Summary
מאמר זה מתאר שיטה חדשה לזיהום אוראלי של עכברים באמצעות
Abstract
חיידקי L. הם חיידקים פתוגנים תאיים פקולטטיביים הגורמים לזיהומים בבני אדם שמקורן במזון. מעט מאוד ידוע על שלב העיכול של ליסטריה בשל חוסר מודל חיה קטן המחקה מחלה אנושית באופן הדוק. מאמר זה מתאר מודל עכבר חדשני להעברה אוראלית של ל ' חיידקי. שימוש במודל זה, עכברים שהוזנו ל חיידקי מזוהמים יש לחם שלב דיסקרטי של זיהום במערכת העיכול, ואחריו בדרגות שונות של התפשטות מערכתית בזנים רגישים (BALB / ג / מאת / י) או עמידים (C57BL / 6) עכבר. בשלבים מאוחר יותר של הזיהום, הפצתו לכיס המרה והמוח הוא ציין. מודל שמקורן במזון של ליסטריה הוא לשעתקו מאוד, אינו דורש כישורים מיוחדים, וניתן להשתמש בו במגוון רחב של חיידקים ובודד זני עכבר מעבדה. ככזה, הוא המודל האידיאלי ללמוד שתי האסטרטגיות ארסיות בשימוש על ידי ל ' חיידקי
Introduction
חיידקי ליסטריה הם חיידקים פתוגנים תאיים פקולטטיביים הגורמים לזיהומים בבני אדם שמקורן במזון. החיידקים עמידים בפני רבים של תהליכים המשמשים להגנת אספקת המזון שלנו, כגון ייבוש, המלחה, או 1,2 קירור וזיהומים מקושרים בדרך כלל ל, מזונות "מוכן לאכילה" מעובדים שאינם מחוממים לפני הצריכה . בכמה התפרצויות קודמות, מקור ל ' מזון מזוהם חיידקי-זוהה, והקבוצה המצומצמת של אנשים שנחשפו הייתה פיקוח הדוק 3-6. בדוגמאות אלה, מחלה קלינית באנשים בריאים נעה בין קיבה ומעיים קלים, הגבלה עצמית לדלקות מעיים ומערכתיות חמורות יותר שנזקק לאשפוז. L. זיהומי חיידקי באנשים שנפרצו חיסוניים, כולל שני תינוקות והקשישים, היו קשורים עם שיעור תמותה גבוה (25-30%), אפילו עם טיפול אנטיביוטי
המודל הנפוץ ביותר של דלקת ליסטריה הוא חיסון (IV) תוך ורידי של עכברים. המודל הרביעי הוא לשעתקו מאוד, והיה מאוד שימושית לחקר תגובות תא T הן נאיביות וזיכרון במהלך זיהום 9,10. החסרון של המודל הרביעי הוא שהיא עוקפת את שלב העיכול של זיהום לחלוטין. אחרי שידור שמקורן במזון, רירית המעיים מספקת מחסום שמאט כנראה ומגביל את מספר החיידקים כי הרף יכול להפיץ לרקמות היקפיות. לעומת זאת, ניתן למצוא את כל הבידוד בטחול ובכבד בתוך דקות של IV ממשל, ובולוס הגדול הזה של אורגניזמים עשוי להציף ד חיסון מולדיםefenses ברקמות אלה. משמש זיהום אוראלי של עכברים על ידי gavage פחות נפוץ, כי מנות גדולות (10 -10 11 CFU 9) נדרשות בדרך כלל כדי להשיג קולוניזציה מעיים 10. כמו כן, חיסון (IG) intragastric עם מחט האכלה אינו יוצר תקופת שחזור של זיהום במערכת העיכול לפני ההתפשטות מערכתית. מעבדות אחדות דיווחו כי ל ' חיידקי מגיעים לטחול וכבד בתוך 4-12 שעות לאחר זיהום (HPI), בעוד שאחרים לא הראו התפשטות מערכתית עד 48 HPI 11-15. וריאציה מעבדה למעבדה זו עשויה להיות תוצאה של האופי הפולשני של IG חיסון, אשר יכול לגרום לטראומה קלה לרירית של הוושט, ולקדם את פלישת דם ישירה של החיידקים.
לאחרונה פיתחנו מודל עכבר רומן של אוראלי L. חיידקי לזיהום שמחק באופן הדוק כל שלבי מחלה אנושית 16. הדבקה מתרחשת כאשר העכברים לבלוע חתיכות של המשךaminated מזון, תהליך שהוא לא טראומטי, ואינו דורש כישורים מיוחדים על ידי חוקרי מעבדה. לתקופה של זמן בדיד (36-48 שעות), ל ' חיידקי reproducibly ליישב רק במערכת העיכול, ובכך מאפשרים חקירה של המנגנונים המשמשים ליסטריה פתוגניים translocate פני רירית המעיים ולהפיץ לרקמות היקפיות. חשוב מכך, ניתן להשתמש במודל כדי ללמוד הבדלים בהתנגדות מולדת מארחת לזיהום. במחקר קודם, הראינו שBALB / ג / מאת / עכברי J היו רגישים מאוד ליסטריה שמקורן במזון, עם שכפול מעריכי של ל ' חיידקי המתרחשים במעיים, הטחול, הכבד וכיס מרה 16. לעומת זאת, עכברי C57BL / 6 היו עמידים לזיהום שמקורן במזון, עם התישבות זמנית בלבד של ל ' חיידקי המתרחשים בכל אחת מרקמות אלה. תכונה נוספת של המודל שמקורן במזון המחקה מחלה אנושית הדוק היא הפצה טבעיתלמוח התרחש בשלבים מאוחר יותר של הזיהום (dpi 5-7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת אגר תקשורת סלקטיבית (BHI / L + G) כדי לעכב חיידקי מעיים
- לשקול את 26 גרם מוח לב עירוי אגר (Difco), 7.5 גר 'LiCl ו5.0 גרם גליצין ומקום בבקבוק 1 ליטר. הוספת 500 מ"ל של מים מזוקקים.
- חום על stirrer מגנטי עד שחין אגר, תוך בחישה רצופה. קח את הבקבוק את החום, לתת לבועות להתיישב לזמן קצר, ולאחר מכן להחזיר שוב לרתיחה.
- . חיטוי למשך 30 דקות ב 121 מעלות צלזיוס מתחת 16-19 psi על מחזור נוזלי שים לב: לעזוב את הבר סערה בבקבוק.
- לאזן את התקשורת ל -55 מעלות צלזיוס באמבט מים, או שמגניב ב RT. אל תאפשר הפתרון ליקבל קריר יותר מאשר 55 מעלות צלזיוס או גבישים תהווה באגר. את הגבישים לא לעכב L. חיידקי לצמיחה או משפיעה על התכונות סלקטיבית של אמצעי התקשורת. עם זאת, הגבישים יהיו דומים במראהו למושבות קטנות ויעשו את זה קשה לספור CFU חיידקים.
- לערבב בעדינותאגר 1 דקות באמצעות stirrer מגנטי. למנוע היווצרות של בועות אוויר. יוצקים את אגר בצלחות פטרי (~ 25 מ"ל / צלחת).
הערה: זה תקשורת אינה תומכת בצמיחה של כל L. זני חיידקי. לדוגמה, ל ' EGDe חיידקי גדל היטב על אגר זה, עם מושבות גלויות בתוך 36-48 שעות, אבל 10403s לא גדל על המדיה הזו.
2. הכנת inoculum
- חותכים לחם לבן פרוס (קרוגר) לתוך קטן (2-3 מ"מ) קוביות באמצעות להב מספריים סטרילי אורה סטרילי אזמל. אל תשתמש בקרום. לאחסן יצירות בודדות בצינורות microcentrifuge ב -20 ° C עד היום של הזיהום.
- באמצעות אזמל סטרילי, לחתוך (0.5-1 ס"מ) גושים קטנים של חמאה מלוחה (קרוגר) ולמקם כל אחד בצינור microcentrifuge סטרילי. צינור אחד יכיל מספיק חמאה כדי להכין 50 - 60 חתיכות לחם. חנות ב -20 ° C עד הצורך.
- לגדול ל חיידקי בBHI מרק רועדים ב 30 &מעלות; C עד התרבות מגיעה OD של 600 ~ 0.8-1.0. הכן 500 aliquots μl בצינורות microcentrifuge, דואג למערבולת המדגם בתדירות גבוהה כל כך כל הצינורות מכילים את אותו המספר של חיידקים. חנות ב -80 ° C.
- לכיילתי את aliquots החיידקים, להפשיר צינור על קרח, ואז מוסיף 500 מ"ל 9.5 μl לBHI מרק. דגירה של מעמד HR 1.5 ב 30 ° C. דילולים סדרתי צלחת על אגר BHI. מצפה כייל של ~ 1-5 x 10 8 CFU / מ"ל. הערה: אם aliquots הומוגניות מוכן, יכול לצפות כל אחד מהצינורות להניב כייל זה בעת שהוכן באופן דומה עם שונות של 2 עד 4 פי.
- כדי להדביק עכברים, להכין aliquot של ל ' חיידקי כמתואר בשלב 2.4. כ -20 דקות לפני L. תרבות חיידקי מוכנה, להפשיר את חתיכות הלחם בRT. ממסים aliquot של חמאה על 55 מעלות צלזיוס ונפח קטן מראש חם של PBS ב 55 ° C. הכן חתיכות מספיק לחם, כך שיש לפחות אחד לכל עכברלהיות נגוע וחתיכה נוספת אחד לפחות לקביעת כייל של הבידוד בפועל.
- המבוסס על כייל קבוע מראש של aliquot החיידקים, לחשב את הנפח הכולל של ל ' תרבות חיידקי דרושה כדי להכין inocula למספר הנדרש של חתיכות לחם. גלולת חיידקים על ידי centrifuging ב 14,000 XG במשך 10 דקות לשאוב את כל המרק וBHI resuspend את החיידקים בנפח קטן של PBS מחומם מראש (חתיכת μl / לחם 2).
- מערבולת החמאה המומסת, להוסיף לחיידקים (באמצעות נפח כולל שווה לפיסת μl / לחם 3) ומערבבים היטב. הערה: אל תנסו להכין יותר מ 10-15 חתיכות לחם בזמן זה או החמאה יהיה לגבש.
- עבודה במהירות, μl פיפטה 5 של ההשעיה החיידקים על גבי פיסת לחם אחת בצינור microcentrifuge. הפתרון צריך להיספג לחלוטין על ידי חתיכת הלחם.
- כדי לקבוע את כייל בפועל של הבידוד, להוסיף 1 מיליליטר סטרילי PBS לאחד piec הלחםes. וורטקס במרץ דקות 1. הכן דילולים סידוריים וצלחת גם BHI וBHI / L + G אגר.
- הליך חלופי לכייל גבוה (> 10 9 CFU) inocula. אם גלולה חיידקים הוא גדול מדי, זה יכול להיות קשה כדי להשעות בנפח כל כך קטן, וכתוצאה מכך החומר הוא צמיג מאוד, כמו דבק, וכמה מהבידוד עשוי להיצמד לדפנות צינור microcentrifuge. במקרה זה, עדיף לחסן את הלחם בצלחת תרבות 60 מ"מ סטרילי, ולהציע לכל המנה (ללא מכסה) לעכבר (ראה להלן). כל הבידוד עודף שלא נספג על ידי הלחם ולאחר מכן ניתן לאכול ישירות על ידי העכבר. באופן כללי, זה לוקח יותר זמן לעכברים לאכול את כל הלחם וללקק את הצלחת נקיות מהפרוטוקול הסטנדרטי המתוארים להלן, ולכן זה רק השיטה המועדפת בעת התמודדות עם inocula כייל גבוה מאוד.
3. זיהום של עכברים
- לרכוש נשי BALB / ג / מאת / י (0,010,026 מניות #) וC57BL/6/J (מניית# 000,644) מג'קסון המעבדה (בר הרבור, ME) ולהשתמש ב6-9 שבועות של גיל.
- מהר עכברי היום אחד (24 שעות) לפני ההדבקה על ידי הסרת את האוכל ולהניח את העכברים בהעלה ריצוף חוט (1 אינץ) (3 # רשת; אלנטאון) כדי למנוע coprophagy. להשאיר מספיק מצעים רק בכלוב לספוג שתן, אבל לא מספיק כדי לרומם את הצואה לשפוך. לאפשר גישה החופשית למים.
- להדביק את העכברים בתחילת מחזור הכהה, עובד במכסת מנוע זרימה למינרית לבוש עם הנורה אדומה. העבר את עכבר אחת לכלוב ריק (ללא מצעים). בעזרת מלקחיים סטריליים, להעביר את חתיכת הלחם המזוהמת לחלק התחתון של הכלוב הריק. בדרך כלל, העכבר יהיה להרים את חתיכת הלחם ולצרוך אותו לחלוטין בתוך 2-10 דקות. אם העכבר לא לאכול את הלחם מייד, להחזיר את הכלוב למדף ולהשאיר את העכבר ללא הפרעה במשך 20-30 דקות. הרוב המכריע של בעלי חיים לאכול את הלחם תוך פרק זמן זה, עם זאת, ניתן להשאיר את העכברים באין מפריע, ללא גישה לotהאוכל שלה או מים לתקופה של עד 2 שעות.
- לאחר הדבקה, להחזיר את העכבר לכלוב המקורי שלו ולחדש את צ'או העכבר. תמשיך לבית העכברים בריצוף החוט העלה לתקופת הניסוי.
4. ניטור הרמה של חיידקי Shed בצואה
- צינורות תווית וmicrocentrifuge מראש שוקל לשמש לאיסוף צואה.
- עובד במהירות לאחר אחזור לכלוב של עכברים, למקם את כל עכבר בכוס פלסטיק 500 מ"ל. בדרך כלל העכברים יגרשו 1-4 כדורי צואה בתוך 5 דקות.
- השתמש במלקחיים סטריליים להעברת צואה לצינורות שכותרתו כראוי.
- לשקול כל צינור ולחשב את המשקל של הצואה על ידי הפחתת המשקל של הצינור הריק. משקלים אופייניים לכדורי צואה נעים 10-30 מ"ג.
- הוסף PBS על צינור אחד (200 מ"ג μl/30 צואה) ולהשתמש בקיסם סטרילי לכתוש את כדורי הצואה.
- מערבולת צינור אחד למשך 30 שניות, ואז להכין דילולים ולוחית מספר סידוריים על BHI / L+ G אגר. לספור את מספר המושבות ולחשב צואת CFU / מ"ג.
5. עיבוד של רקמות מעיים נגועות
- להרדים את העכברים, סביבה נקיה מחיידקים לקצור קיבה ומעיים מכל עכבר כרקמה אחת ולאסוף במנות ריקות 100 מ"מ פטרי.
- הפרד את המעי דק, מעי גס, וcecum ומניח בצלחות נפרדות 60 מ"מ המאוחסנות על קרח. המעי הדק ניתן לחלק עוד יותר על ידי אורך לשלושה חלקים שווים דומים תריסריון, מעי ריק והמעי עקום כדי להקל על ההסרה של תוכן luminal. לאחר מכן ניתן לעבד את שליש הרקמות או יחד (לCFU למעי דק שלם) או בנפרד. רקמות רטובות ~ 0.5 מ"ל סטרילי PBS לשמור גמישות ולמנוע דמעות במהלך טיפול.
- ממלאי מזרק מ"ל 10 עם 8 מ"ל סטרילי PBS ולצרף מחט גרם 25. שימוש במלקחיים סטריליים כדי לסחוט את התוכן לתוך כוס luminal פסולת (או צינור 50 מ"ל סטרילי אם אוסף את חיידקי luminal). שפעותשעות 4 מ"ל PBS דרך קצה אחד של הרקמה, השתמש במלקחיים כדי לסחוט את התוכן, ולאחר מכן להפוך את הרקמה שוב ולחזור בצד השני.
- כדי לכמת את מספר ליסטריה בתכני luminal, צנטריפוגה חום אספו עבור 20 דקות ב XG 12,000, להשעות גלולה ב 0.5 - 1.0 מיליליטר מים סטריליים.
- כדי לכמת את המספר הכולל של כמות תאים הקשורים ליסטריה, לפתוח כל רקמות נשטפו על ידי חיתוך longitudinally עם להב אזמל סטרילי, ולאחר מכן לבצע כמה חתכים לרוחב לחתוך את הרקמה לרסיסים קטנים. הערה: צעד זה הוא חיוני כדי להבטיח כי רקמת המעי לא לעטוף את להב homogenizer. מעבירים את חתיכות מעיים לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל מים סטריליים 2 מ"ל.
- לעקר homogenizer רקמות (פישר PowerGen 1000) על ידי הצבת החללית באתנול 70% -60% בכוח למשך 30 שניות. חכה לאתנול לאוויר יבש, או תהליך במים סטריליים עבור 10 שניות. Homogenize כל tissue דקות 1. חזור על טיפול עם מים סטריליים בין מדגם זה, ולהשתמש באתנול 70% בין קבוצות לדוגמה.
- הכן דילולים סדרתי של כל דגימה במים וצלחת על BHI / L + G אגר סטרילי.
6. עיבוד של בלוטות לימפה נגועות mesenteric
- בלוטות לימפה קציר הסביבה נקיה מחיידקים, מניחים בצלחת 60 מ"מ סטרילי על קרח, ולהשתמש במלקחיים סטריליים כדי להסיר כל השומן המצורף. לצפות למצוא 3-6 צמתים לכל עכבר.
- הכן את מסכים רשת תיל על ידי חיתוך חתיכות מרובעות 1.5-2 סנטימטר של פלדה אל חלד # 80 מש. לעשות חתך קטן בכל פינה, ומקפל את ארבעת צדדים, יצירת מיטה מורמת. טובלים באתנול 95% ולאחר מכן להבה לעקר, ומניחים בצלחת פטרי המכילה 60 מ"מ 0.75 מיליליטר מים סטריליים. לאחר כל שימוש, ניתן למחזר את המסכים על ידי השריית באתנול 70% במשך 20 דקות, קרצוף עם מברשת כדי להסיר רקמות משובצות, רותח במשך 20-30 דקות ב2N NaOH, ולאחר מכן שטיפה במים בהרחבה.
- השתמש את הבוכנהממזרק מ"ל 3 סטרילי לכתוש את בלוטות באמצעות מסך רשת. הקפד לדחוף למטה על המסך לתחתית הצלחת כך שהוא יוצר מגע עם המים בצלחת.
- לעבור 0.75 מיליליטר מים סטריליים דרך המסך ולאחר מכן פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשטוף את המסך. להעביר את ההשעיה תא צינור microcentrifuge.
- ורטקס כל מדגם נמרץ למשך 30 שניות לlyse התאים. הכן דילולים ולוחית מספר סידוריים משני BHI / L + G אגר.
7. עיבוד של spleens נגוע, כבדים, וכיס מרה
- אחוז טחול עם מלקחיים סטרילית ולשחרר על ידי ביצוע שני חתכים, אחד בכל קצה. מקום בצינור המכיל 15 מיליליטר מים סטריליים 2.5 מ"ל. (הערה: צינורות עם תחתית עגולה עשויים להיות קלים יותר לשימוש עם homogenizer.)
- אתר את כיס המרה (צק נוזלים צהוב קטן המחובר אל הכבד) ולגזור בזהירות עם מספריים סטריליים לניתוק מכבד ללא להתפקע. Transfאה לצינור microcentrifuge המכיל מים סטריליים 1 מ"ל.
- הסביבה נקיה מחיידקים להסיר את הכבד, והקפד להסיר את כל האונות, ולהעביר צינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 2.5 מ"ל של מים סטריליים.
- Homogenize טחולים וכבדים כמתואר לעיל למשך 30 שניות על 60% כוח. שלפוחיות Forgall, להשתמש במספריים סטריליים לקרוע לגזרים בצינור microcentrifuge, ולאחר מכן מערבולת במרץ למשך 30 שניות.
- הכן דילולים וצלחת כל דגימה משני BHI או BHI / L + G אגר סדרתיים.
8. עיבוד של מוח נגוע
- עבודה מהצד האחורי של העכבר, לחתוך את העור ורקמה שמעל לצוואר, ועל פני שתי האוזניים בזווית של 45 מעלות. השתמש במלקחיים סטריליים כדי לקלף את הדש בצורת U של עור על ידי משיכת לכיוון האף ולחשוף את הגולגולת ועצמות פנים.
- לשתק את הגולגולת על ידי החזקת הרכס הגרמי בין העיניים עם מלקחיים, ולהשתמש במספריים כדי לבצע חתכים רדודים ברחבי הקצוות לרוחב של הגולגולת. להיותזהיר לחתוך רק את העצם ולא רקמת המוח. בשלב הבא, לחתוך את הרכס הגרמי בין העיניים. השתמש במלקחיים כדי להחזיק את החלק העליון של הגולגולת ומושך לאחור (לכיוון הצוואר) כדי לחשוף את המוח.
- רם בעדינות את המוח מהחלל שלה באמצעות מלקחיים ומקום סטריליים בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 1.5 מיליליטר מים סטריליים.
- Homogenize במשך 20 שניות בכוח 60% כפי שתואר לעיל. הכן דילולים ולוחית מספר סידוריים משני BHI או BHI / L + G אגר.
9. נוהל משלים: חלוקה של רקמות מעיים
9.1 בידוד של חיידקים בחלק ריר
- לכל רקמת מעי, להכין 3 צינורות המכילים 3 מ"ל של N-acetylcysteine 6 מ"מ (NAC; סיגמא #-9165).
- הנח את סמוק וlongitudinally לחתוך רקמות בצינור הראשון עבור 1-2 דקות, כל 20-30 במרץ מתערבל שניות. בעזרת מלקחיים סטריליים, להרים את הרקמות ובעדינות ללחוץ על הצד של הצינור כדי להסיר עודפי סבון נוזלייםid.
- חזרו על פעולה פעמיים נוספת 9.1.2 באמצעות צינורות NAC הנותרים. הסר את רקמת המעי ומניח בצד לעיבוד נוסף.
- בריכת שוטף NAC (כולל של 9 מ"ל), ו צנטריפוגות במשך 20 דקות ב 12,000 x גרם.
- Resuspend את הכדור במים סטריליים, מערבולת למשך 30 שניות, להכין דילולים ולוחית מספר סידוריים על BHI / L + G.
9.2 בידוד של חיידקים בתא חלק אפיתל (EC)
- לחתוך כל רקמה לחתיכות קטנות עם מספריים סטריליים ומניח בשפופרת 50 מ"ל המכילה 5 מ"ל של RPMI (Invitrogen # 21870) בתוספת 5% FBS (RP-5), 5 מ"מ EDTA, וDTT 1 מ"מ. דגירה לוחץ על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- מעבירים את חתיכות מעיים לצינור טרי המכיל RP5/EDTA/DTT 5 מ"ל ו דגירה רועדת על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שמור את התקשורת מהצינור הראשון ומניח בצד על 37 ° C. חזור על תהליך זה פעם נוספת עבור סכום כולל של שלושה 20 דקות בincubations RP5/EDTA/DTT. אם תמשיך לlamina propria ISOצעד רח, להעביר את חלקי המעיים שנותרו לתוך צינור 50 מ"ל ריק.
- שלב שלושה שוטף RP5/EDTA/DTT (נפח כולל של 15 מ"ל) ו צנטריפוגות במהירות נמוכה (1,200 XG) לגלולת התאים.
- כדי לכמת חיידקים תאיים, לאסוף את supernatant ו צנטריפוגות במשך 20 דקות ב 12,000 x גרם. Resuspend גלולה ב0.5 - 1.0 מ"ל מים סטריליים ודילולי סדרתי צלחת על BHI / L + G אגר.
- למנות חיידקים תאיים, resuspend גלולה EC ב 5 מ"ל של RP-5 המכילים 25 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין. דגירה ההשעיה התא בודדת למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ועוד 7% CO 2 להרוג כל שנותר ל 'תאי חיידקי. לשטוף את התאים פעמים PBS, להשעות במי 0.5 מ"ל סטרילי, ומערבולת למשך 30 שניות לlyse התאים. הכן דילולים סידוריים במים וצלחת על BHI / L + G.
הערה: התאים שנאספו בשלב זה גם יכילו תאים מהתיקונים של Peyer הבסיסי. אם תרצה, Peyer הגלוי שלניתן להסיר כתמים מרקמות המעיים לפני השטיפה וחיתוך longitudinally.
9.3 בידוד של חיידקים בחלק Lamina propria (LP)
- יש לשטוף DTT / EDTA העודפים מחלקי המעיים על ידי הוספת 25 מ"ל סטרילי PBS לצינור. לנער במרץ, להעביר לתוך צינור טרי וחזור פעמיים.
- מעבירים את חתיכות מעיים לשפופרת 50 מ"ל המכילה 4 מ"ל של תמיסת עיכול המורכבת של RP-5 בתוספת סוג 1 מ"ג / מיליליטר IV collagenase ו40 מיקרוגרם / מיליליטר DNAse אני רועד דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
- מעבירים את החתיכות לא מעוכלות לתוך צינור טרי המכיל 4 פתרון עיכול מ"ל ולחזור פעם או פעמיים עד שחתיכות הרקמה מתעכלות לגמרי. שמור כל אחד מפתרונות העיכול, המכילים תאי LP משוחררים, ב 37 ° C.
- צנטריפוגה את פתרונות העיכול אספו במהירות נמוכה (1,200 XG) לגלולת התאים. לעבד את supernatant ותא גלולה בנפרד כdescribed לעיל כדי למנות חיידקים תאיים ו תאיים, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מושבות חיידקי L. תהיה גלויות על BHI / L + G צלחות לאחר הדגירה 36-48 שעות ב 37 ° C. יש מושבות מראה חלק, בצורת כיפה שמנת לבנה (איור 1 א). צמיחה תהיה עכבות עבור רוב חיידקי המעיים, אבל זה נפוץ לראות כמה מושבות שאינן L. חיידקי, במיוחד כאשר ציפוי מעי דק או מעי גס ישירות ללא דילול משמעותי (איור 1). ניתן לאשר מושבות חשודות על ידי ציפוי על צלחות ליסטריה ChromAgar TM. L. חיידקי מופיעים כמושבות כחולות מוקפות בהילה לבנה על צלחות אלה (איור 1 ג). המגבלה של גילוי ל חיידקי בכל רקמות תלויים בכמות מים המשמשת לhomogenize רקמות. את כרכי המדגם מוצגים בטבלה 1 מייצגים את הנפח מינימאלי דרושים כדי לעבד כל רקמות ביעילות. Homogenates של טחול, gכל שלפוחית השתן, המוח, או רקמת מעי מופרד יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 ימים ומצופית מחדש במידת צורך. מעי גס, מעי דק או homogenates הכבד יכול לעכב חלק ל ' גידול חיידקי, אלא אם כן מדגם דילול מספיק (1D איור), וhomogenates אלה לא יניבו ספירת CFU דומה אם מחדש מצופה לאחר האחסון ב 4 ° C.
אנחנו בעבר הראו כי BALB / ג / מאת / J (BALB) עכברים היו באופן משמעותי יותר רגיש ליסטריה שמקורן במזון מאשר C57BL / 6 (B6) 16 עכברים. הבידוד של 10 7 CFU די בכך כדי להקים זיהום מעיים בעכברי BALB, אך יש צורך בלפחות 10 8 CFU ליישב את מערכת העיכול של עכברי B6 (איור 2). כפי שמוצג באיור 2, עומס החיידקים בשלפוחית מעיים, טחול, הכבד וכיס מרה יהיה פרופורציונלי למינון האתגר שניתן לעכברים. מחקרים ראשוניים מראים כי 5 X 10 9 CFU הואLD המשוער 50 לBALB / ג / מאת / עכברי J באמצעות מודל זה 16.
איור 1. צמיחת מושבה נציג על צלחות אגר סלקטיבית.) ל ' מושבות חיידקי לאחר צמיחת 48 שעות בBHI / L + G אגר. ב ') BHI / L + G אגר מעכב את הצמיחה של חיידקי המעיים ביותר, אבל כמה מושבות שאינן ליסטריה (חץ) אפשר לראות בדילולים נמוכים. הצלחת אגר מוצגת כאן מכילה 100 μl של 10 -1 דילול של מחצית מהצלחת, ו50 μl כל אחד 10 -2 ו -10 דילולים -3 של homogenate מעי גס. C) ל ' ניתן לאשר מושבות חיידקי על ידי צמיחה בצלחות ליסטריה אגר כרום. L. חיידקי יופיעו כחולים עם הילה לבנה סביב המושבה. ד) אין זה נדיר ליםEE עיכוב של ל ' גידול חיידקי, וכתוצאה ממושבות בגדלים שונים, בדילול הנמוך ביותר של שתי צלחות homogenates כבד מעיים או בBHI / L + G אגר.
איור 2. תגובת מינון של זיהום שמקורן במזון בBALB / ג / מאת / J ועכברים C57BL / 6. BALB / ג / מאת / י (BALB) וC57BL / 6 (B6) נקבות עכברים היו נגועה עם 10 9 (N = 7), 10 8 (N = 8), 10 7 (n = 6) ו10 6 (n = 4) מ 'ו"מ InlA מספר CFU בכל רקמה נקבעו 5 dpi. ממוצע ערכים + / - SD מוצג. הנתונים אספו משני ניסויים שונים נותחו. קווים מקווקווים מציינים את המגבלה של זיהוי בכל איבר.
| רקמה | נפח דגימה (מ"ל) | גבול של זיהוי (CFU) |
| מעי דק | 2.0 | 50 |
| Cecum | 2.0 | 50 |
| מעי גס | 2.0 | 50 |
| בלוטות לימפה mesenteric | 1.5 | 15 |
| טחול | 2.5 | 50 |
| כבד | 2.5 | 50 |
| כיס מרה | 0.5 | 10 |
| מוח | 1.5 | 15 |
טבלת מס '1. גבול של זיהוי לליטר. חיידקי ברקמה. homogenates סך נפח דגימה ממוצע בהיקף של מים סטריליים בתוספת הרקמה הומוגני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עכברים טהורים אינם אחיד פתוחים להאכלה בכל שעות היום, והנכונות שלהם לאכול את הלחם המזוהם יהיו תלויים גם בסוג והזן של עכברי גיל 17. מניסיוננו, 6-9 B6 עכברים ישנים בשבוע הם פתוחים להאכלה בכל שעה ביום, אבל עכברי BALB לא לאכול חתיכת הלחם באופן עקבי אלא אם כן הוא הציע במהלך המחזור האפל שלהם. המחזור של החדר המשמש לבית החיות האור ניתן לשנות כל כך עולה בקנה אחד עם השלב הכהה יום העבודה הרגיל לאנשי מעבדה. עם זאת, יש לתת את העכברים לפחות שבועיים להסתגל למחזור האור שינה לפני ההדבקה. במהלך הזיהום, רק מנורות אדומות יש להשתמש בכל אחת החדר עצמו או במכסת מנוע הזרימה למינרית.
בפיתוח מודל זה, לחם נבחר כמקור מזון להעברה ל חיידקי במידה רבה משום שלחם הוא סופג. לכן, זה היה קל כדי להרוות חתיכות קטנות עם הדואר הבידוד חיידקים ולהבטיח כי כל עכבר לבלוע מנה זהה. עם זאת, מודל זה יכול להיות מותאם בקלות להשתמש במקורות מזון אחרים. ואכן, זו היא מודל העכבר היחיד שיכול לשמש כדי לבחון את ההשפעה של הרכב מזון או תנאי אחסון בinfectivity חיידקים באופן ישיר. L. חיידקי יכולים להסתגל בקלות לצמיחה במלח גבוה, pH הנמוך, או טמפרטורות קרות 1,2,18, אבל זה לא ידוע אם תנאי הגידול האלה משנים את היכולת של החיידקים להקים דלקת מעיים.
יש צורך בכ 10 דקות למסוק את כל האיברים הנגועים מעכבר אחת. כיס המרה הוא מקרע בקלות, ולכן עדיף להסיר אותו תחילה. בלוטות הלימפה הן mesenteric הקלה לזהות כאשר המעיים לא היו מופרעים, ולכן הם צריכים להסיר הבאים. ניתן לקצור את המעיים כאחד על ידי חיתוך רקמה ממש מתחת לבטן וממש מעל הנספח, ולאחר מכן הופרדו לתריסריון, מעי ריק, ileuמ ', cecum, והמעי גס ממש לפני שטיפה ומאחד. הטחול והכבד יוסרו בדרך כלל הבא, והמוח שנקטפו לאחר אחזור איברים מחלל הצפק, כפי שיש צורך להפוך את העכבר מעל כדי לגשת לגולגולת. כאשר עובד עם עכברים מרובים, כל הרקמות יש לאחסן על קרח עד מעובד. עבור רוב הרקמות, אחד צלחת אגר שימש כדי לקבוע את המספר הכולל של CFU נוכח ברקמות. הצלחת הייתה מחולקת לשלישים, ומדגם μl 50-100 של שלושה דילולים נפרדים של homogenate הרקמות היה מצופה בכל שליש.
השיטות שתוארו כאן תהיה לזהות את המספר הכולל של ל ' חיידקי בכל רקמות עכבר, ולא רק אורגניזמים תאיים. סגנון החיים תאי הייחודי של ל ' הוא חשב חיידקי להיות הקובע ארסיות מפתח במהלך זיהום 18,19. עם זאת, ל ' חיידקי הם פקולטטיבי, פתוגנים לא מחייבים, תאיים, ויסדואר לא דווח מוחלט שפורסם כדי לציין את אחוז יסטריה שלמעשה מתגורר בתוך תאים בגוף חי. רוב המחקרים הקודמים באמצעות ל 'אוראלי זיהום חיידקי הסתמך על טיפול גנטמיצין של רקמות מעיים כדי לעכב את הצמיחה של חיידקים במעיים. יש טיפול מראש עם גנטמיצין הפוטנציאל לחסל L. תאי חיידקי, המאפשר התאוששות של רק את החיידקים תאיים, אם כי אין זה ברור למה גנטמיצין המידה הוא מסוגל לחדור רקמות מעיים שלמות במבחנה. הפרוטוקול המשלים המתוארים כאן מאפשר קביעת שני חיידקים תאיים ו תאיים בשכבת הריר, האפיתל, ותא propria lamina של רקמות מעיים נגועות. בהליך זה, גנטמיצין משמש לטיפול בהשעיות תא בודדות, על מנת להבטיח כי כל החיידקים שנמצאו היו בתוך תאים בתוך הרקמה.
שלושה שוטף עם NAC בדרך כלל מחדשעברתי את רוב הריר מרקמות מעי, והכביסות שאספו לא הכילו תאים אוקריוטים (בת קיימא או מת), כפי שנקבעו על ידי צביעת trypan הכחולה. שוטף נוסף לא הניב ריר גלוי, כפי שנקבע על ידי צביעת גרסאות-מרכול של שקופיות הכנות cytospin. התאי של השברים LP EC וגם ניתן לאשר שימוש בגרסות-מרכול או מכתים Giemsa. שבריר EC צריך להיות מורכב מתאי אפיתל, אשר בראש ובראשונה ניתן להבחין בקלות מכמה הלימפוציטים intraepithelial בהווה באפיתל במעי. שבריר LP הוא מגוון יותר, המכיל תערובת של תאי mononuclear ששינויים בהרכב לאחר הדבקה כאשר מונוציטים דלקתיים לחדור לרקמות.
מודל שמקורן במזון של ליסטריה ניתן להשתמש במגוון רחב של ל ' בודד חיידקי, כולל עכבר מותאם InlA מ-להביע זן 15 שתוארו כאן, EGDe סוג בר, ומחיקת המוטציה דרעיvatives של זנים אלה 16. במחקר קודם, הראינו כי רמת קולוניזציה מעיים לא משתנות באופן משמעותי בין זנים אלה, עם זאת, מבודדים, שלא מבטאים יגנד זיקה גבוהה לעכברי דואר cadherin עשה לי פגם קל בהפצתו לבלוטות הלימפה וmesenteric טחול 16. כמו כן, כל זן עכבר יכול לשמש לזיהום, מה שהופך את זה מערכת אטרקטיבית מודל ללמוד גם הפתוגנזה ותגובות לזיהום חיידקי מארח. לבסוף, למרות שעדיין לא בדקו את זה באופן ישיר, אנו מציעים כי את הנהלים הבסיסיים המשמשים כאן צריכים להיות ישימים באופן נרחב לפתוגנים מזון אחרים נשאו חיידקים, כגון סלמונלה, Yersinia, Escherichia, קמפילובקטר ומיני Citrobacter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. כל הניסויים שתוארו כאן בוצעו בעמידה במשרד למעבדה לרווחת בעלי החיים (OLAW) באישור ICAUC באוניברסיטת קנטאקי.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (AI079442 וAI091918) הוענקו לSEFD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion Agar | Difco | BD-241830 | |
| Lithium chloride | Sigma | L9650 | |
| Glycine | Omnipur | 4840 | |
| EDTA | Gibco | 15575-038 | |
| DTT | Sigma | D5545 | |
| Collagenase, type IV | Worthington | LS004089 | |
| DNAse I | Worthington | LS002007 | |
| Diff-Quik | Dade-Behring | B4132-1A | |
| PowerGen 1000 homogenizer | Fisher | 14-261-06 | |
| stainless steel type 304 mesh #80 | Small Parts, Inc. | CX-0080-C | |
| Cytospin | Statspin | M801-22 |
References
- Becker, L. A., Evans, S. N., Hutkins, R. W., Benson, A. K. Role of sigmaB in adaptation of Listeria monocytogenes to growth at low temperature. Journal of Bacteriology. 182, 7083-7087 (2000).
- Neunlist, M. R., et al. Effect of salting and cold-smoking on the culturability, viability, and virulence of Listeria monocytogenes strain Scott A. Journal of Food Protection. 68, 85-91 (2005).
- Aureli, P., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria monocytogenes. N. Engl. J. Med. 342, 1236-1241 (2000).
- Dalton, C. B., et al. An outbreak of gastroenteritis and fever due to Listeria monocytogenes in milk. N. Engl. J. Med. 336, 100-105 (1997).
- Frye, D. M., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with delicatessen meat contaminated with Listeria monocytogenes. Clin. Infect. Dis. 35, 943-949 (2002).
- Salamina, G., et al. A foodborne outbreak of gastroenteritis involving Listeria monocytogenes. Epidemiol. Infect. 117, 429-436 (1996).
- Mead, P. S., et al. Food-related illness and death in the United States. Emerging Infectious Diseases. 5, 607-625 (1999).
- Wing, E. J., Gregory, S. H. Listeria monocytogenes: Clinical and experimental update. The Journal of Infectious Disease. 185, S18-S24 (2002).
- Condotta, S. A., Richer, M. J., Badovinac, V. P., Harty, J. T. Probing CD8 T cell responses with Listeria monocytogenes infection. Advances in Immunology. 113, 51-80 (2012).
- Disson, O., et al. Modeling human listeriosis in natural and genetically engineered animals. Nat Protoc. 4, 799-810 (2009).
- Czuprynski, C. J., Faith, N. G., Steinberg, H. A/J mice are susceptible and C57BL/6 mice are resistant to Listeria monocytogenes infection by intragastric inoculation. Infect. Immun. 71, 682-689 (2003).
- Gajendran, N., et al. Regional IFNgamma expression is insufficient for efficacious control of food-borne bacterial pathogens at the gut epithelial barrier. Int. Immunol. 19, 1075-1081 (2007).
- Lecuit, M., et al. A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science. 292, 1722-1725 (2001).
- Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infect. Immun. 66, 747-755 (1998).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129, 891-902 (2007).
- Ghanem, B. ou, N, E., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathogens. , Submitted for publication (2012).
- Kowal, M., Buda-Lewandowska, D., Plytycz, B., Styrna, J. Day/night food consumption in mice is strain and age-dependent. Folia Biol. (Krakow). 50, 1-3 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature reviews. Microbiology. 7, 623-628 (2009).
- Camejo, A., et al. The arsenal of virulence factors deployed by Listeria monocytogenes to promote its cell infection cycle. Virulence. 2, 379-394 (2011).
