Summary
Radikal tabanlı biomimetic kimya biyolojik gelişimi için gerekli bina-up kütüphaneler uygulanmıştır.
Abstract
Yaşam bilimleri serbest radikallerin katılımı sürekli zamanla artmıştır ve çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde bağlı olmuştur. Bu konu hayat, sağlık ve yaşlanma kalitesinin iyileştirilmesi uygulamaları ile biyoloji ve tıp fiziksel, biyolojik ve biyoorganik kimya uzanan, çeşitli bilimsel alanlardan kucaklar. Multidisipliner becerileri bilgisi temel süreçlerinin ve mekanizmalarının açıklanması önemli bir rol oynayan biyolojik çevre ve kimyasal radikal süreçlerin çok yönlü tam bir soruşturma için gereklidir. Biz mekanik yollar ve ürünler hakkında bilgi veren, biyolojik süreçler ile serbest radikal kimyasal reaktivite bağlanmak mümkün bir kimyasal biyoloji yaklaşım geliştirdi. Bu yaklaşımın temel reaksiyon anlayışlar elde, sulu sistemlerde biyomoleküle davranışı (lipidler, nükleik asitler ve proteinler) incelemek için biomimetic modelleri tasarım hem de bir geçiş yolus serbest radikal reaksiyon ürünlerinin moleküler kütüphaneler kadar bina. Bu bağlamda buluş başarılı bir şekilde biyolojik için kullanılabilir ve örnek bileşiklerin iki sınıf ile sağlanır: sentezlenmiş ve insan plazma içinde tespiti için referans olarak kullanılmaktadır kolesteril esterleri, mono-trans izomerleri, pürin ve 5 ',8-siklo-2 '-deoksiribonükleosidler, hazırlanmış ve DNA örnekleri bu tür lezyonların tespiti için protokolde referans olarak kullanılan, iyonlaştırıcı radyasyonun sonra veya farklı sağlık koşulları elde edilmiştir.
Introduction
Serbest radikallerin reaktivitesi yaşlanma ve enflamasyon gibi birçok biyolojik olaylar için muazzam önemini ortaya çıkarmıştır. Günümüzde, serbest radikaller ve hasar onarım kontrolü için temel mekanizmaları ve tasavvur etkili stratejiler anlamak için, daha fazla ve daha belirgin bu tepkime katılan her kimyasal adımın açıklanması gerekmektedir olmasıdır. Kimyasal çalışmalarda katkısı esastır, ancak farklı süreçlerin superimposition karmaşıklaştırır ve sonuçları ve ilgili sonuçların incelenmesi bozan beri biyolojik ortamda doğrudan çalışma, zor olabilir. Bu nedenle, biyolojik olarak ilgili koşullar altında serbest radikal reaksiyonları modelleme strateji biyoloji kimyasal mekanizmaları araştırma içinde bir basamaktır haline gelmiştir.
Son on yıl içinde bizim grup biyomimetik koşullarda serbest radikal süreçlerin modelleri geliştirilmiştir. Özellikle biz trdoymamış yağ asitleri, nükleosidlerin ve sülfür içeren amino asitlerin biyolojik ilgili dönüşümleri visaged ve sağlık durumunun biyolojik olarak değerlendirilir ve valide edilecek parça koydum. 1-4
Bizim genel yaklaşım üç modülden oluşmaktadır:
- Uygun bir şekilde değiştirilmiş biyomoleküller erişim sağlar Organic Synthesis,. Sentetik planı da böylece biomimetic radikal kimyası ilkedir ilgi biyolojik süreç, simüle edebilecek koşullar uygulanarak, biyolojik ortamda meydana gelen serbest radikal süreçleri simüle etmek için tasarlanmış olabilir. Biyomimetik modellerinde reaksiyon ortamı su veya hidrofilik ve hidrofobik bölmeleri bir arada bulunması nedeniyle bir heterojen bir ortamdır. Biomimetic modelleri ile çalışmak avantaj muhtemelen keşfetmek, reaktivite ve ürünleri daha ayrıntılı incelenebilir bilinen reaksiyon ortakları, sadeleştirilmiş bir çevreye sahip olmaktıryeni kimyasal yollar. Bu adımı itibaren mekanik ve kinetik bilgiler elde edilebilir;
- Moleküler kütüphaneleri düzenlemek ve daha karmaşık biyolojik ortam recognition.in kolaylaştırmak için modifiye biyomoleküllerin yapısal ve kimyasal bilgi sağlama ürünlerinin saflaştırılması, analiz ve karakterizasyonu. Protokoller örneğin biyolojik örnekler türetilmiş olanlar gibi bileşiklerin kompleks karışımlar çözme görünümünde de oluşturulmuştur;
- Biyolojik hücre kültürleri kullanılarak in vitro deneylerde yoluyla elde edilen örneklerin, hayvan ve insanlarda in vivo çalışmalarda kullanarak Biyomarker gelişme. Biyomimetik modelleri geliştirilmiştir protokoller sonra farklı koşullar altında serbest radikal dönüşümleri tasavvur etmek için, numunelerin analizi gibi uygulanır. Sentez tarafından geliştirilen moleküler kütüphaneler yaşam bilimleri buluşları için muazzam bir yardımcı vardır. Bilgileri serbest radikal dönüşümler giv toplandıE fırsatı onarım ve önleme stratejileri anlamaya. Sonuç Veritabanları biyolojik önemi yanı sıra muhtemel ilişkili faktörlerin çok değişkenli analizi ile dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi için de kullanılabilir.
Kolesteril esterleri ve pürin 5 ',8-siklo-2'-deoksiribonükleosidler: Biz bu yaklaşımı akredite alakalı biyobelirteçlerin iki sınıf seçti.
Protocol
1. Kolesteril esterler, mono-trans izomerleri sentezi
- 2-propanol içinde kolesteril esterler (linoleat veya Arakidonat kolesteril ester) (15 mM) eritilir. Daha iyi bir solubilizasyon için, numuneler argon altında 15 dakika sonike edildi.
- (7 mM konsantrasyonuna ulaşmak için, tiyol ve bir 2 M stok çözeltiden) 2-propanol içinde 2-merkaptoetanol ekleme, bir kuvars reaktör fotokimyasal için çözelti aktarın. Çözelti içinde oksijen varlığı ortadan kaldırmak için 20 dakika süre ile argon ile reaksiyon karışımının yıkayın.
- 22, bir 5.5W düşük basınçlı cıva lamba kullanarak, UV ışığı ile reaksiyon karışımının saçmak ± 2 ° C'de 4 dak. Monitör tarafından analitik Ag-TLC (gümüş ince tabaka kromatografisi) deliller mono-trans kolesteril esterlerin oluşumu (kimyasal formüller için bakınız Şekil 1) için. TLC boyama seryum amonyum molibdat (CAM) çözüm plaka dökerek yürütülen ve noktalar ısıtma görünür olduğuplakası. Genel ürün verimi ile bir artış elde izomerizasyon bölgesinin diğer mermi gerçekleştirmek için yeniden kullanılabilir, başlangıç materyali, tekrar elde edilmesi için, bir ilk aşamada, reaksiyon dindir.
- 2-propanol birkaç ml ile yıkama aletin, bir yuvarlak tabanlı şişe içerisinde reaksiyon karışımı toplayın. Çözücü çıkarın ve literatürde tarif Ag-TLC ile kolesteril esterlerin mono-trans izomerleri hem de temizler. 5 kullanımlar mono-trans izomerleri için kolesteril linoleat eluent olarak heksan-dietil eter (9:1 v / v), ancak kullanım hekzan mono-trans kolesteril Arakidonat izomerleri-dietil eter-asetik asit (9:1:0,1 v / v).
2. İnsan Serum gelen Kolesteril Esterler Kesir İzolasyonu
- 1 ml tuzlu su ile insan serumu (kan santrifüjleme ile elde edilir) 1 ml seyreltin ve kalıntıya (örneğin, oksidasyon adducts) önlemek için, bir argon akışı altında bir ayırma hunisi içine çözelti dökülür. Ekleyin 10 ml kloroform-metanol (2: Üç kere 1 v / v). Albümin varlığı nedeniyle emülsiyon oluşumu sınırlandırmak için çok yavaş bir şekilde ayırma hunisi çalkalayın.
- Tuzlu su (10 ml) ile bir defa yıkanır, organik katmanlar, daha sonra susuz sodyum sülfat üzerinde kuru bir argon akışı altında bir Erlenmeyer şişesi içinde toplamak. Sarı bir yağ (toplam plazma lipit fraksiyonu) vermek üzere döner buharlaştırma ile uçucu maddeler çıkarın.
- Kloroform-metanol ve 1 ml (2:1 v / v), argon akımı altında, bir preparatif TLC üzerine yük ile ham yukarı çıkar ve süzücü olarak heksan-dietil eter (9:1 v / v) oluşan bir karışım kullanmak . Kolesteril ester fraksiyonu içeren silika kısmı kazıyın ve bir şişeye dökün. Sonra, kloroform-metanol (2:1 v / v) ile (3 x 5 ml) ile silis özü, organik tabakalar toplamak ve kolesteril esterler (genellikle yaklaşık 1.5 mg) saf fraksiyon vermek üzere buharlaştırma sonra çözücü çıkarın.
- -20 ° C'de argon ve deposunun altında alüminyum folyo kaplı, karanlık bir flakonda kolesteril esterleri tutun Kolesteril esters ışık ve oksijen duyarlıdır.
3. Raman Spektroskopisi ile Mono-trans Kolesteril Esterler Karakterizasyonu
- Bölüm 2'de tarif edildiği gibi insan serumu (≥ 0.7 mg), kolesteril ester Özü, karbon tetraklorid (≤ 10 ul) ve bir şişe içinde bir yerde az bir miktar içinde çözülür. Raman sinyalini kolesteril ester analizlerine ilgi bölge ile örtüşmeyen çünkü CCl 4 çözücü olarak seçilir.
- Bir tek cam pipet ile numune tutucu çözüm aktarın, sonra dikkatlice argon yavaş akımı ile çözücü çıkarın. Homojen bir yağlı film numune tutucusunun iç duvarı üzerinde oluşturulan sonra, ölçüm için araç içine ikinci yerleştirin.
- Fourier kolesteril esterlerin Raman spektrumu doğrudan herhangi türevlendirme reaksiyon olmadan lipit özü elde edilir Dönüştürülmüş. Örnek üzerinde lazer güç örnek hasarı önlemek için <100 mW. Taramaların toplam sayısıher spektrum için arka plan gürültüsünü en aza indirmek için ≥ 800 olduğunu.
- Bu molekül (C = C modunda germe) içinde mevcut bulunan C = C çift bağının ikinci katkı yansıtır beri Raman spektrumunun 1,700-1,630 cm-1 dizi analiz edilmiştir. Bir eğri uydurma analizi böylece sağlayan, bu bölge üzerinde gerçekleştirilen yağlı alkil zinciri ve kolesterol halkası B çift bağı (bkz. Şekil 2) olarak cis ve trans çift bağ gelen bindirilmiş katkıları ayırt.
- Doğru titreşim bandlarının sığdırmak için, bazı parametreler sabit veya makul sınırlar içinde kısıtlı olmalıdır. Yarı yükseklikte band genişlikleri en bilgisayar optimizasyon rutin ile tespit edilir ise bileşen doruk profilleri, Lorentz ve Gauss fonksiyonlarının doğrusal bir bileşimi olarak tarif edilmektedir. Bileşen tepe noktalarının sayısı ve konumu, aynı zamanda, bazı bileşen zayıf bantlar saptamaya olanak sağlar dördüncü türev spektrumları kullanılarak elde edilmiştir. Yana sinyaliBöylece, gürültü oranı çözünürlük ve sinyal arasında doğru uzlaşma elde edilir; sinyal farklılaşma üzerine bozulur dördüncü türev kullanılmasına engel olabilir, bir on dört noktada Savitsky-Golay fonksiyonu ile dördüncü türevleri düzeltti, avantajı vardır gürültü oranı . En iyi eğri uydurma mümkün olan en düşük c 2 değerleri elde edilir.
- Trans izomerleri varlığı 1671 az bileşen ± 1 yağlı asit zinciri nedeniyle biraz daha düşük frekanslara doğru kaydırılır ek olarak cm-1, en azından iki bileşenden, kolesterol ve C = C çift bağı ile ortaya çıkar. Plazma kolesteril ester Örnek Raman spektrumu Şekil 9'da gösterilmiştir. Ilave kolesteril linoleat mono-ve trans izomerleri kolesteril linoleik asit ile belirli bir bölgede karşılaştırılması gösterilmektedir.
4. Yağ asidi metil esterleri (FAME) ve Gaz Kromatografisi ile Analizi Türevlendirme
- Eritmekargon altında alüminyum folyo ile kaplanmış bir şişe içinde koyu bir 1 M benzen-metanol içinde sodyum hidroksit çözeltisi (2:3 v / v) ile yer ve 0,5 ml kolesteril esterler (yaklaşık 1.5 mg).
- Karışım eluent olarak heksan-dietil eter (9:1 v / v) karışımı kullanılarak TLC ile oda sıcaklığında ve monitör karıştırıldıktan bırakın. Tepki süresi genellikle 30 dakikadır, ancak dikkatli bir reaksiyon izlem gereklidir. Karşılık gelen metil ester oluşturduğu bir kere Aslında, reaksiyon bozulması ve yan ürünlerin oluşumunu önlemek için soğutulması gerekir. TLC metil esterlerin kantitatif oluşum göstermiştir.
- 1 ml tuzlu su ilave edilerek reaksiyon karışımı gidermek ve n-heksan (3 x 2 mL) ile özü metil ester. Bir şişeye organik tabakalar toplayın ve daha sonra daha fazla saflaştırılmadan GC analizi için kullanılmıştır metil ester fraksiyonu vermek üzere döner buharlaştırma ile çözgen çıkarın.
- N-hekzan minimum miktarı (genellikle 5 içinde 1 mg içinde çözülür metil ester0 ul) ve 60 m × 0.25 mm × 0.25 mikron (% 50-cyanopropyl)-methylpolysiloxane sütunu ile donatılmış GC enjekte. Aşağıdaki fırın programı ile alev iyonizasyon dedektörü (FID) kullanın: 165 sıcaklık başlangıç ° C, 1 artış izledi 3 dk süreyle basılı tutun ° C / 195 dak ° C kadar, ikinci bir takip 40 dakika için basılı tutun 10 artış ° C / 240 dakikaya kadar ° C, ve 10 dakika için de geçerlidir. Bir sabit basınç modu (29 psi) seçilir. Helyum hidrojen ya da taşıyıcı gaz olarak da kullanılabilir. Metil esterlerin özgün örnekleri arasında tutma süreleri ile karşılaştırılması ile belirlenmiştir. Şekil 10, plazma kolesterol esterleri elde ün bir temsili GC analizi gösterilmektedir.
5. Sentezi (5'R) - ve (5'S) -5 ',8-siklo-2'-deoksiadenosin
- 1 mM konsantrasyonuna ulaşmak için asetonitril içindeki bir 8-bromo-2'-deoksiadenosin 33 mg (8-Br-taban taşı) (100 mi) eritilir. Fotoreaktör gaz akışı (Ar veya N2) düzenler ve Appa doldurun8-Br-taban taşı çözeltisi ile Ratus.
- Fotoreaktör girişi için uygun boyutta bir septum hazırlayın ve bunun merkezi aracılığıyla inert gaz hattına bağlı bir iğne geçirin. Septum sistemini kapatın. 30 dakika için inert gaz yıkayın.
- 22, bir 125 W orta basınçlı cıva buharlı lamba kullanarak, UV ışığı ile irradyasyona uğratırlar ± 2 ° C'de 15 dakika boyunca, bir 250 ml yuvarlak dipli bir şişeye çözelti toplamak. 10 ml asetonitril ile yıkanır ve fotoreaktör aynı şişe içinde yıkama suyu toplamak.
- 1 M NH4 OH çözelti ile ham tepkime karışımının gidermek ve döner buharlaştırıcıda çözücü buharlaşır.
- Bilinen şartlar altında analitik sütun ile yüksek performans sıvı kromatografisi analizi (HPLC-UV) (enstrümantasyon bölümüne bakınız) çalıştırmak ve referans bileşikleri ile profil karşılaştırmak.
- Aşağıdaki sol kullanılarak bir analitik sütun (enstrümentasyon bölümüne bakınız) ile, yüksek performanslı sıvı kromatografisi analizi (HPLC-UV) çalıştırmadelikleri ve gradyanlar: 2 mM amonyum format gibi bir çözücü ve asetonitril çözücü B: 1 ml / dak ve 2.2 dk ulaşılır% 0 çözücü B'den% 0.3 çözücü B için degrade akış hızını ayarlamak için kullanılır. 4.8 dakika içinde 4.0 dak, daha sonra% 1 çözücü B, sonra% 0.8 çözücü B. 6 dakika içinde% 8 çözücü B gidin 9 dakika 1% çözücü B kalın ve. 4 dak% 10 çözücü B'ye gidin ve% 30 çözücü B'ye 5 dakika içinde ve diğer 5 dakika süreyle% 30 solvent B kalır sonra. İki farklı şişeler içinde iki diastereomerik ürün karşılık gelen pik kromatografik toplayın.
- UV spektrofotometrede iki toplanan fraksiyonların absorbansı ölçülür ve Lambert-Beer yasası (A absorbans A = εlC, ε sönüm katsayısı ve l hücrenin uzunluğu) dayalı kesin miktarını hesaplamak. (260 nm'de 15.400 M -1 cm -1) (Dado) 2'-deoksiadenozin ve sönüm katsayısı ε kullanın.
6. Sentezi (5'R) -, bird (5'S) -5 ',8-siklo-2'-deoksiguanozin
- Sırasıyla, 1 mM ve 2mM konsantrasyonuna ulaşmak için damıtılmış su (100 mi) içinde 8-bromo-2'-deoksiguanosin 35 mg (8-Br-dGuo) ve sodyum iyodür (NaI) 30 mg eritilir. Fotoreaktör bağlı atıl gaz (Ar ya da N 2) akışını düzenleyen ve reaksiyon çözeltisi ile fotoreaktör doldurun.
- (B adımına) işlem 5'te tarif edilen reaksiyon karışımı Degass.
- 22, bir 125 W orta basınçlı cıva buharlı lamba kullanarak, UV ışığı ile irradyasyona uğratırlar ± 2 ° C'de 30 dakika süre ile, 250 ml'lik yuvarlak dipli bir şişeye çözelti toplamak. 10 ml su ile yıkanır ve fotoreaktör aynı şişe içinde yıkama suyu toplamak.
- 1 M NH4 OH çözelti ile ham tepkime karışımının gidermek ve vakum altında çözücü buharlaşır.
- (G adım e) Prosedür 5 açıklandığı gibi analiz gerçekleştirin. (260 nm'de 11.700 M -1 cm -1) (dGuo) 2'-deoksiguanozin ve sönüm katsayısı ε kullanın.
7. İzotop Etiketli Pürin (5'R) Sentezi - ve (5'S) -5 ',8-cyclonucleosides
- 15 N izotopik olarak etiketlenmiş pürin nükleosit 1mM sulu çözelti (damıtılmış su), 2 ml hazırlayın ([15N 5] taban taşı veya [15N 5] dGuo) bir septum kapaklı bir cam şişeye (4 ml) içinde.
- Septum kapaklı flakon bağlayın ve flakon alt ulaşır septumda bir iğne aracılığıyla gaz hattı (çözüm doygunluğu için N 2 O) bağlayın. Septum kap içinde bir başka kısa iğne gaz çıkışı olarak çalışır.
- 30 dk N 2 O ile çözümü yıkayın. Gaz akışı çok düşük olduğu için düzenlenir.
- Çıkış iğne birinci dışarı alınır ve 1 'den sonra ve uzun bir şişe içinde küçük bir basınç elde etmek için, aşağıdaki edilir.
- 8 saat (bir doz oranı ca. 4,5 Gy / dak 'lık temelinde hesaplanmıştır) için gama radyoliz aygıtı içinde çözelti koyun.
- Reaksiyon 1 M NH4 ile söndürmeden sonra ham
- Bilinen şartlar altında 6 yüksek performanslı sıvı kromatografik analizi (HPLC-UV) çalıştırın ve standart referanslar kromatogram karşılaştırın.
8. DNA Sulu çözeltilerin Gama Radyoliz
- 0.5 mg / dana timus DNA, bir ml solüsyon (damıtılmış su) 1 ml hazırlayın ve kap bir septum ile bir cam şişeye (2 ml) içinde koydu.
- (Adım bd) prosedür 7'de tarif edildiği gibi reaksiyona Degass.
- 30 dk (doz / kuru ca. 4,5 Gy / dak 'lık temelinde hesaplanmıştır) için gama radyoliz aygıtı içinde çözelti koyun.
9. DNA'nın enzimatik sindiriminden
- DNA 80 ug ihtiva eden bir Eppendorf tüpü için, nükleaz P1, fosfodiesteraz II, 300 mM sodyum asetat (pH 5.6) ve 10 mM çinko klorür, 20 ul içinde 20 nmol EHNA, 0.01 U-8 U ekleyin. 48 saat süreyle 37 ° C'de inkübe karışım.
- Sonraki alkalin fosfataz 8 U oluşan bir karışım, phosphodiesteras 0.02 U eklemeke I, karışım sindirim ile 0.5 M Tris-HCl tampon (pH 8.9), 40 ul. Örnek 2 saat süreyle 37 ° C'de inkübe edilir.
- Karışım,% 10 formik asit ilave edilerek nötralize edilir.
- Bir Amicon Ultra-0.5 santrifüj filtre cihazı (kesim noktası 3 kDa) için örnek aktarın, tridistilled H 2 O 200 ul ekleyin 15 dakika boyunca 14.000 xg'de santrifüj rotor içine Ultra filtre yerleştirin. Sonra mikrosantrifüj tüp Ultra filtre cihazı ayırın. Mikrosantrifüj tüp enzim ücretsiz bir çözüm Lyophilize.
10. Analiz öncesinde DNA Sample Tuz Giderme
- Analitik kolon ile yüksek performanslı sıvı kromatografik analizi (HPLC-UV) (enstrümentasyon bölümüne bakınız) bilinen aşağıdaki şartlar. 6 çalıştırın
- H2O 20 ul içinde liyofilize sindirilmiş DNA çözülür ve HPLC-UV olarak enjekte edilir.
- Tuz elüsyon (ilk dakika) sonra sağ ve elüsyon tim önce bir flakon örnek toplayınkromatografik programın sonuna kadar ilk nükleozid (5'R-cdGuo), e.
- Örnek liyofilize edildi ve 20 ul su içinde resolubilized edilir.
11. LC-MS/MS Kantitatif Analiz
- Analitik yöntem ve detektör MS (ESI) için yükleme yöntemi ile analiz başlamadan önce HPLC-MS/MS (üçlü dört kutuplu) hazırlayın. 6
- Prosedür 7 de hazırlanan numune içinde izotopik olarak etiketlenmiş bileşikleri karışımı 1 ul ekle.
- Distile su içinde çivili sindirilmiş DNA çözeltisi 20 ul enjekte edilir.
- Elde edilen kromatografik veri referans bileşikleri ile önceki ayarlama bazında ele alınmaktadır. Bir temsilci HPLC adenozin ve 2'-deoksiribonükleosidler ve oksidatif ve siklo türevleri guanozin Şekil 11'de gösterilmiştir içeren çalıştırın.
Representative Results
Izomerizasyon işlemi biyolojik ortamda serbest radikal stres şartları altında oluşabilir bu saldırının birinci ürün olarak Şekil 1 'de gösterildiği gibi mono-trans izomerler ve linoleik arachidonic asit, temin eden kolesteril esterleri özellikle de tarif edilmiştir. 5
Şekil 3'te, cis-trans izomerizasyonu çift bağ da dahil kimyasal mekanizma gösterilmektedir. Radikal kaynağı S-merkezli radikaller göze genel bir şekilde belirtilir. Açıklanan protokoller ise radikal kaynağı homolitically tiyol molekülü RSH yılında SH bağ mevcut kırmak mümkün UV ışık.
Şekil 4, insan plazması içinde değiştirilmiş lipid sınıfı ve bunların saptanması için üç sentez adımları protokolü özetlenmektedir: sentez bir biyomimetik serbest radikal işlemi temsil eder ve aynı zamanda geometrik için bir tek-kap uygun bir giriş içerirpozisyonel izomerlerin herhangi bir kirlenme olmadan rical izomerleri, izolasyon ve arıtma protokolü takip eder.
Çeşitli analitik yöntemler mono-trans kolesteril ester kütüphanesi trans izomer içeriği ve karakterizasyonu yüksek bir hassas algılama için uygulanabilir. Özellikle, Raman Spektroskopisi (Şekil 2 ve Şekil 9) türevlendirme olmadan direkt olarak kolesteril ester fraksiyonu üzerinde gerçekleştirilebilir.
İkinci örnek, endişe pürin 5 ',8-siklo-2'-deoksiribonükleosidler, pozisyon şeker kısmının C5 've şeker ve taban arasında bir kovalent bağ oluşumu daha sonraki serbest radikallerin etkisi ile yaratılan DNA lezyonlar kısımları. Dört yapılar elde edilebilir, yani, 5 ',8-siklo-2'-deoksiadenosin ve 5 ',8-siklo-2' dir deoksiguanozin-, hem 5'R ve 5 'diyasteromerik formlarda (Şekil 5) de mevcut. Şekil 6 to reaksiyon mekanizması gösterilmektedir, karşılık gelen bir C8-içi seçici 2'-deoxyadenosin-5'-il radikal 7 karşılayabilme C5 'pozisyonundaki bir hidrojen atomu özetler radikal 6, vermek üzere 8-bromopurine türevlerinin 5 fotoliz içerir. Radikal 7 aralığı 10 5 -10 6 s-1, 2 nihai ürünler 9 vermek üzere heteroaromatik bir radikal 8 oksidazyon ile de sabit bir oran ile siklizasyon uğrar. 2'-deoksiadenosin ve 2'-deoksiguanozin su ile radyoliz tarafından üretilen hidroksil radikalinin reaksiyon, (10) ca oluştuğu tespit edilmiştir. C5 'konumundan hidrojen soyutlama yoluyla% 10. 7
Pürin 5 kütüphaneleri için, kimyasal biyoloji yaklaşım ',8-siklo-2'-deoksiribonükleosidler (etiketlenmiş bileşikleri de dahil olmak üzere) oligonükleotidler de bu lezyonlar belirlenmesi ile hem de va elde edilen DNA örnekleri olarak, Şekil 7 'de gösterilmiştirgibi rious kaynakları, örneğin, radikal stres şartları taklit olarak, iyonize edici radyasyon koşullar altında muamele.
Şekil 8 de, tipik bir fotoreaktör ekipman gösterilmektedir. Cihaz, uygun bir çözgen içinde çözülür bileşiklerin ışınlama için olanak sağlar. Bu, aşağıdakilerden oluşur: i) atıl gaz (alt) ve gaz çıkışı için iki giriş ve reaktifler için ek giriş ile donatılmış reaksiyon odasına, ii) uygun bir cıva lamba ihtiva eden bir dahili bölme bir soğutma sistemine bağlı ve bir cam eklem vasıtasıyla reaksiyon odasına yerleştirilir elektrik gücü kullanır.
Şekil 1. Kolesteril linoleat ve Arakidonat mono-trans izomerleri anlamına gelir.
Şekil 2. Raman spektroskopisi ile mono-trans izomerleri için insan serumu ve doğrudan analizi kolesteril esterleri.
Şekil 3,. Bu ek-yok etme işlemi thiyl radikalleri tarafından çift bağların cis-trans izomerizasyonu yol açar.
Şekil 4. Serbest radikal stres belirteç olarak mono-trans kolesteril esterlerin gelişimi için üç adım protokolü.
Şekil 5,. Dört pürin 5 ',8-siklo-2'-deoxyribonucleoside diastereoizomerler. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 6. C5 Nesil 'radikaller, ya 5 fotoliz veya HO • radikalleri ile 10 reaksiyon ve pürin 5 mekanizması tarafından' ,8-siklo-2 'deoxyribonucleoside oluşumu. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 7. Protokol fBazı radikal tabanlı DNA lezyonları veya kimlik; mtDNA: Mitokondriyal DNA, nDNA: nükleer DNA.
Şekil 8. Fotokimyasal reaktör.
9 Şekil. Plazma kolesterol ester Temsilcisi Raman spektrumu. Kolesteril linoleat ve kolesteril mono-trans linoleik asit izomerleri ile belirli bir bölgenin içerlek karşılaştırıldığında.
10 Şekil. FAME Temsilcisi GC analizi plazma kolesterol esterleri elde.
<> Şekil 11 güçlü. Örnek HPLC 2'-deoksiadenozin içeren çalıştırmak ve oksidatif ve pürin 5 ile birlikte 2'deoxyguanosine ',8-siklo-2'-deoksiribo nükleosidlerin. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Discussion
Doğal olarak geometrik trans izomerleri ile cis doymamış yağ asitleri meydana gelen dönüştürme biyolojik ortamında radikal stres üretimi ile bağlantılı bir dönüşümdür. Yağ asitleri içerir Hücre zarı lipitleri, radikal stres için uygun bir biyolojik hedef ve önce her durumda analitik protokolleri değerlendiren hücre kültürleri, hayvanlar ve insanlarda endojen cis-trans fosfolipidler izomerizasyon okudu. 8-10 nekrotizan bu dönüşümü farklı radikal gerilimli şartlar altında thiyl radikalleri oluşturmak mümkün tiyoller, tiyoeterler ve disülfitler, yani isomerizing ajan (Şekil 3) de dahil olmak üzere S-ihtiva eden bileşikler, çeşitli tarafından meydana gelebilir. Bu makalede gösterilen örnek, tam lipoprotein metabolizmasında rol plazma lipit tanınmış bir kısmını, temsil kolesteril esterleri, bir sınıf üzerinde odaklanır. Yağ asitleri ve Cho arasındaki bağlantı esterlesterol fosfatidilkolin gliserol kısmının pozisyon 2'den kolesterol, yağ asitlerinin transferi, transferaz enzimi lesitin kolesterol açil (LCAT) tarafından katalize edilen bir adım sentezlenir. Bu nedenle, plazma kolesterol esterleri kesinlikle membran lipid ciro ile bağlı ve çoklu doymamış yağ fosfatidilkolinler tipik olarak asitleri (PUFA), yani linoleik ve araşidonik asit nispeten yüksek oranlarda içerirler. Lipoprotein oluşumu kardiyovasküler ve metabolik hastalıklar yer almaktadır. Serbest radikaller ile doğal kolesteril esterlerinin reaktivitesi (yapıları için bakınız Şekil 1) gelen trans geometrik izomerleri dönüştürdü edilebilir linoleat çift bağların ve Arakidonat artıkları, ortaya çıkabilir. Biyolojik örneklerde trans kolesteril ester içeriğinin Karakterizasyonu biyolojik gelişimi için ilginçtir. Bir dolaylı metodoloji cholestery dönüşümünü içerirl esterleri plazmadan gelen yağ asidi metil esterleri (FAME) ve gaz kromatografik protokolleri ile ayırma izole. Bu durumda, cis ve trans yağ asidi metil esterlerinin standart referans kalibrasyon numuneleri, trans içeriğinin miktarının belirlenmesi izin vermek için, gerçekleştirilir. Kolesteril ester kütüphane üzerinde yapılan analitik çalışma dayanarak, (bkz. Şekil karşılık gelen FAME daha fazla türevlendirme olmaksızın, aynı zamanda plazma izole kolesteril ester fraksiyonu üzerinde direkt olarak gerçekleştirilebilir Raman spektroskopisi dayanan bir yöntem uygulamak için önerilen 2 ve 9). Şimdi hiçbir başarılı yöntemler olarak yerine kolesteril ester hidroperoksitler tarafından açıklanan ayrı cis ve HPLC ile lipit içeren yağ asidi trans izomerleri, açıklanan kadar fazlalaştı. Şimdiye kadar, indirekt gaz kromatografik yöntem şimdiye kadar hala en uygun yöntemdir. Bu yöntem, ilk olarak nicel olarak değerlensağlıklı kişiden izole edilmiş plazma kolesterol esterleri elde edilen mono-trans içeriği tirme sağlandı. Alevli İyonlaştırma Dedektörü (FID) tespit edilebilirliği arasında sınırı kullanılarak tatmin edici olan (ppb) ve bileşiklerin nanomolar miktarları tespit edilmiştir. 5. Farklı algılama sistemleri ile bu sınır bile düşürülebilir. Kolesteril esterleri, iyonizan radyasyon etkisi lineer bir cevap uygulanan doz göreceli elde edilip, daha ileri çalışmalar meselesidir.
İkinci bir örnek olarak, DNA serbest radikal hasar ile elde edilebilir modifiye nükleosit seçtik. Hidroksil radikalleri (HO •) DNA için kimyasal modifikasyonlar neden kabiliyeti açısından en çok zararlı Reaktif oksijen (ROS) olduğu bilinmektedir. Tek veya birden fazla lezyon ökaryotik hücrelerde çekirdek ve mitokondri içinde yer aldığını, DNA üzerinde oluşabilir. DNA oksidatif oluşturulan hasarların ana sınıflarının tanımlanması ve ölçülmesi appropr gerektiriranalitik protokolleri kurmak amacıyla moleküler kütüphaneler geciktim. Bu taban ve serbest radikal saldırının ortaya şeker parçalan arasına ek bir kovalent bağa sahip, pürin 5 olan en küçük tandem lezyonlar, ',8-siklo-2'-deoksiribonükleosidler üzerindeki ilgi odaklanmıştır. Bileşikler, 5 ',8-siklo-2'-deoksiadenosin ve 5 ',8-siklo-2'-deoksiguanozin 5'R ve 5 'diyasteromerik formlarda (şekil 5) içinde mevcut bulunmaktadır. Serbest radikal gerilme göstergesi olmak için potansiyel önemli araştırma konusu olmuştur. 2 Gerçekten de, DNA HO maruz kaldığında • şeker C5 'pozisyonundan radikal hidrojen soyutlama bu tandem lezyonların oluşumuna yol açan olası olaylar biridir. Pürin 5 ',8-cyclonucleosides oksijen fizyolojik düzeyde oksijen şeklinde olmaması gidiş 1-12 lezyonlar / 10 6 nükleosit / Gy arasında değişen enzimatik sindirimi γ-ışınlanmış DNA örnekleri HPLC-MS/MS diastereomerler by toplamı olarak ölçülebilir benn dokular, diastereomerik oranı 5'R / 5'S ~ 5 için 4 ve 3 ~ ',8-cdAdo ve 5' ,8-cdGuo, sırasıyla (Şekil 11). 11. O fazlalaştı ediliyor ki, radyasyon dozu ve arasındaki ilişkiyi hücresel DNA tespit 5 ',8-cdAdo ve 5' ,8-cdAdo lezyonlar anlaşılır olmaktan uzaktır. 2kGy ışınlama göre tek bir deney, deney rapor kesin olarak kabul edilemez. Bu tür ve dört lezyonların kantitatif analitik 11 ilave deneyler, böylesine bir ilişki tanımlanması için gereklidir. Bu lezyonların saptanması ve daha popüler oksidatif dönüşümler (örneğin 8-oxo-2'-deoksiguanozin, 8-oxodGuo gibi) oksidatif metabolizma sırasında hem lezyonların önemini kanıtlayan, yoğun araştırmaların konusudur. 6,13 HPLC kullanımı -MS/MS (üçlü kuadrupol) dört lezyonlar için yakın 30fmol bir algılama sınırı vardır. Son gelişmeler enstrüman süreden tarafından attomol düzeylerinin tespit limitleri ulaşmak için iddia edilenCER. Çok yeni literatüre göre, 6 analitik prosedürler MS / MS / MS (iyon tuzak) ya MS / MS (üçlü dört kutuplu) kullanılan bir tespit limitleri karşılamak için numune ve zenginleştirme uygun temizleme dahil etmek zorunda bizim durumumuzda.
Bileşikler 1-4 Biyolojik temelli sentetik prosedürler 8-bromopurine altında türevleri ya da fotoliz başlayarak hazırlanmıştır. 7,12 Bu işlemler, bir radikal çağlayan 5 oluşumu DNA hasar mekanizma taklit eden tepkime ',8-cdAdo ve 5' içermez ,8-cdGuo lezyonlar. Biyolojik açılardan bakıldığında, bu lezyonlar DNA onarım mekanizmaları bu lezyonlar gelen genetik materyali korumak için yetersiz olduğunu kanıtlar sağlayarak, bir doku belirli bir şekilde (karaciğer> böbrek> beyin) yaşla birikimi olduğu tespit edilmiştir. 13. Nitekim, nükleotid eksizyon onarımı (NER) tek yolunun şu anda bu lezyonların onarımı için tanımlanır. 2
Iki sınıfŞekil 1 ve 5'te gösterilen bileşiklerin es, şu anda ticari olarak mevcut değildir ancak literatürde tarif edilen sentetik stratejiler tarafından ticari kullanım için, bu bileşiklerin hazırlanması için zor değildir.
Kimyasal biyoloji çalışmaları tarafından sağlanan multidisipliner yaklaşım sadece biyolojik ortamda meydana gelen yeni mekanizmalar belirlenmesinde büyük bir değeri vardır, ama aynı zamanda sonuçta sağlık ve korunma stratejileri yenilik getiren, biyolojik keşif ve teşhis için temel bir katkı sağlar. 14. Kimyasal katkı onlar öngörülebilir olabilir zaman belirsizlikleri ve başarısızlıkları azaltarak tedavi ve beslenme ya müdahale tasarımının optimum rasyonelleştirilmesi, izin bekleniyor metabolik profil için entegre platformları ve paneller oluşturma, moleküler tıp başarılı gelişimi için gereklidir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Ministero dell'Istruzione, dell'Universita della ricerca (PRIN-2009K3RH7N_002) ve Marie Curie Intra-Avrupa Bursu (CYCLOGUO-298555) yanı sıra, 'Ücretsiz Kimyasal Biyoloji Radikaller ve COST Action ilgili COST Action CM0603 arasında sponsorluk Mali destek "Biyomimetik Radikal Kimya" konulu CM1201 şükranlarımızı sunarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATERIALS | |||
| Cholesteryl linoleate ≥98% | Sigma-Aldrich | C0289-100 mg | |
| Cholesteryl arachidonate≥95% | Sigma-Aldrich | C8753-25mg | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250-100 ml | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | |
| Methanol 215 SpS | Romil | H409-2,5 L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Chloroform SpS | Romil | H135 2,5 L | |
| n-Hexane 95% SpS | Romil | H389 2,5 L | |
| Acetonitrile 230 SpS | Romil | H047 2,5 L | |
| Dichloromethane SpS | Romil | H2022,5 L | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 107344-1L | |
| Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
| Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966-1L | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| NaOH solid | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| NH4OH sol. 28%-30% | Sigma-Aldrich | 221228-1L-A | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | |
| Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride | Sigma-Aldrich | 221759-100G | |
| Ammonium Molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302-100G | |
| Sulfuric Acid 95%-98% | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | 209139-25G | |
| Sodium sulfate anhydrous | Sigma-Aldrich | 238597-500G | |
| Nuclease P-I from penicillium citrinum | Sigma-Aldrich | N8630-1VL | |
| Phosphodiesterase II type I-sa | Sigma-Aldrich | P9041-10UN | |
| Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc | Sigma-Aldrich | E114-25MG | |
| Phosphatase alkaline type VII-t from*bov | Sigma-Aldrich | P6774-1KU | |
| Phosphodiesterase I type VI | Sigma-Aldrich | P3134-100MG | |
| Deoxyribonuclease II type IV from*porcin | Sigma-Aldrich | D4138-20KU | |
| Trizma(r) base, biotechnology performanc ce | Sigma-Aldrich | T6066-100G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644-100G | |
| Succinic acid bioxtra | Sigma-Aldrich | S3674-250G | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670-100G | |
| Formic acid, 98 % | Sigma-Aldrich | 06440-100ML | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Millipore | UFC500324 | |
| 8-Bromo-2'-deoxyguanosine | Berry Associates | PR3290-1 g | |
| 8-Bromo-2'-deoxyadenosine | Berry Associates | PR3300-1 g | |
| Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
| Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
| 2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3899-CA-0.1 | |
| 2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3895-0.1 | |
| Nitrous oxide (N2O) | Air Liquide | ||
| Deoxyribonucleic acid from calf thymus | Sigma Aldrich | D4522-5MG | |
| EQUIPMENT | |||
| 60Co-Gammacell | AECL- Canada | 220 | |
| Immersion well reaction medium pressure 125 watts | Photochemical reactors ltd | Model 3010 | |
| Evaporating flask 250 ml | Heidolph | P/N NS 29/32 514-72000-00 | |
| Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm | Phenomenex | 00A-4252-E0 | |
| Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm | Grace | 88081 | Semipreparative |
| SecurityGuard Kit | Phenomenex | KJ0-4282 | Analytical holder kit and accessories |
| Holder for 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7220 | Semipreparative holder |
| 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7221 | |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1100 | |
| LC/MS/MS | Applied Biosystems | 4000QTRAP System | |
| Tandem mass ESI spectrometer | (Bruker Daltonics) | Esquire 3000 plus | |
| Vial 2-4 ml | SUPELCO | Cod 27516 | |
| Vial 4 ml | SUPELCO | Cod 27517 | |
References
- Ferreri, C., Chatgilialoglu, C. Membrane lipidomics and the geometry of unsaturated fatty acids: from biomimetic models to biological consequences. Methods Molecular Biology. 579, 391-412 (2009).
- Chatgilialoglu, C., Ferreri, C., Terzidis, M. A. Purine 5',8-cyclonucleoside lesions: chemistry and biology. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1368-1382 (2011).
- Chatgilialoglu, C., Ferreri, C., et al. Radiation-induced reductive modifications of sulfur-containing amino acids within peptides and proteins. Journal of Proteomics. 74 (11), 2264-2273 (2011).
- Chatgilialoglu, C., Ferreri, C. Trans lipids: the free radical path. Accounts Chemical Research. 38 (6), 441-448 (2005).
- Melchiorre, M., Torreggiani, A., Chatgilialoglu, C., Ferreri, C. Lipid markers of geometrical radical stress: synthesis of mono-trans cholesteryl esters isomers and detection in human plasma. Journal of the American Chemical Society. 133 (38), 15184-15190 (2011).
- Wang, J., Yuan, B., Guerrero, C., Bahde, R., Gupta, S., Wang, Y. Quantification of Oxidative DNA Lesions in Tissues of Long-Evans Cinnamon Rats by Capillary High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with Stable Isotope-Dilution Method. Analytical Chemistry. 83 (6), 2201-2209 (2011).
- Boussicault, F., Kaloudis, P., Caminal, C., Mulazzani, Q. G., Chatgilialoglu, C. The fate of C5' radicals of purine nucleosides under oxidative conditions. Journal of the American Chemical Society. 130 (26), 8377-8385 (2008).
- Ferreri, C., Kratzsch, S., Brede, O., Marciniak, B., Chatgilialoglu, C. Trans lipids formation induced by thiols in human monocytic leukemia cells. Free Radicals Biology & Medicine. 38 (9), 1180-1187 (2005).
- Zambonin, L., Ferreri, C., et al. Occurrence of trans fatty acids in rats fed a trans-free diet: a free radical-mediated formation. Free Radicals Biology & Medicine. 40 (9), 1549-1556 (2006).
- Puca, A. A., Andrew, P., et al. Fatty acids profile of erythrocyte membranes as possible biomarker of longevity. Rejuvenation Research. 11 (1), 63-72 (2008).
- Belmadoui, N., Boussicault, F., et al. Radiation-induced formation of purine 5',8-cyclonucleosides in isolated and cellular DNA: high stereospecificity and modulating effect of oxygen. Organic & Biomolecular Chemistry. 8 (14), 3211-3219 (2010).
- Chatgilialoglu, C., Bazzanini, R., Jimenez, L. B., Miranda, M. A. (5'S)- and (5'R)-5',8-cyclo-2'-deoxyguanosine: mechanistic insights on the 2'-deoxyguanosin-5'-yl radical cyclization. Chemical Research in Toxicology. 20 (12), 1820-1824 (2007).
- Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5'-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
- Ferreri, C., Chatgilialoglu, C. The role of fatty acid-based functional lipidomics in the development of molecular diagnostic tools. Expert Review of Molecular Diagnostics. 12 (7), 767-780 (2012).
