Free Radicals in Chemical Biology: ab chemisches Verhalten, um Biomarker Entwicklung

Summary

Radical-basierte biomimetische Chemie hat zur Gebäude-up-Bibliotheken, die für Biomarker-Entwicklung angewendet.

Abstract

Die Einbeziehung von freien Radikalen in den Biowissenschaften hat ständig mit der Zeit erhöht, und hat zu mehreren physiologischen und pathologischen Prozessen in Verbindung gebracht. Dieses Thema umfasst verschiedene wissenschaftliche Bereiche, angefangen bei physikalischen, biologischen und Bioorganische Chemie, Biologie und Medizin, mit Anwendungen auf die Verbesserung der Lebensqualität, Gesundheit und Altern. Multidisziplinäre Fähigkeiten sind für die umfassende Untersuchung der vielen Facetten des radikalen Prozesse in der biologischen Umwelt und chemische Wissen spielt eine entscheidende Rolle bei der Enthüllung grundlegenden Prozesse und Mechanismen erforderlich. Wir entwickelten eine chemische Biologie Ansatz in der Lage, freie Radikale chemische Reaktivität mit biologischen Prozessen zu verbinden, die Informationen über die Reaktionswege und Produkte. Der Kern dieses Ansatzes ist das Design der biomimetischen Modellen Biomolekül Verhalten (Lipide, Nukleinsäuren und Proteine) in wässrigen Systemen zu studieren, erhalten Einblicke in die Reaktionswege sowie eins Aufbau molekularen Bibliotheken der radikalischen Reaktionsprodukte. Dieser Kontext kann erfolgreich zur Entdeckung von Biomarkern verwendet werden, und Beispiele sind mit zwei Klassen von Verbindungen bereitgestellt: mono-trans Isomeren von Cholesterylestern, welche synthetisiert und verwendet werden als Referenz für die Detektion im menschlichen Plasma und Purin 5 ',8-cyclo-2 '-Desoxyribonukleosiden, hergestellt und als Referenz in dem Protokoll für den Nachweis solcher Läsionen in DNA-Proben, nachdem ionisierende Strahlungen oder erhalten von verschiedenen Erkrankungen.

Introduction

Die Reaktivität von freien Radikalen zeigte seine enorme Bedeutung für viele biologische Vorgänge, einschließlich der alternden Gesellschaft und Entzündungen. Heutzutage ist es mehr und mehr deutlich, dass die Klärung der einzelnen chemischen Schritt in diese Reaktivität beteiligten benötigt wird, um die zugrunde liegenden Mechanismen und sehen wirksame Strategien zur Bekämpfung freier Radikale und Reparatur des Schadens zu verstehen. Der Beitrag aus der chemischen Studien ist von grundlegender Bedeutung, aber die direkte Untersuchung in der biologischen Umgebung kann schwierig sein, da die Überlagerung verschiedener Prozesse kompliziert und stört die Prüfung der Ergebnisse und die damit verbundenen Schlussfolgerungen. Deshalb hat sich die Strategie der Modellierung Radikalreaktionen unter biologisch verwandten Erkrankungen zu einem grundlegenden Schritt in der Erforschung der chemischen Mechanismen in der Biologie.

In den letzten zehn Jahren unserer Gruppe entwickelten Modelle der radikalischen Prozesse unter biomimetischen Bedingungen. Insbesondere haben wir envisaged biologisch relevanten Transformationen von ungesättigten Fettsäuren, Nukleoside und schwefelhaltigen Aminosäuren und sie in der Spur zu bewerten und als Biomarker für den Gesundheitszustand validiert werden. ^1-4

Unsere allgemeine Ansatz besteht aus drei Modulen:

• Organischen Synthese, die den Zugang zu entsprechend modifizierten Biomolekülen zur Verfügung stellt. Das synthetische Plan kann auch so ausgebildet sein, um die freie Radikale ablaufenden Prozesse in der biologischen Umgebung zu simulieren, damit die Anwendung von Bedingungen in der Lage, den biologischen Prozess von Interesse, die das Prinzip der biomimetischen Radikalchemie simulieren. In biomimetischen Modellen das Reaktionsmedium Wasser oder ein heterogenes Medium aufgrund der Koexistenz von hydrophilen und hydrophoben Kompartimenten. Der Vorteil mit biomimetischen Modellen arbeiten, ist eine vereinfachte Umgebung mit bekannten Reaktionspartner, wo Reaktivität und Produkte in mehr Details untersucht werden können, haben, möglicherweise entdeckenneue chemische Wege. Von diesem Schritt mechanistische und kinetische Informationen können gesammelt werden;
• Reinigung, Analyse und Charakterisierung der Produkte, eine strukturelle und chemische Daten der modifizierten Biomolekülen um molekularen Bibliotheken anzuordnen und zu erleichtern recognition.in die komplexeren biologischen Umgebung. Protokolle werden auch im Hinblick auf die Lösung komplexe Mischungen von Verbindungen, wie die aus biologischen Proben abgeleitet etabliert;
• Biomarker-Entwicklung mit biologischen Proben, entweder durch in vitro Experimente mit Zellkulturen und in vivo Studien von Tieren und Menschen. Die Protokolle in biomimetischen Modelle entwickelt werden dann der komplexe Analysen von Proben angewendet, um die freien Radikale Transformationen unter verschiedenen Bedingungen vorstellbar. Molecular Libraries durch Synthese entwickelten eine enorme Hilfe, um Life-Science-Entdeckungen. Die gesammelten Informationen auf dem freien radikalen Transformationen give die Möglichkeit, herauszufinden, Reparatur-und Präventionsstrategien. Datenbanken der Ergebnisse kann eine sorgfältige Beurteilung durch multivariate Analyse der Biomarker Bedeutung so gut wie möglich assoziierten Faktoren verwendet werden.

Wir entschieden uns für zwei Klassen von relevanten Biomarkern, diesen Ansatz zu akkreditieren: Cholesterylestern und Purin 5 ',8-cyclo-2'-Desoxyribonukleoside.

Protocol

Ein. Synthese von Mono-trans-Isomere von Cholesterylestern

1. Aufzulösen Cholesterylestern (Linoleat oder Arachidonat Cholesterylester) in 2-Propanol (15 mM). Zum besseren Solubilisierung wurden die Proben für 15 Minuten unter Argon mit Ultraschall behandelt.
2. Die Lösung wird in einem Quarz-photochemischen Reaktor, add 2-Mercaptoethanol in 2-Propanol (bis 7 mM Konzentration zu erreichen, von einer 2 M Stammlösung des Thiol). Spülen der Reaktionsmischung mit Argon für 20 min, um die Anwesenheit von Sauerstoff in der Lösung zu beseitigen.
3. Bestrahlen der Reaktionsmischung mit UV-Licht unter Verwendung einer niedrigen 5.5W Quecksilberhochdrucklampe bei 22 ± 2 ° C für 4 min. Monitor durch analytische Ag-TLC (Silber-Dünnschichtchromatographie) zum Nachweis der Bildung der mono-trans Cholesterylestern (siehe Abbildung 1 für die chemische Formeln). Die TLC-Färbung erfolgt durch Gießen der Platte in der Cer-Ammonium molibdate (CAM)-Lösung durchgeführt, und die Flecken beim Erhitzendie Platte. Die Reaktion wird in einem frühen Stadium, um das Ausgangsmaterial, das wiederverwendet zu anderen Runden der Isomerisierung, Erhalten einer Erhöhung der Gesamtausbeute durchführen kann erholen.
4. Sammeln das Reaktionsgemisch in einem Rundkolben, Waschen der Apparatur mit einigen ml 2-Propanol. Entfernen des Lösungsmittels und Reinigung der Mono-trans Isomeren von Cholesterylestern durch Ag-TLC wie in der Literatur beschrieben. ⁵ Verwendung Hexan-Diethylether (9:1 v / v) als Eluens für Mono-trans Isomeren Cholesteryl-Linoleat, wohingegen die Verwendung Hexan -Diethylether-essigsäure (9:1:0,1 v / v) für Mono-trans Cholesteryl Arachidonat Isomere.

2. Isolation von Cholesterylestern Fraktion aus menschlichem Serum

1. Verdünnte 1 ml Humanserum (erhalten durch Zentrifugation des Blutes) mit 1 ml Kochsalzlösung und die Lösung in einem Scheidetrichter unter einem Argonstrom um Artefakte (zB Oxidation Addukte) zu vermeiden. 10 ml Chloroform-Methanol (2: 1 v / v) dreimal. Schütteln den Scheidetrichter nur langsam um die Bildung der Emulsion durch die Gegenwart von Albumin zu begrenzen.
2. Wäscht die organischen Schichten einmal mit Kochsalzlösung (10 ml), dann in einem Erlenmeyerkolben sammeln unter einem Argonstrom, über wasserfreiem Natriumsulfat. Entfernen von flüchtigen Rotationsverdampfer zu einem gelben Öl (gesamten Plasma Lipidfraktion) zu ergeben.
3. Aufnahme der rohen mit 1 ml Chloroform-Methanol (2:1 v / v), Last auf eine präparative TLC unter einem Strom von Argon und eine Mischung aus Hexan-Diethylether (9:1 v / v) als Eluens . Abkratzen Kieselsäure enthaltenden Abschnitt der Cholesterylester Fraktion und gießen Sie in einem Fläschchen. Dann extrahiert Siliciumdioxid (3 × 5 ml) mit Chloroform-Methanol (2:1 v / v), sammeln die organischen Schichten und Entfernen des Lösungsmittels nach dem Eindampfen das reine Fraktion von Cholesterylestern (normalerweise ~ 1,5 mg) zu ergeben.
4. Halten Cholesterylestern in einer dunklen Glasflasche mit Aluminiumfolie unter Argon und speichern abgedeckt bei -20 ° C. Cholesteryl esters sind empfindlich gegenüber Licht und Sauerstoff.

3. Charakterisierung von Mono-trans Cholesterylestern durch Raman-Spektroskopie

1. Auszug Cholesterylestern aus menschlichem Serum (≥ 0,7 mg), wie in Abschnitt 2 beschrieben, in einer kleinen Menge von Tetrachlorkohlenstoff (≤ 10 ul) und in einem Fläschchen aufzulösen. CCl ₄ als Lösungsmittel gewählt, weil seine Raman-Signal nicht mit dem Bereich von Interesse von Cholesterylester Analyse überlappen.
2. Die Lösung wird in den Probenhalter durch einen Einweg Glaspipette, dann vorsichtig das Lösemittel durch einen langsamen Strom von Argon. Sobald eine gleichmäßige öligen Film auf der Innenwand des Probenhalters ausgebildet ist, versetzen die letztere in das Instrument für die Messung.
3. Fouriertransformiert Ramanspektrum von Cholesterylestern direkt auf der Lipidextrakte ohne Derivatisierungsreaktion erzielt. Die Laserleistung auf der Probe <100 mW zu Probe zu vermeiden. Die Gesamtzahl von Abtastungenfür jedes Spektrum ist ≥ 800 um das Hintergrundrauschen zu minimieren.
4. Die 1,700-1,630 cm ^-1 des Raman-Spektrums analysiert wird, da sie die Abgabe auf die C = C-Doppelbindungen im Molekül (C = C-Streckschwingung) spiegelt. Eine Kurvenanpassung Analyse basiert auf diesem Gebiet durchgeführt, wodurch die Unterscheidung der überlagerten Beiträge von cis-und trans-Doppelbindungen in der Fettalkylkette und Doppelbindung im Ring B von Cholesterin (siehe Abbildung 2).
5. Um richtig die Banden passen, sollten einige Parameter fest oder eingeschränkt in vernünftigen Grenzen. Die Komponente Peakprofile werden als eine lineare Kombination von Lorentz-und Gauß-Funktionen beschrieben, während die halbe Höhe Bandbreiten besten durch den Computer Optimierungsroutine ermittelt werden. Die Anzahl und die Position der Komponente Peaks werden durch Verwendung des vierten Ableitungsspektren, die auch erkennen einige schwache Komponente Bands erlauben erhalten. Da das SignalRausch-Verhältnis das auf Differenzierung des Signals verschlechtert können die Verwendung des vierten Derivat auszuschließen, geglättet vierte Derivate mit einer Dreizehn-Punkt Savitsky-Golay-Funktion, von Vorteil; somit ein Kompromiss zwischen der rechten Auflösung und des Signal-Rausch-Verhältnis erhalten wird . Beste Kurvenanpassung auf der niedrigsten möglichen c ² erhaltenen Werte.
6. Die Anwesenheit von trans-Isomere wird durch die Komponente bei 1671 ± 1 cm ^-1 zusätzlich zu zumindest die beiden Komponenten, leicht zu niedrigeren Frequenzen hin verschoben wird, aufgrund der Fettsäurekette und Cholesterin C = C-Doppelbindungen offenbart. Repräsentative Ramanspektrum von Plasma Cholesterylester ist in 9 gezeigt. Im Einschub der Vergleich einer bestimmten Region mit Cholesteryl-Linoleat und Mono-trans Cholesteryl Linolsäureisomeren gezeigt.

4. Derivatisierung zu Fatty Acid Methylester (FAME) und Analyse mittels Gaschromatographie

1. AuflösenCholesterylestern (~ 1,5 mg) mit 0,5 ml einer 1 M Lösung von Natriumhydroxid in Methanol-Benzol (2:3 v / v) und in einen dunklen Fläschchen durch Aluminiumfolie unter Argon abgedeckt.
2. Lassen Sie die Mischung unter Rühren bei Raumtemperatur und Monitor durch DC unter Verwendung einer Mischung von Hexan-Diethylether (9:1 v / v) als Eluens. Reaktionsdauer beträgt üblicherweise 30 Minuten Reaktion aber eine sorgfältige Überwachung erforderlich. In der Tat, wenn die entsprechenden Methylester gebildet werden, muß die Reaktion abgeschreckt, um die Bildung von Abbau-und Nebenprodukten zu vermeiden. TLC zeigten die quantitative Bildung von Methylestern.
3. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 ml Kochsalzlösung und extrahiert Methylester mit n-Hexan (3 × 2 ml). Sammeln der organischen Schichten in eine Phiole und Entfernen des Lösungsmittels durch Rotationsverdampfung um den Methylester Fraktion, die dann für die GC-Analyse wird ohne weitere Reinigung verwendet leisten.
4. Man löst die Methylester in der Mindestmenge n-Hexan (üblicherweise 1 mg in 50 ul) und injizieren im GC mit einer 60 m × 0,25 mm × 0,25 um (50%-Cyanopropyl)-Methylpolysiloxan Kolonnenkopf ausgestattet. Verwenden einen Flammenionisationsdetektor (FID) mit folgendem Programm Ofen: Temperatur Beginn bei 165 ° C für 3 min, durch Erhöhung von 1 gefolgt halten ° C / min bis zu 195 ° C, für 40 min, gefolgt von einer zweiten halten Erhöhung von 10 ° C / min bis zu 240 ° C und für 10 min halten. Ein konstanter Druck-Modus (29 psi) ausgewählt wird. Helium oder Wasserstoff als Trägergas verwendet werden. Methylester werden durch Vergleich mit den Retentionszeiten von authentischen Proben identifiziert. Abbildung 10 zeigt eine repräsentative GC-Analyse der FAME aus dem Plasma Cholesterylestern erhalten.

5. Synthese von (5'R) - und (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-desoxyadenosin

1. Man löst 33 mg 8-Brom-2'-desoxyadenosin (8-Br-DADO) in Acetonitril (100 ml), um 1 mM Konzentration erreichen. Regeln Gasstrom (Ar oder N2) im Photoreaktor und füllen den apparatus mit der Lösung von 8-Br-DADO.
2. Vorbereiten eines Septums mit der entsprechenden Größe für die Eingangs-und Photoreaktor passieren eine Nadel, die mit dem Inertgas Linie durch die Mitte davon. Schließen Sie das System mit dem Septum. Spülen des Inertgases für 30 min.
3. Strahlen durch UV-Licht mit einer 125W Quecksilber-Mitteldruck-Lampen bei 22 ± 2 ° C für 15 min, sammeln die Lösung in einem 250 ml-Rundkolben. Waschen Sie den Photoreaktor mit 10 ml Acetonitril und sammeln Waschungen in der gleichen Flasche.
4. Quench das rohe Reaktionsgemisch mit 1 M NH ₄ OH-Lösung und dampft das Lösungsmittel im Rotationsverdampfer.
5. Führen Hochleistungsflüssigchromatographie-Analyse (HPLC-UV) mit Trennsäule (siehe Instrumentierung Abschnitt) unter bekannten Bedingungen und vergleichen das Profil mit Referenz-Verbindungen.
6. Führen Hochleistungsflüssigchromatographie-Analyse (HPLC-UV) mit einer analytischen Säule (siehe Instrumentierung Abschnitt) mithilfe der folgenden solLüftungsschlitze und Steigungen: 2 mM Ammoniumformiat als Lösungsmittel A und Acetonitril als Lösungsmittel B. Setzen Sie die Flussrate auf 1 ml / min und der Gradient von 0% Lösungsmittel B bis 0,3% Lösungsmittel B in 2,2 min erreicht werden. Dann wurden 0,8% Lösungsmittel B in in 4,0 min, dann 1% Lösungsmittel B in 4,8 min. Unverändert auf 1% Lösungsmittel B für 9 min und dann bis 8% Lösungsmittel B in 6 min. Nach gehe zu 10% Lösungsmittel B in 4 min und 30% Lösungsmittel B in 5 min und bleiben bei 30% Lösungsmittel b für andere 5 min. Sammeln der chromatographischen Peaks, die den beiden diastereomeren Produkte in zwei verschiedene Ampullen.
7. Die Extinktion der beiden gesammelten Fraktionen im UV-Spektrophotometer und berechnen die exakte Konzentration auf der Lamber-Beer-Gesetz (A = εlC, wobei A die Extinktion der Extinktionskoeffizient ε und l die Länge der Zelle) basiert. Verwenden Sie die Extinktionskoeffizienten ε von 2'-Desoxyadenosin (Dado) (15.400 M ^-1 cm ^-1 bei 260 nm).

6. Synthese von (5'R) - eind (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-Desoxyguanosin

1. Man löst 35 mg 8-Brom-2'-desoxyguanosin (8-Br-dGuo) und 30 mg Natriumiodid (NaI) in destilliertem Wasser (100 ml) um 1mm und 2mm Konzentration zu erreichen sind. Regulate Inertgas (Ar oder N ₂₎ fließen mit dem Photoreaktor und füllen Sie den Photoreaktor mit der Reaktionslösung.
2. Entgasen das Reaktionsgemisch wie in Verfahren 5 beschrieben (Schritt b).
3. Durch UV-Licht bestrahlt Verwendung einer 125W-Mitteldruck-Quecksilberlampe bei 22 ± 2 ° C für 30 min, sammeln die Lösung in einem 250 ml Rundkolben. Waschen Sie den Photoreaktor mit 10 ml Wasser und sammeln Waschungen in der gleichen Flasche.
4. Quench das rohe Reaktionsgemisch mit 1 M NH ₄ OH-Lösung und dampft das Lösungsmittel im Vakuum.
5. Führen Analyse wie in Prozedur 5 beschrieben (Schritte e bis g). Verwenden Sie die Extinktionskoeffizienten ε von 2'-deoxyguanosine (dGuo) (11.700 M ^-1 cm ^-1 bei 260 nm).

7. Synthese von Isotopen markiertes Purine (5'R) - und (5'S) -5 ',8-cyclonucleosides

1. Planen 2 ml 1 mM wässrige Lösung (destilliertes Wasser) von den ¹⁵ N Isotopen markierten Purinnukleoside ([15N ^5] DADO oder [15N ^5] dGuo) in einem Glasfläschchen (4 ml) mit einem Septumverschluss.
2. Schließen Sie das Fläschchen mit dem Septum und an der Gasleitung (N ₂ O für die Sättigung der Lösung) durch eine Nadel in der Scheidewand, die den Boden des Fläschchens erreicht. Eine weitere kurze Nadel im Septum arbeitet als Gasaustritt.
3. Spülen Sie die Lösung mit N ₂ O für 30 min. Der Gasstrom wird so reguliert, sehr gering sein.
4. Die Ausfahrt Nadel ersten herausgenommen und nach 1 'der Lange folgt, um einen kleinen Druck im Inneren des Fläschchens haben.
5. Setz die Lösung in der Vorrichtung von gamma Radiolyse für 8 h (Berechnung auf der Grundlage einer Dosisrate ca. 4,5 Gy / min).
6. Nach der Reaktion zu stillen das Rohprodukt mit 1 M NH ₄
7. Führen Hochleistungsflüssigchromatographie-Analyse (HPLC-UV) unter bekannten Bedingungen, ⁶ und vergleichen Sie das Chromatogramm mit den Standard-Referenzen.

8. Gamma Radiolyse von DNA wässrigen Lösungen

1. Bereiten Sie 1 ml von 0,5 mg / ml Lösung (destilliertes Wasser) von Kalbsthymus-DNA und in einem Glasfläschchen (2 ml) mit einem Septum.
2. Entgasen die Reaktion nach Verfahren 7 beschrieben (Schritte bd).
3. Setz die Lösung in der Vorrichtung von gamma Radiolyse und 30 min (Berechnung auf der Basis der Dosis / Rate ca.. 4,5 Gy / min).

9. Enzymatische Verdauung von DNA

1. In ein Eppendorf-Röhrchen, enthaltend 80 ug DNA, fügen 8 U von Nuklease P1, 0,01 U von Phosphodiesterase II, 20 nmol EHNA in 20 ul 300 mM Natriumacetat (pH 5,6) und 10 mM Zinkchlorid. Inkubieren der Mischung bei 37 ° C für 48 Stunden.
2. Als nächstes fügen Sie eine Mischung aus 8 U alkalischer Phosphatase, 0,02 U phosphodiesterasE I, in 40 ul 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,9) zu Mischung Verdauung. Die Probe wird bei 37 ° C für 2 Stunden inkubiert.
3. Das Gemisch wird durch Zugabe von 10% iger Ameisensäure neutralisiert.
4. Übertragung der Probe auf eine Amicon Ultra-0.5 Zentrifugalfilter Vorrichtung (cutoff 3 kDa), 200 ul tridestilliertem H ₂ O. Legen Sie die Ultra-Filter in den Zentrifugenrotor bei 14.000 xg für 15 min. Dann trennen Sie die Ultra Filter Gerät aus der Mikrozentrifugenröhrchen. Lyophilisieren das Enzym-freie Lösung im Mikrozentrifugenröhrchen.

10. DNA-Probe Entsalzung vor der Analyse

1. Führen Hochleistungsflüssigchromatographie-Analyse (HPLC-UV) mit Trennsäule (siehe Instrumentierung Abschnitt) nach bekannten Bedingungen. ⁶
2. Lösen des lyophilisierten verdaute DNA in 20 ul H ₂ O und injizieren in HPLC-UV.
3. Sammeln der Probe in einem Fläschchen nach dem Salzelution (erste Minuten) und gerade vor der Elution time des ersten Nucleosids (5'R-cdGuo), bis zum Ende des chromatographischen Programm.
4. Die Probe wird lyophilisiert und resolubilisiert in 20 ul Wasser.

11. LC-MS/MS Quantitative Analysis

1. Bereiten Sie die HPLC-MS/MS (Triple-Quadrupol), bevor die Analyse durch das Laden der analytischen Methode und das Verfahren für den MS-Detektor (ESI). ⁶
2. Fügen Sie 1 ul der Isotopen-markierten Verbindungen Mischung in der Probe im Verfahren 7 vorbereitet.
3. Inject 20 ul der spiked verdaut DNA-Lösung in destilliertem Wasser.
4. Die erhaltenen chromatographischen Daten werden auf der Grundlage der bisherigen Kalibrierung mit Referenz-Verbindungen erarbeitet. Eine repräsentative HPLC laufen mit Adenosin und Guanosin-2'-Desoxyribonukleoside und ihre oxidative und Cyclo-Derivaten ist in Abbildung 11 dargestellt.

Representative Results

Isomerisierungsverfahren wurde insbesondere für Cholesterylestern Plombierung die Mono-trans Isomeren von Linolsäure und Arachidonsäure in 1 als den ersten Produkten dieses Angriffs gezeigt, die unter Bedingungen der radikalischen Spannung in der biologischen Umgebung auftreten beschrieben. ⁵

In Abbildung 3 ist die chemische Mechanismus in der cis-trans Doppelbindungsisomerisierung beteiligt gezeigt. Die radikale Quelle wird in einer generischen Weg zur S-zentrierte Radikale leisten angegeben. In den beschriebenen Protokolle der radikale Quelle ist UV-Licht, können homolitically brechen die SH-Bindung in der Thiol-Molekül RSH ist.

Abbildung 4 fasst die drei Schritte Protokoll für die Synthese des modifizierten Lipidklasse und ihr Nachweis im menschlichen Plasma: Die Synthese stellt eine biomimetische freie Radikale Prozess und bietet auch eine Ein-Topf komfortable Eingabe der geometrischenrische Isomere, ohne Verunreinigung durch Stellungsisomere gefolgt von Reinigung und Isolierung Protokolle.

Mehrere analytischen Methoden können für eine hochempfindliche Nachweis des trans Isomerengehalt und Charakterisierung des Mono-trans Cholesterylester Bibliothek angewendet werden. Insbesondere kann der Raman-Spektroskopie direkt auf dem Cholesterylester Bruchteil durchgeführt werden, ohne Derivatisierung (siehe Abbildung 2 und Abbildung 9).

Das zweite Beispiel betrifft Purin 5 ',8-cyclo-2'-Desoxyribonukleosiden, die DNA-Läsionen durch den Angriff freier Radikale auf die Position C5 'des Zuckerteils und anschließende Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Zucker und der Basis geschaffen sind Reste. Vier Strukturen hergestellt werden können, das heißt, 5 ',8-cyclo-2'-desoxyadenosin und 5'-,8-cyclo-2 '-Desoxyguanosin, sowohl in den bestehenden 5'R und 5'S diastereomeren Formen (Abbildung 5). In Abbildung 6 ter Reaktionsmechanismus gezeigt wird, beinhaltet, dass die Photolyse von 8-bromopurine Derivate 5 zu den entsprechenden C8 Radikal 6, das intramolekular abstrahiert ein Wasserstoffatom von der C5-Position selektiv BIETEN die 2'-deoxyadenosin-5'-yl-Rest 7. Radical 7 cyclisiert mit einer Geschwindigkeitskonstante im Bereich 10 ⁵ -10 ⁶ s ^{-1, 2,} gefolgt von Oxidation des Heteroaromat 8 geben die Endprodukte ^9. Die Reaktion von Hydroxyl-Radikalen, durch Radiolyse von Wasser erzeugt, mit 2'-Desoxyadenosin, 2'-Desoxyguanosin (10) wurde gefunden, dass ca. auftreten. 10% Wasserstoff-Abspaltung aus C5-Position. ⁷

Unser Ansatz zur chemischen Biologie der Bibliotheken von Purin 5 ',8-cyclo-2'-Desoxyribonukleosiden (einschließlich markierte Verbindungen) ist in Abbildung 7 dargestellt, mit der Identifizierung dieser Läsionen in Oligonukleotide sowie in DNA-Proben aus va erhalteneschiedenen Quellen, wie sie beispielsweise unter ionisierender Strahlung Bedingungen behandelt, wie imitieren radikaler Stressbedingungen.

In Abbildung 8 ein typisches Photoreaktor Gerät sichtbar ist. Das Gerät erlaubt die Bestrahlung von Verbindungen in dem entsprechenden Lösungsmittel gelöst. Es besteht aus: i) der Reaktionskammer mit dem Einlass für das Inertgas (unten) und zwei Einlässe für den Gasaustritt sowie für die Reagenzien zusätzlich ausgestattet, ii) eine innere Kammer, die die geeignete Quecksilberlampe an ein Kühlsystem angeschlossen und die elektrische Leistung, die in die Reaktionskammer durch einen Glasfuge eingesetzt ist.

Abbildung 1. Mono-trans-Isomere von Cholesteryl Linoleat und Arachidonat.

Abbildung 2. Cholesterylestern in humanem Serum und direkte Analyse für Mono-trans Isomeren durch Raman-Spektroskopie.

Abbildung 3. Die Additions-Eliminierungs-Prozess, der führt zum cis-trans-Isomerisierung von Doppelbindungen durch Thiylradikale.

Abbildung 4. Drei Schritte-Protokoll für die Entwicklung von Mono-trans Cholesterylestern als Biomarker von freien Radikalen Stress.

Abbildung 5. Die vier Purin 5 ',8-cyclo-2'-Desoxyribonucleosid Diastereoisomere. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 6. Erzeugung C5 'Reste, entweder durch Photolyse von 5 oder durch Umsetzung von 10 mit HO • Radikale, und dem Mechanismus der Purin 5' ,8-cyclo-2 'Desoxyribonucleosid Formation. Klicke hier größere Figur anzuzeigen .

Abbildung 7. Protokoll foder Identifizierung von einigen radikalen-basierten DNA-Läsionen; mtDNA: mitochondriale DNA, nDNA: nuclear DNA.

Abbildung 8. Photochemischen Reaktor.

Abbildung 9. Repräsentative Ramanspektrum von Plasma Cholesterylester. Im Einschub dem Vergleich einer bestimmten Region mit Cholesteryl-Linoleat und Cholesteryl Mono-trans Linolsäureisomeren.

Abbildung 10. Vertreter GC-Analyse der FAME aus dem Plasma Cholesterylestern erhalten.

<strong> Abbildung 11. Repräsentative HPLC laufen mit 2'-Desoxyadenosin und 2'deoxyguanosine zusammen mit ihren oxidative und Purin 5 ',8-cyclo-2'-Desoxyribo Nucleoside. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Discussion

Die Umwandlung der natürlich vorkommenden cis ungesättigten Fettsäuren auf geometrische trans-Isomere ist eine Transformation mit der Produktion von radikalen Spannung in der biologischen Umgebung verbunden. Zellmembran Lipide, die Fettsäuren enthalten, sind ein relevanter biologische Zielstruktur für radikale Stress und wir zuerst die endogenen cis-trans-Isomerisierung Phospholipide in Zellkulturen, Tieren und Menschen Beurteilung analytische Protokolle in jedem Fall. ^8-10 Wir haben gezeigt, dass diese Transformation kann durch eine Vielzahl von S-haltige Verbindungen, darunter Thiole, Thioether und Disulfide, die unter verschiedenen Rest Stressbedingungen können Thiylradikalen erzeugen, dh das Isomerisieren Mittel (Figur 3) eintreten. Das Beispiel in diesem Artikel gezeigt, konzentriert sich auf die Klasse von Cholesterylestern, die einen bekannten Bruchteil Plasmalipide, streng in Lipoprotein-Metabolismus beteiligt repräsentieren. Die Esterbindung zwischen Fettsäuren und choCholesterin wird durch die Übertragung von Fettsäuren von der Position 2 des Glycerineinheit von Phosphatidylcholin zu Cholesterin, ein Schritt durch das Enzym Lecithin Cholesterin Acyl Transferase (LCAT) katalysiert biosynthetisiert. Daher werden Plasma Cholesterylestern strikt Membranlipid Umsatz verbunden und enthalten relativ hohe Anteile an mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) typischerweise in Phosphatidylcholinen, dh Linolsäure und Arachidonsäure. Lipoprotein Bildung wird in kardiovaskulären und metabolischen Erkrankungen beteiligt sind. Die Reaktivität von natürlichen Cholesterylestern mit freien Radikalen kann an den Doppelbindungen Linoleat und Arachidonat-Reste, die in den entsprechenden trans geometrische Isomere umgewandelt werden (siehe Abbildung 1 für die Strukturen) auftreten. Charakterisierung des trans Cholesterylester Gehalt in biologischen Proben ist interessant für Biomarkerentwicklung. Eine indirekte Methode besteht aus der Umwandlung von cholesteryl Ester aus Plasma zu den entsprechenden Fettsäure-Methylester (FAME) und Abtrennung durch gaschromatographische Protokollen isoliert. In diesem Fall wird die Kalibrierung der Standardwerken der cis-und trans-Fettsäuremethylester durchgeführt, um die Quantifizierung der trans-Gehalt in den Proben zu erlauben. Basierend auf den analytischen Studien über die Cholesterylester-Bibliothek durchgeführt wird, haben wir vorgeschlagen, um auch dann eine Methode auf Basis von Raman-Spektroskopie, die durchgeführt werden können direkt auf der Cholesterylester Fraktion aus Plasma isoliert durchgeführt, ohne weitere Derivatisierung zur entsprechenden FAME (siehe Abbildungen 2 und 9). Es ist erwähnenswert, dass bis heute keine erfolgreiche Methoden zu trennen cis-und trans-Isomere der Fettsäure mit Lipiden durch HPLC, wie stattdessen durch Cholesterylester Hydroperoxide beschrieben werden beschrieben. Bisher ist die indirekte Methode der Gaschromatographie immer noch die beste verfügbare Methode so weit. Nach diesem Verfahren der erste quantitative evaluiertation des Mono-trans-Gehalt von Cholesterylestern aus Plasma von gesunden Probanden isoliert abgeleitet bereitgestellt. Mit Flammenionisationsdetektor (FID) die Grenze der Nachweisbarkeit ist zufriedenstellend (ppb) und nanomolaren Mengen der Verbindungen nachgewiesen wurden. ^5. Mit verschiedenen Detection-Systeme kann diese Grenze sogar gesenkt werden. Die Wirkung von ionisierender Strahlung auf Cholesterylestern ist Materie weiterer Studien, ob ein lineares Ansprechverhalten relativ zu der applizierten Dosis erhalten wird.

Als ein zweites Beispiel, wählten wir modifizierten Nukleoside, die durch freie Radikale verursachten Schäden der DNA erzeugt werden kann. Hydroxylradikale (HO •) sind dafür bekannt, die meisten schädlichen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auf ihre Fähigkeit zur chemischen Modifikationen an DNA verursachen. Einzelne oder mehrere Läsionen können auf DNA vorkommen, dass in eukaryotischen Zellen ist in Kern und Mitochondrien. Identifizierung und Messung der wichtigsten Klassen von oxidative erzeugten Schäden an DNA erfordern die approprIATE molekularen Bibliotheken, um die Einrichtung der analytischen Protokolle. Wir konzentrieren uns auf den kleinsten Interesse Tandem Läsionen, die Purin 5 sind ',8-cyclo-2'-Desoxyribonukleosiden, mit einem zusätzlichen kovalenten Bindung zwischen der Basis und der Zuckerreste durch den Angriff freier Radikale erzeugt. Die Verbindungen sind 5 ',8-cyclo-2'-desoxyadenosin und 5'-,8-cyclo-2 '-desoxyguanosin in den bestehenden 5'R und 5'S diastereomeren Formen (Abbildung 5). Ihr Potenzial zur freien Radikalen Stress-Marker geworden ist Sache der Grundlagenforschung. ² der Tat, wenn DNA HO ausgesetzt ist • radikalen Wasserstoff-Abspaltung aus C5-Position des Zuckers ist eine der möglichen Ereignisse, die zur Entstehung dieser Tandem-Läsionen. Purin 5 ',8-cyclonucleosides kann als Summe von Diastereomeren durch HPLC-MS/MS in enzymatisch verdaut γ-bestrahlten Proben DNA Variieren 1 bis 12 Läsionen / 10 ⁶ Nukleoside / Gy messenden gehen Form in Abwesenheit von Sauerstoff zu physiologischen Niveau von Sauerstoff ichn Gewebe, das Diastereomerenverhältnis 5'R / 5 Seins ~ 4 und ~ 3 für 5 ',8-cdAdo und 5' ,8-cdGuo bzw. (Abbildung 11). ¹¹ Es ist erwähnenswert, dass die Beziehung zwischen Strahlendosis und 5 ',8-cdAdo und 5' ,8-cdAdo Läsionen in der zellulären DNA nachgewiesen ist bei weitem nicht verstanden. Die einzigen Experiment auf 2kGy Bestrahlung basiert berichtet in der experimentellen kann nicht als schlüssig angesehen werden. ¹¹ Weitere Versuche dieser Art und analytische Quantifizierung der vier Läsionen sind für die Festlegung solcher Zusammenhang. Der Nachweis dieser Läsionen und die populäreren oxidativen Transformationen (z. B. 8-oxo-2'-desoxyguanosin, 8-oxodGuo) sind Gegenstand intensiver Untersuchungen, ausweisend die Bedeutung beider Läsionen während oxidativen Stoffwechsels. ^6,13 Die Verwendung von HPLC -MS/MS (Triple-Quadrupol) eine Nachweisgrenze nahe 30fmol für alle vier Läsionen. Letzte Verbesserungen behauptet Nachweisgrenzen attomol Ebenen durch das Instrument produ erreichenCERs. Basierend auf der jüngsten Literatur, haben ⁶ analytischen Verfahren zur ordnungsgemäßen Reinigung der Probe und Bereicherung sind, um die Nachweisgrenzen des MS / MS / MS (ion trap) oder des MS / MS (Triple-Quadrupol) verwendet zu erfüllen in unserem Fall.

Bioinspirierte Syntheseverfahren der Verbindungen 1-4 wurden entwickelt ausgehend von 8-Derivate unter bromopurine oder Photolyse. ^7,12 Diese Verfahren beinhalten einen Rest Kaskadenreaktion, die DNA-Schäden Mechanismus der Bildung von 5 nachahmt ',8-cdAdo und 5' ,8-cdGuo Läsionen. Aus biologischen Perspektiven, wurde festgestellt, dass diese Läsionen mit zunehmendem Alter bei einer Gewebe-spezifischen Art und Weise (Leber> Niere> Gehirn) ansammeln, was beweist, dass DNA-Reparaturmechanismen unzureichend, um das genetische Material aus dieser Läsionen zu bewahren sind. ¹³ Tatsächlich Nukleotidexzisionsreparatur (NER) ist der einzige Weg zur Zeit für die Reparatur dieser Läsionen identifiziert. ²

Die Zwei-Klassen-es von Verbindungen in den Abbildungen 1 und 5 dargestellt sind nicht im Handel verfügbar im Moment, aber von den Synthesestrategien in der Literatur beschrieben wäre es nicht schwierig sein, diese Verbindungen für den kommerziellen Einsatz vorbereiten.

Der multidisziplinäre Ansatz von chemisch-biologische Studien zur Verfügung gestellt hat nicht nur einen enormen Wert in der Identifikation von neuen Mechanismen vorkommende in der biologischen Umgebung, sondern gibt auch einen wesentlichen Beitrag zur Entdeckung neuer Biomarker und Diagnostik, letztendlich bringt Neuheit im Gesundheits-und Präventionsstrategien. ¹⁴ Der chemische Beitrag wird für eine erfolgreiche Entwicklung der molekularen Medizin benötigt, Schaffung integrierter Plattformen und Platten für Metabolic Profiling, die voraussichtlich für eine optimale Rationalisierung der Intervention Design, entweder therapeutische und Ernährung, wodurch Unsicherheiten und Fehler, wenn sie sein können vorhersehbare ermöglichen werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATERIALS
Cholesteryl linoleate ≥98%	Sigma-Aldrich	C0289-100 mg
Cholesteryl arachidonate≥95%	Sigma-Aldrich	C8753-25mg
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M6250-100 ml
2-propanol	Sigma-Aldrich	34965-1L
Methanol 215 SpS	Romil	H409-2,5 L
Ethanol	Sigma-Aldrich	02860-2.5L
Chloroform SpS	Romil	H135 2,5 L
n-Hexane 95% SpS	Romil	H389 2,5 L
Acetonitrile 230 SpS	Romil	H047 2,5 L
Dichloromethane SpS	Romil	H2022,5 L
Carbon tetrachloride	Sigma-Aldrich	107344-1L
Sodium iodide	Sigma-Aldrich	383112-100G
Sodium hydrogen carbonate	Carlo Erba	478536-500 g
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	309966-1L
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
NaOH solid	Sigma-Aldrich	221465-25G
NH4OH sol. 28%-30%	Sigma-Aldrich	221228-1L-A
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML
Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride	Sigma-Aldrich	221759-100G
Ammonium Molybdate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	A7302-100G
Sulfuric Acid 95%-98%	Sigma-Aldrich	320501-1L
Silver Nitrate	Sigma-Aldrich	209139-25G
Sodium sulfate anhydrous	Sigma-Aldrich	238597-500G
Nuclease P-I from penicillium citrinum	Sigma-Aldrich	N8630-1VL
Phosphodiesterase II type I-sa	Sigma-Aldrich	P9041-10UN
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc	Sigma-Aldrich	E114-25MG
Phosphatase alkaline type VII-t from*bov	Sigma-Aldrich	P6774-1KU
Phosphodiesterase I type VI	Sigma-Aldrich	P3134-100MG
Deoxyribonuclease II type IV from*porcin	Sigma-Aldrich	D4138-20KU
Trizma(r) base, biotechnology performanc ce	Sigma-Aldrich	T6066-100G
EDTA	Sigma-Aldrich	E1644-100G
Succinic acid bioxtra	Sigma-Aldrich	S3674-250G
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670-100G
Formic acid, 98 %	Sigma-Aldrich	06440-100ML
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane	Millipore	UFC500324
8-Bromo-2'-deoxyguanosine	Berry Associates	PR3290-1 g
8-Bromo-2'-deoxyadenosine	Berry Associates	PR3300-1 g
Sodium iodide	Sigma-Aldrich	383112-100G
Sodium hydrogen carbonate	Carlo Erba	478536-500 g
2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	CILNLM-3899-CA-0.1
2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	CILNLM-3895-0.1
Nitrous oxide (N2O)	Air Liquide
Deoxyribonucleic acid from calf thymus	Sigma Aldrich	D4522-5MG
EQUIPMENT
60Co-Gammacell	AECL- Canada	220
Immersion well reaction medium pressure 125 watts	Photochemical reactors ltd	Model 3010
Evaporating flask 250 ml	Heidolph	P/N NS 29/32 514-72000-00
Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm	Phenomenex	00A-4252-E0
Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm	Grace	88081	Semipreparative
SecurityGuard Kit	Phenomenex	KJ0-4282	Analytical holder kit and accessories
Holder for 10.0 mm ID cartridges	Phenomenex	AJ0-7220	Semipreparative holder
10.0 mm ID cartridges	Phenomenex	AJ0-7221
High-performance liquid chromatography (HPLC)	Agilent	1100
LC/MS/MS	Applied Biosystems	4000QTRAP System
Tandem mass ESI spectrometer	(Bruker Daltonics)	Esquire 3000 plus
Vial 2-4 ml	SUPELCO	Cod 27516
Vial 4 ml	SUPELCO	Cod 27517