Summary
Radical basado en la química biomimética ha sido aplicada a bibliotecas de hasta edificio-necesarias para el desarrollo de biomarcadores.
Abstract
La implicación de los radicales libres en las ciencias de la vida ha aumentado constantemente con el tiempo y se ha conectado a varios procesos fisiológicos y patológicos. Este tema abarca diversas áreas científicas, que se extiende desde la química física, biológica y bioorgánica a la biología y la medicina, con aplicaciones a la mejora de la calidad de vida, la salud y el envejecimiento. Habilidades multidisciplinarias son necesarios para la investigación exhaustiva de las múltiples facetas de los procesos radicales en el entorno biológico y químico conocimiento desempeña un papel crucial en la revelación de los procesos y mecanismos básicos. Hemos desarrollado un enfoque de biología química capaz de conectar reactividad química radical libre con los procesos biológicos, proporcionando información sobre las vías mecanicistas y productos. El núcleo de este enfoque es el diseño de modelos biomiméticos para estudiar el comportamiento de biomoléculas (lípidos, ácidos nucleicos y proteínas) en sistemas acuosos, la obtención de puntos de vista de los caminos de reacción así como uns construcción de bibliotecas moleculares de los productos de reacción de radicales libres. Este contexto puede ser utilizado con éxito para el descubrimiento de biomarcadores y ejemplos se proporcionan con dos clases de compuestos: mono-trans isómeros de los ésteres de colesterol, que se sintetizan y se utiliza como referencia para la detección en el plasma humano y purina 5 ',8-ciclo-2- '-desoxirribonucleósidos, preparar y utilizar como referencia en el protocolo para la detección de tales lesiones en muestras de ADN, después de radiaciones ionizantes u obtenidos a partir de diferentes condiciones de salud.
Introduction
La reactividad de los radicales libres revelaron su enorme importancia para muchos procesos biológicos, incluyendo el envejecimiento y la inflamación. Hoy en día, es cada vez más evidente que la aclaración de cada paso químico implicado en esta reactividad es necesaria, con el fin de comprender los mecanismos subyacentes y estrategias prevén eficaces para el control de los radicales libres y de reparación de los daños. La contribución de los estudios químicos es fundamental, pero el estudio directo en el medio ambiente biológico puede ser difícil, ya que la superposición de diferentes procesos complica y perturba el examen de los resultados y las conclusiones relacionadas. Por lo tanto, la estrategia de modelar reacciones de radicales libres en condiciones biológicamente relacionados ha convertido en un paso fundamental en la investigación de los mecanismos químicos de la biología.
En la última década nuestro grupo desarrolló los modelos de procesos de radicales libres en condiciones biomiméticos. En particular, ESvisaged transformaciones biológicamente relevantes de ácidos grasos insaturados, nucleósidos y azufre que contienen aminoácidos y los puso en la pista para ser evaluados y validados como biomarcadores del estado de salud 1-4.
Nuestro enfoque general consiste en tres módulos:
- Síntesis orgánica, que proporciona acceso a las biomoléculas, convenientemente modificada. El plan sintético también puede ser diseñado con el fin de simular los procesos de radicales libres que ocurren en el entorno biológico, por lo tanto la aplicación de condiciones capaces de simular el proceso biológico de interés, que es el principio de la química biomimética radical. En modelos biomiméticos el medio de reacción es agua o un medio heterogéneo debido a la coexistencia de compartimentos hidrofílicos e hidrofóbicos. La ventaja de trabajar con modelos biomiméticos es tener un entorno simplificado con socios de reacción conocidas, donde se puede reactividad y de los productos examinados en más detalles, posiblemente descubrirnuevas vías químicas. A partir de este paso información sobre el mecanismo y cinética puede ser recogida;
- La purificación, análisis y caracterización de los productos, el suministro de información estructural y química de las biomoléculas modificadas con el fin de organizar las bibliotecas moleculares y facilitar recognition.in el entorno biológico más complejo. Los protocolos se estableció también en vista de resolver mezclas complejas de compuestos tales como los derivados de especímenes biológicos;
- Biomarcador de desarrollo utilizando muestras biológicas, derivados ya sea por experimentos in vitro utilizando cultivos de células, y en estudios in vivo de animales y seres humanos. Los protocolos desarrollados en modelos biomiméticos se aplican entonces al análisis de muestras complejas, prever las transformaciones radicales libres bajo condiciones diferentes. Bibliotecas moleculares desarrolladas por síntesis son de gran ayuda a los descubrimientos de ciencias de la vida. Las informaciones recogidas en el radical libre giv transformacionese la oportunidad de descubrir las estrategias de reparación y prevención. Bases de datos de los resultados pueden ser utilizados para una evaluación cuidadosa en el análisis multivariante de la importancia biomarcador así como posibles factores asociados.
Elegimos dos clases de biomarcadores pertinentes para acreditar este enfoque: ésteres de colesterol y purinas 5 ',8-2'-ciclo-desoxirribonucleósidos.
Protocol
1. Síntesis de Mono-isómeros trans de ésteres de colesterol
- Disolver los ésteres de colesterol (linoleato o araquidonato de éster de colesterilo) en 2-propanol (15 mM). Para una mejor solubilización, las muestras se sonicaron durante 15 min en atmósfera de argón.
- Transferir la solución a un reactor fotoquímico de cuarzo, añadir 2-mercaptoetanol en 2-propanol (para llegar a 7 mM de concentración, a partir de una solución madre 2 M del tiol). Lavar la mezcla de reacción con argón durante 20 min con el fin de eliminar la presencia de oxígeno en la solución.
- Irradiar la mezcla de reacción por la luz UV usando un 5.5W baja presión lámpara de mercurio a 22 ± 2 ° C durante 4 min. Monitor de Ag-analítico por TLC (plata-cromatografía de capa fina) a la evidencia de la formación de los ésteres de mono-trans colesterilo (véase la Figura 1 para las fórmulas químicas). La tinción de TLC se lleva a cabo mediante el vertido de la placa en el molibdato de amonio cerio (CAM) solución, y los puntos aparecen en calefacciónla placa. Se detiene la reacción en una etapa temprana, a fin de recuperar el material de partida, que puede ser reutilizado para realizar otras rondas de isomerización, la obtención de un aumento de la producción total.
- Recoger la mezcla de reacción en un matraz de fondo redondo, de lavar el aparato con unos pocos ml de 2-propanol. Eliminar el disolvente y purificar los isómeros trans de los mono-ésteres de colesterol por Ag-TLC como se describe en la literatura. 5 Uso hexano-éter dietílico (9:1 v / v) como eluyente para mono-trans isómeros linoleato de colesterilo, mientras hexano uso -dietil éter-ácido acético (9:1:0,1 v / v) para mono-trans isómeros de colesterilo araquidonato.
2. Aislamiento de la fracción de ésteres de colesterol del suero humano
- Diluir 1 ml de suero humano (obtenido por centrifugación de sangre) con 1 ml de salmuera y se vierte la disolución en un embudo de separación en una corriente de argón a fin de evitar los artefactos (por ejemplo, aductos de oxidación). Añadir 10 ml de cloroformo-metanol (2: 1 v / v) tres veces. Agitar el embudo de separación muy lentamente a fin de limitar la formación de la emulsión debido a la presencia de albúmina.
- Se lavan las capas orgánicas una vez con salmuera (10 ml), se recolecta en un matraz Erlenmeyer bajo un flujo de argón, se seca sobre sulfato de sodio anhidro. Eliminar los volátiles mediante evaporador rotatorio para dar un aceite amarillo (fracción total de lípidos en plasma).
- Se recoge el crudo con 1 ml de cloroformo-metanol (2:1 v / v), carga sobre una TLC preparativa en una corriente de argón y el uso de una mezcla de hexano-éter dietílico (9:1 v / v) como eluyente . Raspar la porción de sílice que contiene la fracción de éster de colesterol y se vierte en un vial. A continuación, extraer sílice (3 x 5 ml) con cloroformo-metanol (2:1 v / v), recoger las capas orgánica y eliminar el disolvente después de la evaporación para dar la fracción pura de ésteres de colesterol (normalmente ~ 1,5 mg).
- Mantener los ésteres de colesterol en un frasco de vidrio oscuro cubierto por una lámina de aluminio en atmósfera de argón y se almacena a -20 ° C. Colesteril esters son sensibles a la luz y el oxígeno.
3. Caracterización de Mono-trans ésteres de colesterol por espectroscopia Raman
- Extracto de ésteres de colesterol de suero humano (≥ 0,7 mg) como se describe en la sección 2, se disuelven en una pequeña cantidad de tetracloruro de carbono (≤ 10 l), y meterlo en un frasco. CCl 4 se selecciona como disolvente, ya que su señal Raman no se solapa con la región de interés del análisis de éster de colesterilo.
- Transferir la solución a la titular de la muestra a través de una pipeta de vidrio desechable, a continuación, retirar cuidadosamente el disolvente mediante una lenta corriente de argón. Una vez que una película oleosa uniforme se forma en la pared interna del soporte de muestras, colocar este último en el instrumento de medición.
- Transformada de Fourier del espectro Raman de los ésteres de colesterol se obtiene directamente en los extractos de lípidos sin ninguna reacción de derivatización. La potencia del láser en la muestra es <100 mW para evitar el daño de la muestra. El número total de exploracionespara cada espectro es ≥ 800 para reducir al mínimo el ruido de fondo.
- El rango de 1,700-1,630 cm -1 del espectro Raman se analiza ya que refleja la contribución de los enlaces C = C dobles presentes en la molécula (C = C modo de estiramiento). Un análisis de ajuste de curva se lleva a cabo en esta región, lo que permite la distinción de las contribuciones superpuestas de cis y trans dobles enlaces en la cadena de alquilo graso y doble enlace en el anillo B de colesterol (véase la Figura 2).
- Para colocar correctamente las bandas vibracionales, algunos parámetros deben ser fijos o limitados dentro de unos límites razonables. Los perfiles de pico del componente se describe como una combinación lineal de Lorentzian y funciones gaussianas, mientras que los anchos de banda de altura media se determina mejor mediante la rutina de optimización del equipo. El número y la posición de los picos de los componentes se obtienen mediante el uso de los espectros cuarto derivado, que permiten detectar también algunas bandas débiles de componentes. Puesto que la señala ruido que se deteriora la diferenciación de la señal puede impedir el uso de la cuarta derivada, se alisó con una cuarta derivados de trece puntos Savitsky-Golay función, son de ventaja, por lo tanto, un buen compromiso entre la resolución y la relación de señal a ruido se obtiene . Lo mejor ajuste de la curva se obtienen en los más bajos posibles c 2 valores.
- La presencia de isómeros trans es revelada por el componente a 1671 ± 1 cm -1, además de, al menos, los dos componentes, ligeramente desplazado hacia frecuencias más bajas, debido a la cadena de ácido graso y de colesterol C = C enlaces dobles. Espectro Raman representante de plasma de éster de colesterilo se muestra en la Figura 9. En el recuadro de la comparación de una región específica con colesteril linoleato y mono-trans colesterilo isómeros de ácido linoleico se muestra.
4. La derivatización de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) y análisis por cromatografía de gases
- Disolverésteres de colesterol (~ 1,5 mg) con 0,5 ml de una solución 1 M de hidróxido de sodio en benceno-metanol (2:3 v / v) y colocar en un frasco de vidrio oscuro cubierto por una lámina de aluminio en atmósfera de argón.
- Dejar la mezcla en agitación a temperatura ambiente y el monitor por TLC usando una mezcla de hexano-éter dietílico (9:1 v / v) como eluyente. El tiempo de reacción es normalmente 30 minutos, pero una cuidadosa monitorización de la reacción se requiere. De hecho, una vez que los correspondientes ésteres metílicos se forman, la reacción debe ser apagado para evitar la formación de productos de degradación y de lado. TLC mostró la formación cuantitativa de los ésteres metílicos.
- Interrumpir la mezcla de reacción mediante la adición de 1 ml de salmuera y extraer los ésteres metílicos con n-hexano (3 x 2 ml). Recoger las capas orgánicas en un vial y eliminar el disolvente por evaporación rotatoria para dar la fracción de éster de metilo, que luego se utiliza para el análisis de GC sin purificación adicional.
- Disolver los ésteres de metilo en la mínima cantidad de n-hexano (generalmente 1 mg en 50 l) y se inyecta en el GC equipado con un m 60 x 0,25 mm x 0,25 m (50%-cianopropil)-metilpolisiloxano columna. Utilice un detector de ionización de llama (FID) con el programa del horno siguientes: temperatura de comienzo a 165 ° C, mantenida durante 3 min, seguido por aumento de 1 ° C / min hasta 195 ° C, mantenida durante 40 min, seguido de un segundo aumentar de 10 ° C / min hasta 240 ° C, y mantener durante 10 min. A modo de presión constante (29 psi) se elige. Helio o hidrógeno puede ser utilizado como el gas portador. Los ésteres metílicos se identifican por comparación con los tiempos de retención de muestras auténticas. Figura 10 muestra un análisis representativo de FAME GC obtenido a partir de ésteres de colesterol en plasma.
5. Síntesis de (5'R) - y (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-desoxiadenosina
- Disolver 33 mg de 8-bromo-2'-desoxiadenosina (8-Br-DADO) en acetonitrilo (100 ml) para llegar a la concentración de 1 mM. Regular el flujo de gas (Ar o N2) en la fotorreactor y llenar el apparatus con la solución de 8-Br-ranurar.
- Preparar un tabique con el tamaño adecuado para la entrada del fotorreactor y pasar una aguja conectada a la línea de gas inerte a través del centro de la misma. Cierre el sistema con el tabique. Enjuague el gas inerte durante 30 min.
- Irradiar por la luz UV usando un 125W de media presión lámpara de mercurio a 22 ± 2 ° C durante 15 min, recoger la solución de 250 ml en un matraz de fondo redondo. Lavar el fotorreactor con 10 ml de acetonitrilo y recoger de lavado en el mismo matraz.
- Interrumpir la mezcla de reacción en bruto con 1 M NH 4 OH solución y se evapora el disolvente en el evaporador rotativo.
- Ejecutar análisis de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC-UV) con columna de análisis (ver sección instrumentación) en condiciones conocidas, y comparar el perfil con compuestos de referencia.
- Ejecutar líquida de alto rendimiento análisis cromatográfico (HPLC-UV) con una columna analítica (véase la sección de instrumentación) mediante la siguiente solrespiraderos y degradados: 2 mM de formiato de amonio como disolvente A y acetonitrilo como disolvente B. Configuración de la tasa de flujo de 1 ml / min y el gradiente de 0% de disolvente B a 0,3% de disolvente B a ser alcanzado en 2,2 min. Entonces B 0,8% en disolvente en 4,0 min, entonces B 1% de disolvente en 4,8 min. Permanecer en 1% de disolvente B durante 9 minutos y luego ir a 8% de disolvente B en 6 min. Después de ir a 10% de disolvente B en 4 min y al 30% de disolvente B en 5 min y se mantienen a 30% de disolvente B durante otros 5 min. Recoger los picos cromatográficos correspondientes a los dos productos diastereoméricos en dos viales diferentes.
- Medir la absorbancia de las dos fracciones recogidas en el espectrofotómetro de UV y calcular la concentración exacta basada en la ley de Beer-Lamber (A εlC =, donde A es la absorbancia, ε el coeficiente de extinción y l la longitud de la célula). Utilice el coeficiente de extinción ε de 2'-desoxiadenosina (DADO) (15.400 M -1 cm -1 a 260 nm).
6. Síntesis de (5'R) - unad (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-desoxiguanosina
- Disolver 35 mg de 8-bromo-2'-desoxiguanosina (8-Br-dGuo) y 30 mg de yoduro de sodio (NaI) en agua destilada (100 ml) para llegar a la concentración de 1 mM y 2 mM, respectivamente. Regular gas inerte (Ar o N 2) de flujo conectado a la fotorreactor y llenar el fotorreactor con la solución de reacción.
- Desgasifique la mezcla de reacción como se describe en el procedimiento 5 (paso b).
- Irradiar por la luz UV usando un 125W de media presión lámpara de mercurio a 22 ± 2 ° C durante 30 min, recoger la solución de 250 ml en un matraz de fondo redondo. Lavar el fotorreactor con 10 ml de agua y recoger de lavado en el mismo matraz.
- Interrumpir la mezcla de reacción en bruto con 1 M NH 4 OH solución y se evapora el disolvente bajo vacío.
- Realizar el análisis como se describe en el Procedimiento 5 (pasos E a G). Utilice el coeficiente de extinción ε de 2'-desoxiguanosina (dGuo) (11.700 M -1 cm -1 a 260 nm).
7. Síntesis de purina isotópico Labeled (5'R) - y (5'S) -5 ',8-cyclonucleosides
- Preparar 2 ml de solución acuosa 1 mM (agua destilada) de los 15 N isotópica nucleósidos de purina etiquetados ([15N 5] Dado o [15N 5] dGuo) en un vial de vidrio (4 ml) con un tapón de séptum.
- Conectar el vial con el tapón de septo y conectarse a la línea de gas (N 2 O para la saturación de la solución) a través de una aguja en el tabique que llega al fondo del vial. Otra aguja corta en el tapón septum funciona como la salida de gas.
- Lavar la solución con N 2 O durante 30 min. El flujo de gas se regula para que sea muy baja.
- La aguja de salida es primero retirado y después de 1 'el tiempo siguiente, con el fin de tener una pequeña presión en el interior del vial.
- Dejar la solución en un aparato de radiólisis gamma durante 8 horas (cálculo sobre la base de una tasa de dosis ca. 4,5 Gy / min).
- Después de apagar la reacción en bruto con 1 M NH 4
- Ejecutar análisis de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC-UV) bajo condiciones conocidas, 6 y comparar el cromatograma con las referencias estándar.
8. Gamma radiólisis de soluciones de ADN acuosas
- Preparar 1 ml de 0,5 mg / ml de solución (agua destilada) de ADN de timo de ternera y poner en un vial de vidrio (2 ml) con un tapón de séptum.
- Desgasifique la reacción como se describe en el Procedimiento 7 (pasos bd).
- Dejar la solución en un aparato de radiólisis gamma durante 30 min (cálculo sobre la base de ca dosis / velocidad. 4,5 Gy / min).
9. La digestión enzimática de ADN
- A un tubo Eppendorf que contenía 80 g de ADN, añadir 8 U de nucleasa P1, 0,01 U de la fosfodiesterasa II, 20 nmol de EHNA en 20 l de acetato de sodio 300 mM (pH 5,6) y 10 mM de cloruro de zinc. Incubar la mezcla a 37 ° C durante 48 hr.
- A continuación añadir una mezcla de 8 U de fosfatasa alcalina, 0,02 U de phosphodiesterase I, en 40 l de 0,5 M Tris-HCl (pH 8,9) a la digestión mezcla. La muestra se incuba a 37 ° C durante 2 horas.
- La mezcla se neutralizó mediante la adición de 10% de ácido fórmico.
- Transferir la muestra a un Amicon Ultra-0.5 dispositivo de filtro centrífugo (punto de corte de 3 kDa), añadir 200 l de tridestilada H 2 O. Coloque el Ultra-filtro en el rotor de la centrífuga a 14.000 xg durante 15 min. A continuación, separar el dispositivo de filtro Ultra desde el tubo de microcentrífuga. Liofilizar la solución libre de enzimas en el tubo de microcentrífuga.
10. Desalinización del ADN de muestra antes del análisis
- Ejecutar líquida de alto rendimiento análisis cromatográfico (HPLC-UV) con columna de análisis (ver sección instrumentación) siguiendo las condiciones conocidas. 6
- Disolver el liofilizado ADN digerido en 20 l de H 2 O y se inyecta en el HPLC-UV.
- Recoger la muestra en un vial después de la elución de sal (primeros minutos) y justo antes de la elución time del primer nucleósido (5'R-cdGuo), hasta el final del programa cromatográfico.
- La muestra se liofilizó y se redisuelve en 20 l de agua.
11. LC-MS/MS Análisis Cuantitativo
- Preparar los HPLC-MS/MS (triple cuadrupolo) antes de iniciar el análisis mediante la carga del método de análisis y el método para el detector de MS (ESI). 6
- Añadir 1 l de la mezcla de compuestos marcados con isótopos en la muestra preparada en el Procedimiento 7.
- Inyectar 20 l de la solución de ADN digerido con púas en agua destilada.
- Los datos cromatográficos obtenidos se elaboran sobre la base de la calibración previa con compuestos de referencia. Un representante ejecutar HPLC que contiene adenosina y guanosina 2'-desoxirribonucleósidos y su oxidativos y derivados cíclicos se muestra en la Figura 11.
Representative Results
El proceso de isomerización se ha descrito en particular para los ésteres de colesterol que proporcione las isómeros mono-trans de los ácidos linoleico y araquidónico mostrados en la Figura 1 como los primeros productos de este ataque, que pueden ocurrir bajo condiciones de estrés de radicales libres en el entorno biológico. 5
En la Figura 3 el mecanismo químico involucrado en la isomerización cis-trans enlace doble se muestra. La fuente de radicales se indica de forma genérica para dar S-centrados radicales. En los protocolos descritos la fuente de radicales es la luz UV que es capaz de romper el enlace presente homolitically SH en la molécula de tiol RSH.
La Figura 4 resume el protocolo de tres pasos para la síntesis de la clase de lípidos modificados y su detección en el plasma humano: la síntesis representa un proceso biomimético de radicales libres y también proporciona una entrada conveniente en un solo recipiente para la GEOMETisómeros Rical, sin ninguna contaminación por isómeros de posición seguido de protocolos de purificación y aislamiento.
Varios métodos analíticos se puede aplicar para una detección de alta sensibilidad de el contenido de isómero trans y caracterización de la biblioteca de éster mono-trans colesterilo. En particular, la espectroscopia de Raman se puede llevar a cabo directamente en la fracción de éster de colesterol sin derivatización (véase la Figura 2 y Figura 9).
El segundo ejemplo se refiere purina 5 ',8-cyclo-2'-desoxirribonucleósidos, que son las lesiones del ADN creado por el ataque de los radicales libres en la posición C5 'del resto de azúcar y la posterior formación de un enlace covalente entre el azúcar y la base restos. Cuatro estructuras se puede producir, es decir, 5 ',8-cyclo-2'-desoxiadenosina y 5 ',8-cyclo-2'-desoxiguanosina, ambos en el 5'R y 5'S formas diastereoméricas (Figura 5). En la Figura 6 tél mecanismo de reacción se muestra, que implica la fotólisis de derivados de 8-bromopurina 5 para dar los correspondientes C8 radical 6, que intramolecularmente abstrae un átomo de hidrógeno de la posición C5 'selectivamente, produciendo el radical 7 2'-deoxyadenosin-5'-il. 7 radical se somete a ciclación con una tasa constante en el intervalo de 10 5 -10 6 s -1, 2, seguido por oxidación del radical heteroaromático de 8 para dar los productos finales 9. La reacción de radicales hidroxilo, generado por radiólisis del agua, con 2'-desoxiadenosina y 2 'desoxiguanosina-(10) se encontró que se producen ca. 10% por la abstracción de hidrógeno de la posición C5 '. 7
Nuestro enfoque de la biología química de las bibliotecas de purina 5 ',8-ciclo-2'-desoxirribonucleósidos (incluyendo compuestos marcados) se ilustra en la Figura 7, con la identificación de estas lesiones en los oligonucleótidos, así como en muestras de ADN obtenidas de VArentes fuentes tales como, por ejemplo, tratarse bajo condiciones de radiación ionizante, como imitar las condiciones de estrés de radicales.
En la figura 8 un equipo fotorreactor típico se muestra. El dispositivo permite la irradiación de los compuestos disueltos en el disolvente apropiado. Se compone de: i) la cámara de reacción equipado con la entrada para el gas inerte (en la parte inferior) y dos entradas para la salida del gas y para la adición reactivos; ii) una cámara interna que contiene la lámpara de mercurio adecuada conectada a un sistema de refrigeración y la energía eléctrica, que se inserta en la cámara de reacción a través de una junta de vidrio.
Figura 1. Mono-trans isómeros de linoleato de colesterilo y araquidonato.
Figura 2. Ésteres de colesterol en el suero humano y análisis directo de mono-trans isómeros por espectroscopia Raman.
Figura 3. El proceso de adición-eliminación que conduce a la isomerización cis-trans de los dobles enlaces por radicales thiyl.
Figura 4. Tres pasos para el desarrollo del protocolo de trans-mono ésteres de colesterol como marcador biológico del estrés de radicales libres.
Figura 5. La purina cuatro 5 ',8-2 ciclo-'-desoxirribonucleósidos diastereoisómeros. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 6. La generación de C5 'radicales, ya sea por fotólisis de 5 o mediante la reacción de 10 con radicales HO •, y el mecanismo de purina 5' ,8-cyclo-2 'formación desoxirribonucleósido. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 7. Protocolo de fo la identificación de algunas lesiones del ADN basado en radicales; ADNmt: ADN mitocondrial, ADNn: ADN nuclear.
Figura 8. Reactor fotoquímico.
La Figura 9. Espectro Raman representante de plasma de éster de colesterilo. En el recuadro de la comparación de una región específica con colesterilo y linoleato de colesterilo mono-trans isómeros de ácido linoleico.
Figura 10. Representante análisis GC de FAME obtenido a partir de ésteres de colesterol en plasma.
<strong> Figura 11. Representante HPLC ejecutar contiene 2'-desoxiadenosina y 2'deoxyguanosine junto con su oxidativo y purina 5 ',8-2 ciclo-'-deoxyribo nucleósidos. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Discussion
La conversión de origen natural cis ácidos grasos insaturados para geométrica trans isómeros es una transformación relacionada con la producción de estrés radical en el entorno biológico. Los lípidos de la membrana celular, que contienen ácidos grasos, son un objetivo importante para el estrés biológico radical y primero estudió la endógeno isomerización cis-trans fosfolípidos en cultivos celulares, animales y seres humanos la evaluación de protocolos de análisis en cada caso. 8-10 Hemos demostrado que esta transformación puede producirse por una variedad de compuestos que contienen S, incluyendo tioles, tioéteres y disulfuros, que bajo diferentes condiciones de estrés radicales son capaces de generar radicales thiyl, es decir, el agente de isomerización (Figura 3). El ejemplo mostrado en este artículo se centra en la clase de ésteres de colesterol, que representan una fracción conocida de los lípidos plasmáticos, estrictamente implicado en el metabolismo de lipoproteínas. El enlace de éster entre los ácidos grasos y choLesterol se biosintetiza por la transferencia de ácidos grasos a partir de la posición 2 del resto de glicerol de fosfatidilcolina con el colesterol, un paso catalizado por la enzima lecitina colesterol acil transferasa (LCAT). Por lo tanto, los ésteres de colesterol en plasma están estrictamente conectados con el recambio de lípidos de membrana, y contienen proporciones relativamente altas de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) típicamente presentes en las fosfatidilcolinas, es decir, linoleico y los ácidos araquidónico. Formación de lipoproteína está implicada en enfermedades cardiovasculares y metabólicas. La reactividad de los ésteres de colesterol naturales con los radicales libres puede ocurrir a los dobles enlaces de linoleato y residuos de ácido araquidónico, que se pueden transformar en los correspondientes isómeros geométricos trans (véase la Figura 1 para las estructuras). Caracterización del contenido de éster de colesterilo trans en muestras biológicas es interesante para el desarrollo de biomarcadores. Una metodología indirecta consiste en la transformación de cholesteryésteres l aislada del plasma en los correspondientes ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) y la separación por cromatografía de gases protocolos. En este caso, la calibración de las referencias estándar de cis y trans ésteres metílicos de ácidos grasos se lleva a cabo, a fin de permitir la cuantificación del contenido trans en las muestras. Basándose en los estudios analíticos realizados sobre la biblioteca de éster de colesterilo, se propone aplicar también un método basado en la espectroscopia de Raman, que puede llevarse a cabo directamente en la fracción de éster de colesterol aislado a partir de plasma, sin derivatización adicional a la FAME correspondiente (véanse las Figuras 2 y 9). Vale la pena señalar que hasta ahora no existen métodos exitosos se describen a cis y trans isómeros por separado de ácido graso que contienen lípidos por HPLC, como se describe en lugar de hidroperóxidos de éster de colesterilo. Hasta ahora, el método de cromatografía de gases indirecta sigue siendo el mejor método disponible hasta el momento. Por este método la primera evaluación cuantitativaación del contenido de mono-trans derivados de ésteres de colesterol aisladas de plasma de individuos sanos fue proporcionada. Uso de detector de ionización de llama (FID) el límite de detectabilidad es satisfactoria (ppb) y cantidades nanomolares de los compuestos han sido detectados. 5. Con diferentes sistemas de detección de este límite puede ser incluso reducido. El efecto de la radiación ionizante en los ésteres de colesterol es la materia de estudios adicionales, si una respuesta lineal se obtiene con respecto a la dosis aplicada.
Como un segundo ejemplo, elegimos nucleósidos modificados que pueden ser producidas por el daño de los radicales libres de ADN. Los radicales hidroxilo (HO •) se sabe que son las especies reactivas más dañinas de oxígeno (ROS) por su capacidad para provocar modificaciones químicas en el ADN. Lesiones únicas o múltiples pueden ocurrir en el ADN, que en las células eucarióticas se encuentran en el núcleo y las mitocondrias. Identificación y medición de las principales clases de oxidantes generados daños al ADN requiere el parámetro adecuadoIATE bibliotecas moleculares con el fin de establecer los protocolos analíticos. Nos hemos centrado nuestro interés en las lesiones más pequeñas en tándem, que son purina 5 ',8-ciclo-2'-desoxirribonucleósidos, que tiene un enlace covalente adicional entre la base y los restos de azúcar creado por el ataque de radicales libres. Los compuestos son 5 ',8-cyclo-2'-desoxiadenosina y 5 ',8-cyclo-2'-desoxiguanosina existente en los 5'R y 5'S formas diastereoméricas (Figura 5). Su potencial para convertirse marcador sin estrés radical es cuestión de la investigación fundamental. 2 En efecto, cuando el ADN está expuesto a HO • abstracción de hidrógeno radical de la posición C5 'del azúcar es uno de los posibles eventos que conducen a la formación de estas lesiones en tándem. Purina 5 ',8-cyclonucleosides puede ser medida como suma de diastereómeros mediante HPLC-MS/MS en muestras de ADN digeridos enzimáticamente γ-irradiadas van de 1 a 12 lesiones / 10 6 nucleósidos / Gy va ausencia forma de oxígeno a nivel fisiológico de oxígeno yon tejidos, la proporción diastereomérica 5'R / 5'S siendo ~ 4 ~ y 3 para 5 ',8-cdAdo y 5' ,8-cdGuo, respectivamente (Figura 11). 11 Vale la pena señalar que la relación entre la dosis de radiación y 5 ',8-cdAdo y 5' ,8-cdAdo lesiones detectadas en el ADN celular está lejos de ser comprendido. El experimento único, basado en la irradiación 2kGy informó en el experimental no pueden ser considerados concluyentes. 11 Otros experimentos de este tipo y cuantificación analítica de las cuatro lesiones son necesarios para definir dicha relación. La detección de estas lesiones y las transformaciones oxidativas más populares (tales como 8-oxo-2'-desoxiguanosina, 8-oxodGuo) son motivo de intensas investigaciones, lo que evidencia la importancia de las lesiones durante el metabolismo oxidativo. 6,13 El uso de HPLC -MS/MS (triple cuadrupolo) tiene un límite de detección cerca de 30fmol para todas las cuatro lesiones. Últimas mejoras son, al llegar a los límites de detección de los niveles de attomol por la produ instrumentoRCE. Basado en la literatura muy reciente, 6 procedimientos analíticos que incluyen la limpieza apropiada de la muestra y el enriquecimiento con el fin de cumplir con los límites de detección de la MS / MS / MS (trampa de iones) o de la MS / MS (triple cuadrupolo) utilizado en nuestro caso.
Bioinspirados procedimientos de síntesis de los compuestos 1-4 se desarrollaron a partir de derivados de 8-bromopurina bajo o fotólisis. 7,12 Estos procedimientos implican una reacción en cascada radical que imita el mecanismo de daño en el ADN de la formación de 5 ',8-cdAdo y 5' ,8-cdGuo lesiones. Desde las perspectivas biológica, se encontró que estas lesiones se acumulan con el envejecimiento en una manera específica de tejido (hígado> riñón cerebro>), proporcionando evidencia de que los mecanismos de reparación del ADN son inadecuados para preservar el material genético de estas lesiones. 13 De hecho, la reparación por escisión de nucleótidos (NER) es la única vía actualmente identificadas para la reparación de estas lesiones. 2
La clase de doses de compuestos que se muestran en las figuras 1 y 5 no están comercialmente disponibles en el momento, sin embargo por las estrategias sintéticas descritas en la literatura, no sería difícil de preparar estos compuestos para su uso comercial.
El enfoque multidisciplinar proporcionada por los estudios de biología química no sólo tiene un enorme valor en la identificación de nuevos mecanismos que ocurren en el ambiente biológico, pero también da un aporte fundamental para el descubrimiento de biomarcadores y diagnóstico, en última instancia, trayendo novedad en el cuidado de la salud y estrategias de prevención. 14 La contribución química es necesaria para un buen desarrollo de la medicina molecular, creando plataformas integradas y paneles para perfiles metabólicos que se espera para permitir una óptima racionalización de diseño de la intervención, ya sea terapéutico y nutricional, reduciendo las incertidumbres y fracasos cuando pueden ser predecible.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El apoyo financiero del Ministero dell'Istruzione, dell'Universita della Ricerca (PRIN-2009K3RH7N_002) y Marie Curie Intra-European Fellowship (CYCLOGUO-298555), así como el patrocinio de la Acción COST CM0603 en 'Radicales Libres en Biología Química y de la Acción COST CM1201 en "Química Biomimetic Radical" se agradece.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATERIALS | |||
| Cholesteryl linoleate ≥98% | Sigma-Aldrich | C0289-100 mg | |
| Cholesteryl arachidonate≥95% | Sigma-Aldrich | C8753-25mg | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250-100 ml | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | |
| Methanol 215 SpS | Romil | H409-2,5 L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Chloroform SpS | Romil | H135 2,5 L | |
| n-Hexane 95% SpS | Romil | H389 2,5 L | |
| Acetonitrile 230 SpS | Romil | H047 2,5 L | |
| Dichloromethane SpS | Romil | H2022,5 L | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 107344-1L | |
| Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
| Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966-1L | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| NaOH solid | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| NH4OH sol. 28%-30% | Sigma-Aldrich | 221228-1L-A | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | |
| Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride | Sigma-Aldrich | 221759-100G | |
| Ammonium Molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302-100G | |
| Sulfuric Acid 95%-98% | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | 209139-25G | |
| Sodium sulfate anhydrous | Sigma-Aldrich | 238597-500G | |
| Nuclease P-I from penicillium citrinum | Sigma-Aldrich | N8630-1VL | |
| Phosphodiesterase II type I-sa | Sigma-Aldrich | P9041-10UN | |
| Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc | Sigma-Aldrich | E114-25MG | |
| Phosphatase alkaline type VII-t from*bov | Sigma-Aldrich | P6774-1KU | |
| Phosphodiesterase I type VI | Sigma-Aldrich | P3134-100MG | |
| Deoxyribonuclease II type IV from*porcin | Sigma-Aldrich | D4138-20KU | |
| Trizma(r) base, biotechnology performanc ce | Sigma-Aldrich | T6066-100G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644-100G | |
| Succinic acid bioxtra | Sigma-Aldrich | S3674-250G | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670-100G | |
| Formic acid, 98 % | Sigma-Aldrich | 06440-100ML | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Millipore | UFC500324 | |
| 8-Bromo-2'-deoxyguanosine | Berry Associates | PR3290-1 g | |
| 8-Bromo-2'-deoxyadenosine | Berry Associates | PR3300-1 g | |
| Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
| Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
| 2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3899-CA-0.1 | |
| 2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3895-0.1 | |
| Nitrous oxide (N2O) | Air Liquide | ||
| Deoxyribonucleic acid from calf thymus | Sigma Aldrich | D4522-5MG | |
| EQUIPMENT | |||
| 60Co-Gammacell | AECL- Canada | 220 | |
| Immersion well reaction medium pressure 125 watts | Photochemical reactors ltd | Model 3010 | |
| Evaporating flask 250 ml | Heidolph | P/N NS 29/32 514-72000-00 | |
| Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm | Phenomenex | 00A-4252-E0 | |
| Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm | Grace | 88081 | Semipreparative |
| SecurityGuard Kit | Phenomenex | KJ0-4282 | Analytical holder kit and accessories |
| Holder for 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7220 | Semipreparative holder |
| 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7221 | |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1100 | |
| LC/MS/MS | Applied Biosystems | 4000QTRAP System | |
| Tandem mass ESI spectrometer | (Bruker Daltonics) | Esquire 3000 plus | |
| Vial 2-4 ml | SUPELCO | Cod 27516 | |
| Vial 4 ml | SUPELCO | Cod 27517 | |
References
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