية الكيميائية المشاركة في رابطة الدول المستقلة ايزوميرة العابر الرابطة المزدوجة. وأشار المصدر جذري بطريقة عامة على تحمل S محورها المتطرفين. في البروتوكولات ووصف المصدر هو ضوء الأشعة فوق البنفسجية المتطرفة التي هي قادرة على كسر homolitically الحاضر السندات SH في RSH جزيء ثيول.
الشكل 4 يلخص بروتوكول الخطوات الثلاث لتركيب الطبقة الدهنية تعديل والكشف عنها في البلازما البشرية: تجميع يمثل بيوميمتيك عملية الجذور الحرة ويوفر أيضا إدخال واحد وعاء مناسب لgeometيتبع أيزومرات RICAL، دون أي تلوث من أيزومرات الموضعية عن طريق بروتوكولات تنقية والعزلة.
ويمكن تطبيق المنهجيات التحليلية للكشف عن العديد من حساسة عالية من المحتوى عبر أيزومر وتوصيف مكتبة أحادية غير المشبعة استر الكوليسترول. على وجه الخصوص، يمكن أن يتم رامان الطيفي بشكل مباشر على نسبة الكوليسترول استر دون الاشتقاق (انظر الشكل 2 والشكل 9).
الثاني البيورين المخاوف سبيل المثال 5 '،8-سيكلو-2'-deoxyribonucleosides، والتي هي آفات الحمض النووي الناجم عن هجوم الجذور الحرة إلى C5 موقف 'من السكر شاردة وتشكيل لاحقة من الرابطة التساهمية بين السكر والقاعدة الأنصاف. يمكن أن تنتج أربعة هياكل، وهذا هو، 5 '،8-سيكلو-2'، وdeoxyadenosine 5 '،8-سيكلو-2'-deoxyguanosine، سواء الموجودة في أشكال 5'R و 5'S diastereomeric (الشكل 5). في ر 6 الشكلانه يظهر رد فعل آلية، وينطوي على التحلل الضوئي من 8-bromopurine المشتقات 5 إلى إعطاء C8 المقابلة المتطرفة 6، الذي تجرد intramolecularly ذرة الهيدروجين من موقف C5 'تكفل انتقائي في 7 2'-deoxyadenosin-5'-YL الراديكالية. 7 جذرية يخضع cyclization مع معدل ثابت في نطاق 10 5 -10 6 ق -1، 2 تابعوا عن طريق الأكسدة من 8 الراديكالية heteroaromatic لإعطاء المنتجات النهائية 9. رد فعل جذور الهيدروكسيل، الناتجة عن الإنحلال الإشعاعي من المياه، مع deoxyadenosine-2'و2'deoxyguanosine-(10)، وجد أن يحدث كاليفورنيا. 10٪ من التجريد الهيدروجين من موقف C5 '.. 7
ويتضح نهجنا البيولوجيا الكيميائية للمكتبات البيورين 5 '،8-سيكلو-2'-deoxyribonucleosides (بما في ذلك مركبات المسمى) في الشكل 7، مع تحديد هذه الآفات في أليغنوكليوتيد] وكذلك في عينات من الحمض النووي التي تم الحصول عليها من فا مصادر rious زارة شؤون المحاربين مثل، على سبيل المثال، وتعامل في ظروف الإشعاع المؤين، وتقليد من ظروف الإجهاد المتطرف.
في الشكل 8 يتم عرض المعدات photoreactor نموذجية. الجهاز يسمح للتشعيع المركبات الذائبة في المذيبات المناسبة. وتتكون من: أ) دائرة رد الفعل مجهزة مدخل لغاز خامل (في أسفل) واثنين من مداخل للخروج الغاز وإضافة الكواشف؛ الثاني) دائرة داخلية تحتوي على الزئبق مصباح مناسبة متصلة نظام التبريد والطاقة الكهربائية، والتي يتم إدخالها في غرفة التفاعل من خلال الزجاج المشتركة.
الشكل 1. أحادية غير المشبعة الايزومرات من الكوليسترول وينولييت arachidonate.
r.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 2. استرات الكوليسترول في الدم وتحليل الإنسان مباشرة لأحادية غير المشبعة أيزومرات بواسطة رامان الطيفي.
الشكل 3. بالإضافة إلى ذلك، عملية القضاء الذي يؤدي إلى ايزوميرة رابطة الدول المستقلة العابر للروابط مزدوجة من قبل المتطرفين thiyl.
الشكل 4. ثلاث خطوات لتطوير بروتوكول استرات الكوليسترول أحادية غير المشبعة والعلامات البيولوجية للإجهاد الجذور الحرة.
الشكل 5. والبيورين أربعة 5 "،8-سيكلو-2 '-ديوكسي ريبونوكليوتيد diastereoisomers. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 6. جيل من C5 'المتطرفين، إما عن طريق التحلل الضوئي من 5 أو عن طريق تفاعل مع المتطرفين من 10 • HO، وآلية البيورين 5' تشكيل ،8-سيكلو-2 'ديوكسي ريبونوكليوتيد. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 7. بروتوكول وأو تحديد بعض آفات الحمض النووي الراديكالية المحلية؛ و mtDNA: الميتوكوندريا الحمض النووي، nDNA: DNA النووي.
الشكل 8. الضوئية المفاعل.
الشكل 9. رامان طيف البلازما ممثل الكوليسترول استر. في المقارنة أقحم في منطقة محددة مع ينولييت الكوليسترول والكوليسترول أحادية غير المشبعة أيزومرات حمض اللينوليك.
الشكل 10. ممثل GC تحليل FAME استرات الكوليسترول تم الحصول عليها من البلازما.
<STRONG> الشكل 11. ممثل HPLC تشغيل تحتوي على 2'-deoxyadenosine و2'deoxyguanosine مع التأكسدي والبيورين 5 '،8-سيكلو-2'-deoxyribo النيوكليوسيدات. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Discussion
تحويل طبيعيا رابطة الدول المستقلة الأحماض الدهنية غير المشبعة ذات الطابع الهندسي لأيزومرات عبر يعد نقلة متصلة مع إنتاج الإجهاد جذري في البيئة البيولوجية. الدهون غشاء الخلية التي تحتوي على الأحماض الدهنية، هي المستهدفة ذات الصلة البيولوجية للإجهاد جذرية ودرسنا أولا الذاتية ايزوميرة الفوسفورية رابطة الدول المستقلة العابر في مزارع الخلايا والحيوانات والبشر تقييم البروتوكولات التحليلية في كل حالة. 8-10 أظهرنا أن هذا التحول يمكن أن تحدث من جانب مجموعة متنوعة من المركبات المحتوية على S-، بما في ذلك thioethers، وdisulfides ثيول، والتي تحت مختلف ظروف الإجهاد المتطرف هي قادرة على توليد الجذور thiyl، أي وكيل isomerizing (الشكل 3). المثال المعروض في هذا المقال يركز على فئة من استرات الكوليسترول، والتي تمثل جزءا معروفة من دهون الدم، والمشاركة في عملية التمثيل الغذائي بشكل صارم البروتين الدهني. الربط بين استر الأحماض الدهنية وتشووbiosynthesized lesterol عن طريق نقل الأحماض الدهنية من موقع 2 من الجلسرين شاردة من فسفاتيديل إلى الكولسترول، وهي خطوة يحفزه على أسيل الليسيثين الكولسترول انزيم ترانسفيراز (LCAT). لذلك، وترتبط بشكل صارم البلازما استرات الكوليسترول مع الدهون غشاء دوران، وتحتوي على نسب عالية نسبيا من الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة (بوفا) الحالي عادة في phosphatidylcholines، أي اللينوليك والأحماض اراسيدونيك. وتشارك في تشكيل البروتين الدهني أمراض القلب والشرايين والتمثيل الغذائي. يمكن للتفاعل من استرات الكوليسترول الطبيعية مع الجذور الحرة تحدث في الروابط الثنائية من ينولييت والمخلفات arachidonate، والتي يمكن أن تتحول في المقابلة ايزومرات هندسية العابرة (انظر الشكل 1 لهياكل). توصيف محتوى استر الكوليسترول المشبعة في العينات البيولوجية من المثير للاهتمام للتنمية العلامات البيولوجية. منهجية غير مباشرة ويتكون من تحول cholesteryاسترات ل معزولة عن البلازما إلى المقابلة الدهنية حمض استرات الميثيل (FAME) والفصل الكروماتوغرافي بواسطة بروتوكولات الغاز. في هذه الحالة، يتم تنفيذ معايرة مراجع مستوى رابطة الدول المستقلة وعبر الميثيل حمض استرات الدهنية، وذلك للسماح للتحديد الكميات من المحتوى غير المشبعة في العينات. استنادا إلى الدراسات التحليلية التي أجريت على مكتبة استر الكوليسترول، اقترحنا أيضا تطبيق أسلوب يعتمد على التحليل الطيفي رامان، التي يمكن القيام بها مباشرة على جزء استر الكوليسترول معزولة عن البلازما، دون مزيد من الاشتقاق إلى FAME المقابلة (أنظر الشكلين 2 و 9). تجدر الإشارة إلى أنه حتى الآن لم يتم وصف أساليب ناجحة لرابطة الدول المستقلة وايزومرات منفصلة من الأحماض الدهنية غير المشبعة التي تحتوي على الدهون بواسطة HPLC، كما وصفها بدلا hydroperoxides استر الكوليسترول. حتى الآن، فإن الغاز الكروماتوغرافي الأسلوب غير المباشر لا تزال أفضل طريقة متاحة حتى الآن. بواسطة هذه الطريقة أول كمية evaluوقدمت أوجه للمحتوى أحادية غير المشبعة استرات الكوليسترول المستمدة من البلازما معزولة عن من المواضيع الصحية. باستخدام كاشف اللهب التأين (FID) الحد من الكشف مرضية (جزء من البليون) وتم اكتشاف كميات من المركبات nanomolar 5. يمكن مع مختلف أنظمة الكشف عن أن هذا الحد حتى خفضت. تأثير الإشعاع المؤين على استرات الكوليسترول هو مسألة إجراء المزيد من الدراسات، سواء يتم الحصول على رد خطي بالنسبة للجرعة تطبق.
كما والمثال الثاني، اخترنا النيوكليوسيدات المحورة التي يمكن أن تنتج من ضرر الجذور الحرة من الحمض النووي. جذور الهيدروكسيل (HO •) ومن المعروف أن الأكثر ضررا أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس) لقدرتها على التعديلات الكيميائية تسبب في الحمض النووي. قد الآفات مفردة أو متعددة تحدث على DNA، وذلك في الخلايا حقيقية النواة يقع في نواة والميتوكوندريا. تحديد وقياس فئات رئيسية من أضرار الأكسدة الناتجة لDNA تتطلب approprحلقة المكتبات الجزيئية من أجل إعداد بروتوكولات التحليلية. ركزنا اهتمامنا على الآفات أصغر جنبا إلى جنب، والتي هي البيورين 5 '،8-سيكلو-2'-deoxyribonucleosides، وجود سندات إضافية التساهمية بين القاعدة والأنصاف السكر التي أنشأتها هجوم الجذور الحرة. والمركبات هي 5 '،8-سيكلو-2'، وdeoxyadenosine 5 '،8-سيكلو-2'-deoxyguanosine القائمة في أشكال 5'R و 5'S diastereomeric (الشكل 5). قدرتها على أن تصبح حرة علامة الإجهاد المتطرف هو مسألة البحوث الأساسية .. 2 وفي الواقع، عندما يتعرض لDNA HO • التجريد الجذري من الهيدروجين موقف C5 'من السكر هي واحدة من الأحداث المحتملة التي أدت إلى تشكيل هذه الآفات جنبا إلى جنب. ويمكن قياس البيورين 5 '،8-cyclonucleosides ومجموع diastereomers من HPLC-MS/MS في هضم إنزيمي عينات من الحمض النووي المشع γ-متفاوتة 1 حتي 12 الآفات / 10 6 النيوكليوسيدات / غراي الذهاب غياب شكل من أشكال الأكسجين إلى مستوى الأكسجين الفسيولوجية لل أنان الأنسجة، فإن نسبة diastereomeric 5'R / 5 يجري ~ 4 ~ و 3 لمدة 5 "،8-cdAdo و 5 '،8-cdGuo على التوالي (الشكل 11) 11 ومن الجدير بالذكر أن العلاقة بين الجرعة الإشعاعية و 5 '،8-cdAdo و 5' ،8-cdAdo الآفات في الكشف عن الحمض النووي الخلوي أبعد ما يكون عن أن يكون مفهوما. يمكن تجربة واحدة على أساس أشعة 2kGy ذكرت في التجريبية لا تعتبر قاطعة 11 مزيد من التجارب من هذا النوع والكميات التحليلية للآفات الأربعة هي ضرورية لتحديد هذه العلاقة. الكشف عن هذه الآفات والتحولات أكثر شعبية الأكسدة (مثل 8-OXO-deoxyguanosine-2'، 8-oxodGuo) هي مسألة التحقيقات المكثفة، التي تثبت أهمية كل من الآفات أثناء عملية التمثيل الغذائي الناتج عن الأكسدة. 6،13 استخدام HPLC -MS/MS (ثلاثي رباعي) لديه حد الكشف على مقربة من 30fmol لجميع الآفات الأربعة. وادعى التحسينات الماضي لتصل إلى حدود الكشف عن مستويات attomol من الم Ù الصكشهادات خفض الانبعاثات. استنادا إلى الكتابات الحديثة جدا، 6 الإجراءات التحليلية يجب أن تتضمن تنظيف السليم للعينة والإثراء من أجل تلبية حدود الكشف عن MS / MS / MS (ايون فخ) أو المستخدم (ثلاثي رباعي) MS / MS في حالتنا.
وقد وضعت الحيوية مستوحاة من المركبات الاصطناعية الإجراءات 1-4 بدءا من 8-bromopurine المشتقات أو التحلل الضوئي تحت. 7،12 تشمل هذه الإجراءات المتطرفة سلسلة من ردود الفعل الذي يحاكي آلية الحمض النووي من التلف من تشكيل 5 '،8 cdAdo و5' ،8-cdGuo الآفات. من وجهات نظر بيولوجية، وقد وجد أن هذه الآفات تتراكم مع الشيخوخة بطريقة الأنسجة محددة (الدماغ الكبد>> الكلى)، وتوفير دليل على أن آليات إصلاح الحمض النووي ليست كافية للحفاظ على المادة الوراثية من هذه الآفات 13 والواقع أن إصلاح الختان النوكليوتيدات (NER) هو الطريق الوحيد الذي تم تحديده حاليا لإصلاح هذه الآفات .. 2
والفئة الثانيةوفاق من المركبات المبينة في الشكلين 1 و 5 غير متوفرة تجاريا في الوقت الحالي، ولكن من الاستراتيجيات الاصطناعية هو موضح في الأدب أنه لن يكون من الصعب أن تعد هذه المركبات للاستخدام التجاري.
نهج متعدد التخصصات التي تقدمها الدراسات البيولوجيا الكيميائية ليس فقط له قيمة هائلة في تحديد آليات الرواية التي تحدث في البيئة البيولوجية، لكنه يعطي أيضا إسهاما أساسيا في اكتشاف العلامات البيولوجية ووسائل التشخيص، وبذلك في نهاية المطاف الجدة في مجال الرعاية الصحية واستراتيجيات الوقاية. (14) وهناك حاجة لمساهمة الكيميائية التنمية الناجحة الطب الجزيئي، وخلق منصات متكاملة وألواح للالتنميط التمثيل الغذائي التي من المتوقع أن تسمح لترشيد الأمثل للتصميم التدخل، سواء العلاجية والغذائية، والحد من أوجه عدم اليقين والفشل عندما أنها يمكن أن تكون قابلة للتنبؤ.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الدعم المالي من dell'Istruzione Ministero، dell'Universitá ديلا من Ricerca (نسخ م، 2009K3RH7N_002) وماري كوري البينية الأوروبية زمالة (CYCLOGUO-298555)، وكذلك رعاية العمل COST CM0603 على 'الجذور الحرة في علم الأحياء الكيميائية والعمل COST والتقدير والإمتنان على CM1201 "الكيمياء الراديكالي المحاكاة البيولوجية".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATERIALS | |||
| Cholesteryl linoleate ≥98% | Sigma-Aldrich | C0289-100 mg | |
| Cholesteryl arachidonate≥95% | Sigma-Aldrich | C8753-25mg | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250-100 ml | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | |
| Methanol 215 SpS | Romil | H409-2,5 L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Chloroform SpS | Romil | H135 2,5 L | |
| n-Hexane 95% SpS | Romil | H389 2,5 L | |
| Acetonitrile 230 SpS | Romil | H047 2,5 L | |
| Dichloromethane SpS | Romil | H2022,5 L | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 107344-1L | |
| Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
| Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966-1L | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| NaOH solid | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| NH4OH sol. 28%-30% | Sigma-Aldrich | 221228-1L-A | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | |
| Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride | Sigma-Aldrich | 221759-100G | |
| Ammonium Molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302-100G | |
| Sulfuric Acid 95%-98% | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | 209139-25G | |
| Sodium sulfate anhydrous | Sigma-Aldrich | 238597-500G | |
| Nuclease P-I from penicillium citrinum | Sigma-Aldrich | N8630-1VL | |
| Phosphodiesterase II type I-sa | Sigma-Aldrich | P9041-10UN | |
| Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc | Sigma-Aldrich | E114-25MG | |
| Phosphatase alkaline type VII-t from*bov | Sigma-Aldrich | P6774-1KU | |
| Phosphodiesterase I type VI | Sigma-Aldrich | P3134-100MG | |
| Deoxyribonuclease II type IV from*porcin | Sigma-Aldrich | D4138-20KU | |
| Trizma(r) base, biotechnology performanc ce | Sigma-Aldrich | T6066-100G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644-100G | |
| Succinic acid bioxtra | Sigma-Aldrich | S3674-250G | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670-100G | |
| Formic acid, 98 % | Sigma-Aldrich | 06440-100ML | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Millipore | UFC500324 | |
| 8-Bromo-2'-deoxyguanosine | Berry Associates | PR3290-1 g | |
| 8-Bromo-2'-deoxyadenosine | Berry Associates | PR3300-1 g | |
| Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
| Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
| 2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3899-CA-0.1 | |
| 2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3895-0.1 | |
| Nitrous oxide (N2O) | Air Liquide | ||
| Deoxyribonucleic acid from calf thymus | Sigma Aldrich | D4522-5MG | |
| EQUIPMENT | |||
| 60Co-Gammacell | AECL- Canada | 220 | |
| Immersion well reaction medium pressure 125 watts | Photochemical reactors ltd | Model 3010 | |
| Evaporating flask 250 ml | Heidolph | P/N NS 29/32 514-72000-00 | |
| Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm | Phenomenex | 00A-4252-E0 | |
| Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm | Grace | 88081 | Semipreparative |
| SecurityGuard Kit | Phenomenex | KJ0-4282 | Analytical holder kit and accessories |
| Holder for 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7220 | Semipreparative holder |
| 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7221 | |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1100 | |
| LC/MS/MS | Applied Biosystems | 4000QTRAP System | |
| Tandem mass ESI spectrometer | (Bruker Daltonics) | Esquire 3000 plus | |
| Vial 2-4 ml | SUPELCO | Cod 27516 | |
| Vial 4 ml | SUPELCO | Cod 27517 | |
References
- Ferreri, C., Chatgilialoglu, C. Membrane lipidomics and the geometry of unsaturated fatty acids: from biomimetic models to biological consequences. Methods Molecular Biology. 579, 391-412 (2009).
- Chatgilialoglu, C., Ferreri, C., Terzidis, M. A. Purine 5',8-cyclonucleoside lesions: chemistry and biology. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1368-1382 (2011).
- Chatgilialoglu, C., Ferreri, C., et al. Radiation-induced reductive modifications of sulfur-containing amino acids within peptides and proteins. Journal of Proteomics. 74 (11), 2264-2273 (2011).
- Chatgilialoglu, C., Ferreri, C. Trans lipids: the free radical path. Accounts Chemical Research. 38 (6), 441-448 (2005).
- Melchiorre, M., Torreggiani, A., Chatgilialoglu, C., Ferreri, C. Lipid markers of geometrical radical stress: synthesis of mono-trans cholesteryl esters isomers and detection in human plasma. Journal of the American Chemical Society. 133 (38), 15184-15190 (2011).
- Wang, J., Yuan, B., Guerrero, C., Bahde, R., Gupta, S., Wang, Y. Quantification of Oxidative DNA Lesions in Tissues of Long-Evans Cinnamon Rats by Capillary High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with Stable Isotope-Dilution Method. Analytical Chemistry. 83 (6), 2201-2209 (2011).
- Boussicault, F., Kaloudis, P., Caminal, C., Mulazzani, Q. G., Chatgilialoglu, C. The fate of C5' radicals of purine nucleosides under oxidative conditions. Journal of the American Chemical Society. 130 (26), 8377-8385 (2008).
- Ferreri, C., Kratzsch, S., Brede, O., Marciniak, B., Chatgilialoglu, C. Trans lipids formation induced by thiols in human monocytic leukemia cells. Free Radicals Biology & Medicine. 38 (9), 1180-1187 (2005).
- Zambonin, L., Ferreri, C., et al. Occurrence of trans fatty acids in rats fed a trans-free diet: a free radical-mediated formation. Free Radicals Biology & Medicine. 40 (9), 1549-1556 (2006).
- Puca, A. A., Andrew, P., et al. Fatty acids profile of erythrocyte membranes as possible biomarker of longevity. Rejuvenation Research. 11 (1), 63-72 (2008).
- Belmadoui, N., Boussicault, F., et al. Radiation-induced formation of purine 5',8-cyclonucleosides in isolated and cellular DNA: high stereospecificity and modulating effect of oxygen. Organic & Biomolecular Chemistry. 8 (14), 3211-3219 (2010).
- Chatgilialoglu, C., Bazzanini, R., Jimenez, L. B., Miranda, M. A. (5'S)- and (5'R)-5',8-cyclo-2'-deoxyguanosine: mechanistic insights on the 2'-deoxyguanosin-5'-yl radical cyclization. Chemical Research in Toxicology. 20 (12), 1820-1824 (2007).
- Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5'-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
- Ferreri, C., Chatgilialoglu, C. The role of fatty acid-based functional lipidomics in the development of molecular diagnostic tools. Expert Review of Molecular Diagnostics. 12 (7), 767-780 (2012).
