Summary
급진적 기반 biomimetic 화학은 biomarker 개발에 필요한 건물 업 라이브러리에 적용되었습니다.
Abstract
생명 과학에서 자유 래디칼의 참여가 지속적으로 시간이 증가하고 여러 생리 학적 및 병리학 프로세스에 연결되었습니다. 이 주제는 생명, 건강과 노화의 품질 개량에 응용 프로그램, 생물학, 의학에 물리적, 생물학적 및 bioorganic 화학에서 걸치는, 다양한 과학 분야를 포용. 종합 기술은 지식을 기본 프로세스와 메커니즘을 발표했다에 중요한 역할을 담당하고 생물 환경 화학의 근본적인 프로세스의 여러면의 전체 조사가 필요합니다. 우리는 기계론의 경로와 제품에 대한 정보를 제공, 생물 공정과 자유 라디칼 화학 반응성을 연결할 수 화학 생물학 접근 방식을 개발했습니다. 이 방법의 핵심은 반응 통찰력을 획득, 수성 시스템에 생체 분자 동작을 (지질, 핵산 및 단백질) 공부하는 biomimetic 모델의 설계 것은 물론 경로S는 자유 라디칼 반응 제품의 분자 라이브러리를 구축. 이 문맥이 성공적으로 biomarker 발견에 사용될 수 있으며 예는 화합물의 두 클래스와 함께 제공됩니다 : 합성과 인간의 플라즈마의 검출에 대한 참조로 사용되는 cholesteryl 에스테르의 모노 트랜스의 isomers, 그리고 purine 5 ',8-cyclo-2 '-deoxyribonucleosides, 준비 DNA 샘플에 이러한 병변의 검출을위한 프로토콜의 참고 자료로 사용 이온화 radiations 후 또는 다른 건강 상태에서 얻은.
Introduction
자유 래디칼의 반응은 노화와 염증 등 많은 생물 이벤트에 대한 거대한 중요성을 공개했다. 현재, 그것은 자유 래디칼과 손상의 수리 컨트롤에 대한 기본 메커니즘과 관찰하다 효과적인 전략을 이해하기 위해 더 분명이 반응성에 관련된 각 화학 단계의 설명이 필요한 것입니다. 화학 연구의 기여는 기본이지만, 다른 프로세스의 superimposition이 복잡하고 결과와 관련 결론의 시험을 perturbs 때문에 생물학적 환경에서 직접 연구 어려울 수 있습니다. 따라서, 생물학적으로 관련 조건 하에서 자유 라디칼 반응을 모델링의 전략은 생물학 화학 메커니즘의 연구에 기본 단계가되었습니다.
지난 10 년 우리 그룹은 biomimetic 조건 하에서 자유 라디칼 프로세스 모델을 개발했습니다. 특히 우리는 EN불포화 지방산, nucleosides, 그리고 유황 함유 아미노산의 생물학적 관련성이 높은 변형을 visaged 및 건강 상태의 생체으로 평가하고 검증 할 수있는 트랙에 넣었습니다. 1-4가
우리 일반적인 접근 방식은 세 모듈로 구성 :
- 적절하게 수정 분자에 대한 액세스를 제공 유기 합성,. 합성 계획도 따라서 biomimetic 급진적 인 화학의 원칙입니다 관심의 생물학적 과정을 시뮬레이션 할 수 조건을 적용, 생물학적 환경에서 발생하는 자유 라디칼 프로세스를 시뮬레이션하기 위해 설계 할 수 있습니다. biomimetic 모델에서 반응 매체는 물이나 친수성과 소수성 구획의 공존으로 인해 이기종 매체입니다. biomimetic 모델에서 작동 할 수있는 장점은 가능성이 발견, 반응성 및 제품은 자세한 내용에 검토 할 수 있습니다 알려져 반응 파트너와 함께 간단한 환경을 가지고하는 것입니다소설 화학 경로. 이 단계에서 기계론의와 운동 정보를 수집 할 수 있습니다;
- 분자 라이브러리를 정리하고보다 복잡한 생물학적 환경을 recognition.in 촉진하기 위해 수정 된 분자의 구조 및 화학 정보를 제공하는 제품의 정제, 분석 및 특성. 프로토콜은 이러한 생물 표본에서 파생 된 것과 같은 화합물의 복잡한 혼합물을 해결의 관점에서도 설치되어있다;
- 생물 배양 한 세포를 사용하여 시험 관내 실험 중 하나로 파생 샘플, 그리고 동물과 인간의 생체 연구를 사용하여 Biomarker 개발. biomimetic 모델로 개발 된 프로토콜은 다음 다른 조건 하에서 자유 라디칼 변환을 관찰하다하는 샘플의 복잡한 분석에 적용됩니다. 합성에 의해 개발 된 분자 도서관은 생명 과학의 발견에 엄청난 도움이됩니다. 정보는 자유 라디칼 변환 giv에 모여전자 기회 수리 및 예방 전략을 찾아 내야합니다. 결과의 데이터베이스는 biomarker의 중요성뿐만 아니라 가능한 관련 요인 변수 분석하여 신중한 평가에 사용할 수 있습니다.
cholesteryl 에스테르와 purine 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides : 우리는이 방법을 믿다에 관련된 생체의 두 과목을 선택했습니다.
Protocol
1. Cholesteryl 에스테르의 모노 트랜스의 Isomers의 합성
- 2 - 프로 파놀의 cholesteryl 에스테르 (linoleate 또는 arachidonate cholesteryl 에스테르) (15 MM)을 분해. 더 나은 solubilization를 들어, 샘플은 아르곤에 따라 15 분에 sonicated했다.
- (7 MM 농도에 도달하기 위해, thiol의 2 M 주식 솔루션에서) 2 - 프로 파놀에 2 메르 캅토 에탄올을 추가, 석영 광화학 반응에 솔루션을 전송합니다. 솔루션에 산소의 존재를 제거하기 위해 20 분을 위해 아르곤과 반응 혼합물을 플러시.
- 22에서 5.5W 저압 수은 램프를 사용하여 UV 빛에 반응 혼합물을 비추다 ± 2 ° C 4 분에. 모니터로 분석 자세 - TLC (실버 얇은 층 크로마토 그래피)를 증거 모노 트랜스 cholesteryl 에스테르의 형성을 (화학 수식에 대한 그림 1 참조)합니다. TLC의 착색은 세륨 암모늄 molibdate (CAM) 솔루션에 판을 붓는에 의해 수행, 그리고 장소에는 난방에 표시되어 있습니다판. 전체 생산량의 증가를 취득 이성 질화의 다른 순찰을 수행하는 재사용 할 수있는 출발 물질을 복구하기 위해 초기 단계에서의 반응을 해소.
- 2 - 프로 파놀 몇 ML로 장치를 세척, 원형 바닥 플라스크에 반응 혼합물를 수집합니다. 용매 제거하고 같은 문헌에 설명 된 자세 - TLC에 의한 cholesteryl 에스테르의 모노 트랜스 isomers을 정화 5. 사용 모노 트랜스 cholesteryl linoleate isomers의 eluent로 헥산-디 에틸 에테르 (9시 1분 V / V), 반면에 사용 헥산 모노 트랜스 cholesteryl arachidonate의 isomers위한 디 에틸 에테르 - 아세트산 (9:1:0,1 브이 / v).
2. 인간 혈청에서 Cholesteryl 에스테르 비율의 절연
- 염수의 1 ML과 함께 인간의 혈청 (혈액의 원심 분리하여 얻은) 1 ML을 희석과 유물 (예를 들면 산화 알데히드 부가 물) 방지하기 위해 아르곤의 흐름에 따라 분리 깔때기에 솔루션을 부어. 추가 10 ML 클로로포름 - 메탄올 (2: 세 번 1 V / V). 알부민의 존재로 인해 에멀젼의 형성을 제한하기 위해 매우 천천히 분리 깔때기를 흔들어.
- 염수 (10 ML)로 한 번 유기 레이어를 씻어 다음 무수 나트륨 황산염 이상 건조, 아르곤의 흐름에 따라 Erlenmeyer 플라스크에 수집합니다. 노란 기름 (총 플라즈마 지질 분획)을 여유하는 로터리 증발기의 휘발성 물질을 제거합니다.
- 클로로포름 - 메탄올의 1 ML (2시 1분 V / V), 아르곤의 흐름에 따라 예비 TLC로 부하로 원유를 타고 eluent로 헥산-디 에틸 에테르 (9시 1분 브이 / v)의 혼합을 사용하여 . cholesteryl 에스테르 분획을 포함하는 실리카 부분을 긁어 병에 부어. 그런 다음, 클로로포름 - 메탄올 (2시 1분 브이 / v)로 (3 × 5 ML) 실리카를 추출 유기 레이어를 수집하고 cholesteryl 에스테르 (보통 ~ 1.5 밀리그램)의 순수한 일부를 감당 증발 한 후 용매를 제거합니다.
- -20 ° C.에 아르곤 및 매장에서 알루미늄 호일에 포함 어두운 병에 cholesteryl 에스테르 유지 Cholesteryl 전자sters은 빛과 산소에 민감합니다.
3. 라만 분광법에 의한 모노 트랜스 Cholesteryl 에스테르의 특성
- 2 절에서 설명한 바와 같이 인간의 혈청 (≥ 0.7 밀리그램)에서 cholesteryl 에스테르을 추출, 탄소 tetrachloride (≤ 10 μl)와 병에 장소의 작은 금액을 분해. 의 라만 신호를 cholesteryl 에스테르 분석의 관심 지역과 중복되지 않기 때문에 CCL (4) 용매로 선택됩니다.
- 일회용 유리 피펫을 통해 샘플 홀더에 솔루션을 전송 한 후 신중하게 아르곤의 느린 흐름으로 용매를 제거합니다. 균일 한 기름 필름 샘플 홀더의 내부 벽에 형성되면, 측정을위한 악기로 후자를 배치합니다.
- 푸리에는 cholesteryl 에스테르의 라만 스펙트럼이 직접 모든 derivatization 반응없이 지질 추출물에 얻어진다 변형. 샘플에 레이저 전원 샘플 손상을 방지하려면 <100 MW이다. 스캔의 총 수각 스펙트럼에 대한 배경 소음을 최소화 할 수 ≥ 800입니다.
- 이 분자 (C = C 모드를 스트레칭)에있는 C = C 이중 결합의 기여를 반영 이후 라만 스펙트럼의 1,700-1,630 cm -1 범위는 분석입니다. 곡선 피팅 분석함으로써 수 있도록이 지역에서 수행 된 지방산 알킬 체인 및 콜레스테롤의 고리 B의 이중 결합 (그림 2 참조)에서 CIS 및 트랜스 더블 채권에서 겹쳐 기여의 구별.
- 올바르게 진동 밴드에 맞게 일부 매개 변수는 고정 또는 합리적인 한도 내에서 제한되어야한다. 반 높이 대역폭이 가장 컴퓨터 최적화 루틴에 따라 결정됩니다 반면, 구성 요소 피크 프로필은 Lorentzian와 가우스 함수의 선형 조합으로 설명되어 있습니다. 구성 요소 봉우리의 수와 위치는 일부 약한 구성 요소 대역을 감지 할 수 있도록 번째 파생 스펙트럼을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이후 신호따라서 잡음 비율 해상도와 신호 사이의 권리 타협을 얻을 수 있습니다, 신호의 차별화에 따라 악화 번째 파생의 사용을 배제 할 수 13 점 Savitsky - 골 레이 기능이 넷째 파생 부드럽게, 활용의 역할 잡음 비율 . 베스트 곡선 피팅은 가장 낮은 C이 값을 얻을 수 있습니다.
- 트랜스 isomers의 존재는 1671의 구성 요소 ± 1 지방산 체인으로 인해 약간 낮은 주파수쪽으로 이동과 더불어 cm -1, 적어도 두 가지 구성 요소, 그리고 콜레스테롤 C = C 이중 결합에 의해 드러났습니다. 플라즈마 cholesteryl 에스테르 대표 라만 스펙트럼은 그림 9에 표시됩니다. 삽입에 cholesteryl linoleate와 모노 트랜스 cholesteryl 리놀레산 isomers과 특정 지역의 비교가 표시됩니다.
4. 지방산 메틸 에스테르 (명성) 및 가스 크로마토 그래피에 의한 분석에 Derivatization
- 디졸브아르곤 아래에 알루미늄 호일이 적용 어두운 병에 1 M의 벤젠 - 메탄올의 수산화 나트륨의 솔루션 (2시 3분 V / V)과 장소의 0.5 ML로 cholesteryl 에스테르 (~ 1.5 MG).
- 혼합물이 eluent로 헥산-디 에틸 에테르 (9시 1분 브이 / v)의 혼합을 사용하여 TLC에 의한 실내 온도와 모니터에 감동 둡니다. 반응 시간은 보통 30 분이지만주의 반응 모니터링이 필요합니다. 해당 메틸 에스테르가 형성되는 후 사실, 반응은 저하 및 사이드 제품의 형성을 방지하기 위해 침묵해야합니다. TLC는 메틸 에스테르의 양적 형성을 보여 주었다.
- 염수의 1 ML을 추가하여 반응 혼합물을 해소하고 N-헥산 (3 × 2 ML)과 메틸 에스테르의 압축을 풉니 다. 병에 유기 레이어를 수집하고 더 정화없이 GC 분석에 사용되는 메틸 에스테르 분율을 감당 회전 증발하여 용매를 제거합니다.
- N-헥산의 최소 수량 (보통 5 일 MG에서 메틸 에스테르를 해산0 μl)와 60m × 0.25 mm × 0.25 μm (50 % - cyanopropyl) methylpolysiloxane 열 갖춘 GC에 주입. 다음 오븐 프로그램 불꽃 이온화 검출기 (FID)를 사용 : 165의 온도 시작 ° C, 1의 증가에 이어 3 분을 위해 개최 ° C / 195 분까지 ° C, 두 번째에 이어 40 분을 위해 개최 (10)의 증가 ° C / 240까지 분 ° C, 10 분 동안 누르고 있습니다. 일정한 압력 모드 (29 PSI)이 선택됩니다. 헬륨이나 수소는 캐리어 가스로 사용하실 수 있습니다. 메틸 에스테르는 본격적인 샘플의 보유 시간과 비교하여 확인할 수 있습니다. 그림 10은 플라즈마 cholesteryl의 에스테르로부터 얻은 명예의 대표 GC 분석을 보여줍니다.
5. 의 합성 (5'R) - (5의) -5 ',8-cyclo-2'-deoxyadenosine
- 1 ㎜ 농도에 도달하기 위해 아세토 니트릴 8 - 브로 모-2'-deoxyadenosine의 33 MG (8-BR-징두리 판벽) (100 ML)를 분해. photoreactor에 가스 흐름 (아르곤 또는 N2)를 규제하고 appa을 채울8 BR-징두리 판벽의 솔루션을 ratus.
- photoreactor의 입력에 해당하는 크기의 중격을 준비하고 중심을 통해 불활성 가스 라인에 연결된 바늘을 전달합니다. 심장과 시스템을 닫습니다. 30 분의 불활성 가스를 플러시.
- 22에서 125W 중간 압력 수은 램프를 사용하여 UV 빛으로 비추다 ± 2 ° C 15 분 동안 250 ML 둥근 바닥 플라스크에 솔루션을 수집합니다. 10 ML의 아세토 니트릴로 photoreactor을 씻고 같은 병에 washings를 수집합니다.
- 1 M NH 4 OH 솔루션으로 원유 반응 혼합물을 해소하고 회전 증발기에서 용매를 증발.
- 알려진 조건 하에서 분석 칼럼과 고성능 액체 크로마토 그래피 분석 (HPLC-UV)을 (계장 섹션을 참조) 실행하고 참조 화합물과 프로필을 비교합니다.
- 다음 솔을 사용하여 분석 컬럼 (계장 섹션을 참조) 고성능 액체 크로마토 그래피 분석 (HPLC-UV)를 실행통풍구 및 그라디언트 : 2 밀리미터 암모늄 편대 용매로하여 아세토 니트릴 용매 B. 1 ML / 분 및 2.2 분에 도달 할 0퍼센트 용매 B에서 0.3 % 용매 B에 그라디언트에 유량을 설정으로. 4.8 분에서 4.0 분으로 다음 1% 용매 B에서 다음 0.8 % 용매 B. 6 분에 8% 용매 B로 이동 한 후 9 분 1 % 용매 B를 유지합니다. 4 분에서 10 % 용매 B로 이동 30 % 용매 B에 5 분에서와 다른 5 분 30 % 용매 B의 유지 후. 두 개의 다른 병에 두 diastereomeric 제품에 해당하는 크로마토 그래피 피크를 수집합니다.
- UV 분광 광도계에있는 두 수집 분수의 흡광도를 측정하고 Lamber - 맥주 법 (A는 흡광도입니다 A = εlC, ε 흡광 계수와 나 셀의 길이)에 따라 정확한 농도를 계산합니다. (260 nm 정도의 15,400 M -1 cm -1) (징두리 판벽) 2'-deoxyadenosine의 흡광 계수 (ε)를 사용합니다.
6. 의 합성 (5'R) -D (5의) -5 ',8-cyclo-2'-deoxyguanosine
- 각각 1mM과 2mM 농도에 도달하기 위해 증류수 (100 ML) 8 - 브로 모-2'-deoxyguanosine의 35 MG (8-BR-dGuo)과 나트륨 요오드화물 (NAI (Network Advertising Initiative))의 30 밀리그램을 분해. photoreactor에 연결 불활성 가스 (아르곤 또는 N 2) 흐름을 조절하고 반응 솔루션을 photoreactor을 입력합니다.
- 로 (B 단계) 절차 5에 설명 된 반응 혼합물을 Degass.
- 22에서 125W 중간 압력 수은 램프를 사용하여 UV 빛으로 비추다 ± 2 ° C 30 분 동안 250 ML 둥근 바닥 플라스크에 솔루션을 수집합니다. 물 10 ML과 photoreactor을 씻고 같은 병에 washings를 수집합니다.
- 1 M NH 4 OH 솔루션으로 원유 반응 혼합물을 해소하고 진공 용매를 증발.
- (g까지 단계 전자) 절차 5에 설명 된대로 분석을 수행합니다. (260 nm 정도의 11,700 M -1 cm -1) (dGuo) 2'-deoxyguanosine의 흡광 계수 (ε)를 사용합니다.
7. Isotopic 레이블 Purine (5'R)의 합성 - (5의) -5 ',8-cyclonucleosides
- 15 N isotopic 표시 purine의 nucleosides의 1mM 수용액 (증류수)의 2 ML을 준비 ([15N 5] 징두리 판벽 또는 [15N 5] dGuo) 중격 캡이있는 유리관 (4 ML)에 있습니다.
- 심장 캡과 병을 연결하고 유리 병의 바닥에 도달 심장에 바늘을 통해 가스 라인 (솔루션의 채도에 대한 N 2 O)에 연결합니다. 심장 캡의 또 다른 짧은 바늘이 가스 출구로 작동합니다.
- 30 분에 대한 N 2 O와 솔루션을 플러시. 가스의 흐름은 매우 낮은 것으로 규정되어 있습니다.
- 출구 바늘이 먼저 꺼 냈습니다 1 '이후 긴 하나는 유리 병 안에 작은 압력을하기 위해 다음과 수 있습니다.
- 8 시간 (복용 률 CA. 4.5 GY / 분을 기준으로 계산)에 대한 감마 radiolysis의 장치에 솔루션을 놔.
- 반응은 1 M NH 4 원유을 해소 한 후
- 알려진 조건, 6에서 고성능 액체 크로마토 그래피 분석 (HPLC-UV)를 실행하고 표준 참조와 크로마토 그램을 비교합니다.
8. DNA 수성 솔루션의 감마 Radiolysis
- 0.5 MG / 송아지 thymus DNA의 ML 솔루션 (증류수) 1 ML을 준비하고 심장 캡이있는 유리관 (2 ML)에 넣어.
- (단계 BD) 절차 7에 설명 된대로 반응을 Degass.
- 30 분 (용량 / 속도 CA. 4.5 GY / 분을 기준으로 계산)에 대한 감마 radiolysis의 장치에 솔루션을 놔.
9. DNA의 효소 소화
- DNA의 80 μg을 포함하는 Eppendorf 튜브에, nuclease P1, phosphodiesterase II, 300 MM 나트륨 아세테이트 (산도 5.6), 10 MM 아연 염화물의 20 μl의 EHNA 20 nmol의 0.01 U의 8 U를 추가합니다. 48 시간에 37 ° C에서 혼합물을 품다.
- 다음 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 8 U의 혼합, phosphodiesteras의 0.02 U를 추가전자 I, 혼합 소화에 0.5 M 트리스 - HCL 버퍼 (산도 8.9) 40 μl 인치 샘플은 2 시간에 37 ° C에서 incubated입니다.
- 혼합물은 10 % 개미 산성의 추가에 의해 무력화된다.
- Amicon 울트라 0.5 원심 필터 장치 (컷오프 3 kDa)에 샘플을 전송, tridistilled H 2 O. 200 μl를 추가합니다 15 분에 14,000 XG에서 원심 분리기 회 전자에 울트라 필터를 놓습니다. 그런 다음 microcentrifuge 관에서 울트라 필터 장치를 분리합니다. microcentrifuge 관 효소 무료 솔루션을 Lyophilize.
10. 분석에 앞서 DNA 샘플 Desalinization
- 분석 칼럼과 고성능 액체 크로마토 그래피 분석 (HPLC-UV) (계장 섹션을 참조) 알려진 조건에 따라 6. 실행
- H 2 O의 20 μl에 동결 건조 된 소화 DNA를 해산하고 HPLC-UV에 주입.
- 소금 용출 (첫 분) 후에 바로 용출 팀 전에 병에 샘플을 수집크로마토 그래피 프로그램의 말까지 첫 번째 뉴 클레오 사이드 (5'R-cdGuo)의 5.
- 샘플은 동결 건조 된 20 μl 물에 resolubilized 있습니다.
11. LC-MS/MS 정량 분석
- 분석 방법 및 MS 검출기 (ESI)에 대한 방법을로드하여 분석을 시작하기 전에 HPLC-MS/MS을 (트리플 quadrupole) 준비 6.
- 절차 7에서 준비한 샘플의 isotopic 라벨 화합물 혼합물의 1 μl를 추가합니다.
- 증류수의 아군 소화 DNA 솔루션 20 μl를 삽입.
- 얻은 크로마토 그래피 데이터는 참조 화합물과 이전 보정에 근거하여 정교합니다. 대표 HPLC는 아데노신과 2'-deoxyribonucleosides 및 산화와 cyclo 파생 구아노 신이 그림 11에 표시되어 포함 실행합니다.
Representative Results
이성 질화 과정은 생물학적 환경에서 자유 라디칼 스트레스 조건 하에서 발생할 수 있습니다이 공격의 첫 번째 제품으로 그림 1에 표시된 모노 트랜스 linoleic의 isomers와 아라키돈의 산을 affording cholesteryl 에스테르에 대한 특정에 설명되어 있습니다. 5
그림 3에서 CIS - 트랜스 이중 결합의 이성 질화에 참여 화학 장치가 표시됩니다. 급진적 인 소스는 S-중심의 급진파 여유가 할 수있는 일반적인 방법으로 표시됩니다. 설명 프로토콜에서 급진적 인 소스 homolitically thiol 분자 RSH의 SH 채권 선물을 깰 수 있습니다 UV 빛입니다.
그림 4는 인간의 플라즈마의 수정 된 지질 클래스와 감지의 합성을위한 3 단계 프로토콜을 요약 : 합성 biomimetic 자유 라디칼 과정을 의미하고 또한 geomet에 한 냄비 편리하게 항목을 제공합니다위치 isomers에 의한 오염이없는 rical isomers는 정화 및 분리 프로토콜이 나타납니다.
여러 분석 방법은 모노 트랜스 cholesteryl 에스테르 라이브러리의 트랜스 이성체 내용 및 특성의 높은 민감한 검출에 적용 할 수 있습니다. 특히, 라만 분광 (그림 2, 그림 9 참조) derivatization 않고 직접 cholesteryl 에스테르 분율을 수행 할 수 있습니다.
두 번째 예를 들어 문제의 purine 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, 위치 설탕 잔기의 C5 '와 설탕과베이스 사이에 공유 결합의 후속 형성에 유리기의 공격에 의해 만들어 DNA의 병변 아르 moieties. 네 구조를 생산할 수, 그 5 ',8-cyclo-2'-deoxyadenosine 5 ',8-cyclo-2'입니다 - deoxyguanosine, 모두 5'R와 5의 diastereomeric 형태 (그림 5)에서 기존. 그림 6t의그가 반응 메커니즘이 표시되어, 그 해당 C8에게 intramolecularly 선택적으로 2'-deoxyadenosin-5'-yl 급진적 인 7 affording C5 '위치에서 수소 원자를 추상화 급진적 6, 부여 8 bromopurine 유도체 (5)의 광분해을 포함한다. 급진적 인 7 범위 10 5 -10 6 초 -1, 2 최종 제품 구를 제공 할 수있는 heteroaromatic 급진적 8 산화 다음의 상수 속도로 cyclization를 겪. 2'-deoxyadenosine 및 2'-deoxyguanosine과 물 radiolysis에 의해 생성 된 히드 록실 래디칼의 반응은, (10) CA 발생하는 발견되었습니다. C5 '위치에서 수소 추출하여 10 %. 7
purine 5 라이브러리에 대한 화학 생물학 접근 방식 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides은 (라벨이 화합물 포함) oligonucleotides에서 이러한 병변의 식별과뿐만 아니라 VA에서 얻은 DNA 샘플에서, 그림 7에 도시된다같은 rious 소스는 예를 들어, 급진적 인 스트레스 조건의 모방으로 이온화 방사선 조건 하에서 처리.
그림 8에서는 전형적인 photoreactor 장비가 표시됩니다. 이 장치는 적절한 용매에 용해 화합물을 조사 할 수 있습니다. 그것은으로 구성되어 있습니다 :) 전 불활성 가스 (하단)와 가스 출구 두 유입구 및 시약 첨가에 대한 유입이 장착 된 반응 챔버, II) 적절한 수은 램프를 포함하는 내부 챔버 냉각 시스템에 연결 과 유리 공동을 통해 반응 챔버에 삽입되는 전력.
1 그림. cholesteryl의 linoleate와 arachidonate의 모노 트랜스의 isomers.
그림 2. 라만 분광법에 의한 모노 트랜스의 isomers에 대한 인간의 혈청 및 직접 분석 Cholesteryl 에스테르.
그림 3. 그 외에도 - 제거 프로세스는 thiyl 래디칼의 두 채권의 CIS - 트랜스 이성 질화로 연결됩니다.
4 그림. 자유 라디칼 스트레스 biomarker로 모노 트랜스 cholesteryl 에스테르의 개발을위한 세 단계 프로토콜입니다.
그림 5. 네 가지 purine 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleoside의 diastereoisomers이 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
6 그림. C5의 세대 '급진파, 중 5 광분해 또는 HO • 래디칼과 10 반응, 그리고 purine (5)의 메커니즘으로',8-cyclo-2 'deoxyribonucleoside 형성. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 7. 프로토콜 F일부 급진적 인 기반 DNA의 병변 또는 식별, mtDNA : mitochondrial의 DNA, nDNA : 핵 DNA.
그림 8. 광화학 반응.
9 그림. 플라즈마 cholesteryl 에스테르의 대표 라만 스펙트럼. cholesteryl linoleate 및 cholesteryl 모노 트랜스 리놀레산의 isomers이있는 특정 지역의 삽입 비교합니다.
10 그림. 명예의 대표 GC 분석은 플라즈마 cholesteryl의 에스테르로부터 얻은.
<> 그림 11 강한. 대표 HPLC는 2'-deoxyadenosine 포함을 실행하고 산화 및 purine 5와 함께 2'deoxyguanosine ',8-cyclo-2'-deoxyribo의 nucleosides이 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
자연스럽게 기하학적 트랜스 isomers에 시스 불포화 지방산을 발생의 변환은 생물학적 환경에서 급진적 인 스트레스의 생산과 관련된 변화이다. 지방산이 포함되어 세포막의 지질은, 급진적 인 스트레스와 관련있는 생물학적 대상이며, 우리가 먼저 각각의 경우에 분석 프로토콜을 평가 배양 한 세포, 동물과 인간의 내생 CIS-트랜스 phospholipids의 이성 질화를 공부했습니다. 8-10 우리는 증명이 이러한 변화 다른 급진적 인 스트레스 조건 하에서 thiyl 급진파를 생성 할 수 있습니다 thiols, thioethers 및 disulfides, 즉 isomerizing 에이전트 (그림 3)를 포함하여 S-함유 화합물, 다양한에서 발생할 수 있습니다. 이 문서에 표시된 예는 엄격하게 지방 단백질의 대사에 관여하는 혈장 지질의 잘 알려진 일부를 대표 cholesteryl 에스테르의 클래스에 초점을 맞추고 있습니다. 지방산과 초 사이의 에스테르 결합lesterol는 phosphatidylcholine의 글리세롤 잔기의 위치 2에서 콜레스테롤로 지방산의 양도, transferase 효소 레시틴 콜레스테롤 아실 (LCAT)에 의해 촉매 단계에서 biosynthesized 있습니다. 따라서, 플라즈마 cholesteryl 에스테르는 엄격하게 막 지질 매출로 연결하고, 고도 불포화 지방산 phosphatidylcholines에 일반적으로 존재하는 산 (PUFA), 즉, linoleic와 아라키돈 산의 비교적 높은 비율을 포함하고 있습니다. 지방 단백질 형성은 심혈관 및 대사 질환에 관한 일을하고있다. 자유 래디칼과 자연 cholesteryl 에스테르의 반응성은 (구조 그림 1 참조) 해당 횡단 기하학적 isomers에 변환 할 수있는 linoleate의 이중 채권, arachidonate 잔류 물에서 발생할 수 있습니다. 생물학적 샘플에서 트랜스 cholesteryl 에스테르 내용의 특성화는 biomarker 개발에 대한 흥미 롭습니다. 간접 방법론은 cholestery의 변화로 구성되어 있습니다난 에스테르는 플라즈마에서 해당 지방산 메틸 에스테르 (명성) 및 가스 크로마토 그래피 프로토콜에 의해 분리에 고립. 이 경우, CIS 및 트랜스 지방산 메틸 에스테르의 표준 참조의 교정은 샘플에있는 횡단 콘텐츠의 quantitation를 허용하기 위해 수행됩니다. cholesteryl 에스테르 라이브러리에서 수행 분석 연구를 바탕으로, 우리는 (그림을 참조 해당 명성을 더 derivatization 않고, 또한 플라즈마로부터 격리 cholesteryl 에스테르 분율에 직접 수행 할 수 있습니다 라만 분광법을 기반으로 한 방법을 적용하기 위해 제안 2 9). 이제 더 성공적인 방법은 같은 대신 cholesteryl 에스테르 hydroperoxides에서 설명 별도 CIS 및 HPLC에 의해 지질을 포함하는 지방산의 트랜스 isomers에 설명되지 않습니다하도록 점을 지적 가치가있다. 지금까지 간접적 인 가스 크로마토 그래피 방법은 지금까지 여전히 가장 근접한 방법입니다. 이 방법은 첫 번째 양적 evalu으로건강한 과목의 플라즈마로부터 격리 cholesteryl 에스테르에서 파생 된 모노 트랜스 컨텐츠 ation가 제공되었습니다. 불꽃 이온화 검출기 (FID) detectability의 한계를 사용하면 만족입니다 (ppb) 및 화합물의 nanomolar 수량이 감지되었습니다. 5. 다른 탐지 시스템과이 제한도 낮아 할 수 있습니다. cholesteryl 에스테르의 이온화 방사선의 효과는 선형 응답이 적용 복용에 상대적으로 획득되어 있는지, 추가 연구의 문제입니다.
두 번째 예를 들어, 우리는 DNA의 자유 라디칼 손상에 의해 발생 할 수 있습니다 수정 nucleosides를 선택했습니다. 히드 록실 래디칼 (HO •) DNA에 화학 수정을 일으킬 수있는 능력에 가장 해로운 반응성 산소 종 (ROS)으로 알려져 있습니다. 하나 또는 여러 개의 병변은 진핵 세포의 핵 및 미토콘드리아에 자리 잡고 있다는 DNA에 발생할 수 있습니다. DNA에 산화 생성 손해의 주요 클래스의 식별 및 측정 appropr이 필요합니다분석 프로토콜을 설정하기 위해 분자 라이브러리를 늦게. 우리는 기지와 자유 라디칼 공격에 의해 생성 된 설탕 moieties 사이에 추가 공유 결합을 갖는, purine 5아르 가장 작은 협동 병변, ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides에 우리의 관심을 초점을 맞추 었습니다. 화합물은 5 ',8-cyclo-2'-deoxyadenosine 5 ',8-cyclo-2'-deoxyguanosine 5'R와 5의 diastereomeric 형태 (그림 5)에서 기존합니다. 자유 라디칼 스트레스 마커가 자신의 잠재력은 기초 연구의 문제입니다.이 사실, DNA는 HO에 노출 될 때 • 설탕 C5 '위치에서 급진적 인 수소 추출이 협동 병변의 형성으로 이어지는 수있는 이벤트 중 하나입니다. Purine 5 ',8-cyclonucleosides는 산소의 생리적 수준에 산소의 양식 부재가는 1-12 병변 / 10 6 nucleosides / GY에서 다양한 효소 소화 γ-방사능 DNA 샘플에 HPLC-MS/MS에 의해 diastereomers의 합으로 측정 될 수 나는N의 조직, diastereomeric 비율은 5'R / 5의 ~ 5 4 ~ 3 ',8-cdAdo 5',8-cdGuo, 각각 (그림 11). 11는 지적 가치가되는 방사선 선량과의 관계 세포 DNA에서 발견 5 ',8-cdAdo 5',8-cdAdo의 병변은 이해되지는 거리가 멀다. 2kGy 조사를 기반으로 한 실험 실험에보고하는 것은 결정적으로 간주 될 수 없습니다.이 친절하고 네 개의 병변의 분석 quantitation 11 추가 실험은 관계를 정의하는 데 필요합니다. 이러한 병변의 탐지 및 인기 산화 변환 (예 : 8 - 옥소-2'-deoxyguanosine, 8 oxodGuo 등) 산화 신진 대사를하는 동안 두 병변의 중요성을 증명, 강렬한 조사의 문제입니다. 6,13 HPLC의 사용 -MS/MS (트리플 quadrupole)는 네 가지 병변에 대한 가까운 30fmol에 검색 제한이 있습니다. 마지막 개선 악기 produ에 의해 attomol 수준의 검출 한계에 도달 주장 아르cers. 아주 최근의 문헌을 바탕으로, 6 분석 절차는 MS / MS / MS (이온 트랩) 또는 MS / MS (트리플 quadrupole)를 사용의 감지 한계를 충족하기 위해 샘플과 농축의 적절한 정리를 포함해야 우리의 경우 인치
화합물 1-4의 바이오 영감을 합성 절차는 8 bromopurine의 아래에서 파생 또는 광분해부터 개발되었다. 7,12 이러한 절차는 급진적 인 캐스케이드 (5)의 형성 DNA 손상 메커니즘을 모방 반응 ',8-cdAdo 5'를 포함 ,8-cdGuo의 병변. 생물학적 관점에서, 그것은 이러한 병변은 DNA 복구 메커니즘이 병변에서 유전 물질을 보존 불충분 한 것을 증거를 제공하는 조직에 특정한 방식 (간> 신장> 뇌)에서 노화와 축적을 발견했습니다. 13 사실, 염기 절단 수리 (NER) 유일한 경로는 현재 이러한 병변의 수리를 위해 식별됩니다. 2
두 클래스도 1 및도 5에 도시 된 화합물의 에스는 현재 상업적으로 사용할 수 없습니다 그러나 문학에 설명 된 합성 전략으로는 상업적으로 사용에 대해 이러한 화합물을 준비하는데 불편 함이 없을 것입니다.
화학 생물학 연구에 의해 제공 학제 접근 방식뿐만 아니라 생물학적 환경에서 발생하는 소설 메커니즘의 식별에 엄청난 가치를 가지고뿐만 아니라, 궁극적으로 보건 의료 및 예방 전략에 참신함을 가져, biomarker 발견 및 진단에 근본적인 기여를 할 수 있습니다. 14 화학 기여들은 예측 할 수있을 때 불확실성과 실패를 줄이는 치료 및 영양 중 개입 디자인의 최적의 합리화, 수 있도록 예상됩니다 신진 대사 프로파일 링을위한 통합 플랫폼 및 패널을 만들어, 분자 의학의 성공적인 개발을 위해 필요합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
Ministero dell'Istruzione, dell'Universitá 델라 Ricerca (인화-2009K3RH7N_002)와 마리 퀴리 사내 유럽 휄로 십 (CYCLOGUO-298555)뿐 아니라 '자유 화학 생물학의 부수 및 비용 액션에 대한 COST 액션 CM0603의 후원의 재정 지원 "Biomimetic 급진적 화학"에 CM1201은 굉장히 인정하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATERIALS | |||
| Cholesteryl linoleate ≥98% | Sigma-Aldrich | C0289-100 mg | |
| Cholesteryl arachidonate≥95% | Sigma-Aldrich | C8753-25mg | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250-100 ml | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | |
| Methanol 215 SpS | Romil | H409-2,5 L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Chloroform SpS | Romil | H135 2,5 L | |
| n-Hexane 95% SpS | Romil | H389 2,5 L | |
| Acetonitrile 230 SpS | Romil | H047 2,5 L | |
| Dichloromethane SpS | Romil | H2022,5 L | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 107344-1L | |
| Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
| Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966-1L | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| NaOH solid | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| NH4OH sol. 28%-30% | Sigma-Aldrich | 221228-1L-A | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | |
| Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride | Sigma-Aldrich | 221759-100G | |
| Ammonium Molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302-100G | |
| Sulfuric Acid 95%-98% | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | 209139-25G | |
| Sodium sulfate anhydrous | Sigma-Aldrich | 238597-500G | |
| Nuclease P-I from penicillium citrinum | Sigma-Aldrich | N8630-1VL | |
| Phosphodiesterase II type I-sa | Sigma-Aldrich | P9041-10UN | |
| Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc | Sigma-Aldrich | E114-25MG | |
| Phosphatase alkaline type VII-t from*bov | Sigma-Aldrich | P6774-1KU | |
| Phosphodiesterase I type VI | Sigma-Aldrich | P3134-100MG | |
| Deoxyribonuclease II type IV from*porcin | Sigma-Aldrich | D4138-20KU | |
| Trizma(r) base, biotechnology performanc ce | Sigma-Aldrich | T6066-100G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644-100G | |
| Succinic acid bioxtra | Sigma-Aldrich | S3674-250G | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670-100G | |
| Formic acid, 98 % | Sigma-Aldrich | 06440-100ML | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Millipore | UFC500324 | |
| 8-Bromo-2'-deoxyguanosine | Berry Associates | PR3290-1 g | |
| 8-Bromo-2'-deoxyadenosine | Berry Associates | PR3300-1 g | |
| Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
| Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
| 2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3899-CA-0.1 | |
| 2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3895-0.1 | |
| Nitrous oxide (N2O) | Air Liquide | ||
| Deoxyribonucleic acid from calf thymus | Sigma Aldrich | D4522-5MG | |
| EQUIPMENT | |||
| 60Co-Gammacell | AECL- Canada | 220 | |
| Immersion well reaction medium pressure 125 watts | Photochemical reactors ltd | Model 3010 | |
| Evaporating flask 250 ml | Heidolph | P/N NS 29/32 514-72000-00 | |
| Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm | Phenomenex | 00A-4252-E0 | |
| Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm | Grace | 88081 | Semipreparative |
| SecurityGuard Kit | Phenomenex | KJ0-4282 | Analytical holder kit and accessories |
| Holder for 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7220 | Semipreparative holder |
| 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7221 | |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1100 | |
| LC/MS/MS | Applied Biosystems | 4000QTRAP System | |
| Tandem mass ESI spectrometer | (Bruker Daltonics) | Esquire 3000 plus | |
| Vial 2-4 ml | SUPELCO | Cod 27516 | |
| Vial 4 ml | SUPELCO | Cod 27517 | |
References
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