Summary
Este estudo descreve uma técnica eficiente para isolar e processar tecido gengival da cavidade oral do rato de modo a produzir uma cultura de uma única célula. As células resultantes podem ser ainda utilizado para a análise de citometria de fluxo e os estudos moleculares.
Abstract
Desenvolvemos uma técnica para isolar e processar o tecido gengival murino por citometria de fluxo, os estudos moleculares e com precisão. A gengiva é um tecido único e importante para estudar os mecanismos imunitários, porque está envolvido na resposta imune do hospedeiro contra o biofilme oral, que podem provocar doenças periodontais. Além disso, a proximidade da gengiva para o tecido do osso alveolar também permite estudar a remodelação óssea em condições inflamatórias. Nosso método produz grande quantidade de células do sistema imunológico que permite a análise de até populações raras células, tais como células de Langerhans e células T reguladoras como demonstramos anteriormente 1. Empregando ratinhos para estudar as respostas imunitárias locais envolvidos na perda de osso alveolar durante as doenças periodontais, é vantajoso, devido à disponibilidade de várias ferramentas imunológicas e experimental. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho e ao acesso relativamente inconveniente para a gengiva murino, muitos estudos evitada exame de this tecidos críticos. O método descrito neste trabalho podem facilitar a análise de gengiva, que poderá aumentar a atenuante no sistema imunitário por via oral e o seu papel durante as doenças periodontais.
Introduction
Gengiva é o tecido macio em torno da porção cervical dos dentes e cobre o processo alveolar (Figura 1). A gengiva é um tipo de mucosa mastigatória que podem ser ainda separadas no epitélio da mucosa e do tecido conjuntivo (também conhecido como submucosa ou lâmina). A estrutura anatômica da gengiva e dentes adjacentes permite que as bactérias para residir e desenvolver placa (biofilme) que desafia constantemente o sistema imunológico local. Como resultado, a resposta inflamatória desenvolve na gengiva, o que, em determinadas circunstâncias torna-se destrutiva - uma situação designada por doenças periodontais 2. Basicamente, patologias periodontais placa induzidos podem ser divididos em gengivite e periodontite. Gengivite representa uma condição reversível da resposta inflamatória local que está confinada ao gengiva. A periodontite, por outro lado, é um processo de destruição irreversível em que o aparelho de fixação (osso alveolar, periodontalligamento, cemento e gengiva) é destruído 3.
A gengiva foi proposto para servir tanto locais como efectoras e indutivo durante quatro doenças periodontais. Estudos em humanos têm sugerido que, em resposta a placa dental, células efetoras imunes e as moléculas se infiltrado ou partida da gengiva 5-7 dinamicamente. Esta actividade foi demonstrado desempenhar um papel importante na destruição periodontal 8,9. Considerando que os dados gerados por esses estudos forneceram informações valiosas sobre esse processo patológico, trabalhando com os tecidos humanos possuem grandes limitações éticas, técnicas e experimental. O desenvolvimento de modelos experimentais permitiram experimentações de causa-efeito via empregando camundongos transgênicos e intervenções vivo 10. Como resultado, o nosso conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na doença periodontal aumentaram consideravelmente durante as últimas duas décadas. Ainda assim, devido à complexidade da doença periodontal, não existeum debate em curso sobre a natureza da resposta imune local facilitando a destruição dos tecidos. Há também uma falta de compreensão sobre a função das células imunitárias centrais na gengiva durante as doenças periodontais. É, portanto, essencial para estudar eventos inflamatórios patológicos que ocorrem no tecido alvo da doença da gengiva.
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Protocol
Prepare-se com antecedência:
- PBS + FCS a 2%
- PBS + FCS a 2% com 2 mg / ml de colagenase de tipo II e de 1 mg / ml de ADNase tipo I (1 ml para cada amostra)
- Instrumentos cirúrgicos esterilizados
- Solução de EDTA 0,5 M
1. Superior Técnica Excisão Gengival
- Eutanásia ratos usando orientação IACUC aprovado.
- Corte ambos os lados da cavidade oral, incluindo as bochechas e do ramo da mandíbula com uma acentuada / blunt tesoura reta.
- Puxe para baixo a mandíbula.
- Cortar os tecidos moles e duros por uma linha imaginária que 1 milímetro atrás dos molares terços padrão com uma tesoura. Dirigir a tesoura perpendiculares ao plano do osso palatino (Figura 2A, linha azul).
- Inciso os tecidos duros e moles 2 milímetros por trás dos incisivos (Figura 2A, linha azul).
- Puxe para baixo a parte anterior da boca. A cavidade nasal é observável após esta etapa.
- Coloque a tesouraparalelo ao paladar, colocar uma lâmina para dentro da cavidade nasal, a outra lâmina deve incisão no vestíbulo. Corte até a incisão posterior (Figura 2A, as linhas verdes). Repetir esta etapa em ambos os lados do maxilar. No final da maxila é separada do resto do crânio (Figura 2B).
- Retire a maxila, cortá-lo no meio de sutura (Figura 2, linha tracejada preta) e cortar o tecido palatal de cada hemi-maxila até atingir o osso alveolar.
- Descasque os tecidos gengivais (ambos hemi-maxilas) a partir de sua borda anterior com Adson fórceps (sem dentes).
- Coloque a gengiva excisada numa placa com PBS + 2% de FCS.
2. Gengival Processamento
- Coloque a gengiva excisadas num prato de cultura de tecido (35 x 10 mm) com 1 ml de PBS + FCS a 2%, 2 mg / mL de colagenase tipo II e 1 mg / ml de ADNase tipo I.
- Picar bem o tecido com um N ° 15 lâmina cirúrgica estéril.
- Transfer o tecido da placa para um tubo de ensaio de 15 mL cónico.
- Lave as células de tecido / remanescentes na placa com 1 ml de PBS + FCS a 2% e de transferência para o mesmo tubo de ensaio.
- Incubar numa incubadora num agitador durante 20 min a 37 ° C, 200 rpm (recomendação: pré-aquecimento da incubadora).
- Adicionar 20 ul de EDTA 0,5 M e incubar durante mais 10 min a 37 ° C, 200 rpm.
- Encher o tubo de ensaio até 12 ml com PBS + FCS a 2% e centrifugação a 4 ° C, a 400 xg, durante 8 min (recomendação: pré-frio a centrífuga).
- Remover o sobrenadante e ressuspender as células com 2 ml de PBS + FCS a 2%.
- Filtrar a amostra com 70 mM de células-filtro e salvar fluir.
- Centrifugar a 4 ° C, 320 xg durante 5 min.
- Remover as células sobrenadante e ressuspender com 300 mL PBS + 2% FCS.
- Contar as células (5 x 10 células de aproximadamente 5-10 são esperados a partir de uma única maxila).
3. Anticorpo extracelular e intracelularColoração por citometria de fluxo
Recomenda-se a trabalhar dentro de uma capa, com as luzes apagadas. É crítico para manter as células em ambiente frio constante, bem como todos os materiais necessários.
- Stain células contra moléculas extracelulares adicionando 0,2-0,5 ug de cada anticorpo seleccionado por 1 x 10 6 células, num volume total de 100 ul.
- Vortex brevemente.
- Incubar os tubos durante 15 min no escuro a 4 ° C.
- Lavar as células com 2 ml de PBS + FCS a 2%.
- Centrifugar a 4 ° C, 320 xg durante 5 min.
- Aspirar células sobrenadante e ressuspender adicionando, gota a gota, 500 mL frio BD Cytoperm / Cytofix enquanto vortex.
- Incubar os tubos durante 40 minutos a 4 ° C no escuro.
- Vortex brevemente.
- Lave as células duas vezes com 1 ml de frio BD Perm / Wash tampão e centrifugação a 800 xg durante 7 minutos a 4 ° C.
- Aspirar o sobrenadante exceto para 300 ml.
- Mancha células intracelular poradição de 1 ug de cada anticorpo seleccionado por 1 x 10 6 células, num volume total de 100 ul.
- Vortex brevemente.
- Incubar durante 30 min no escuro a 4 ° C.
- Lave as células duas vezes com 1 ml de frio BD Perm / Wash tampão e centrifugação a 800 xg durante 7 minutos a 4 ° C.
- Aspirar células sobrenadante e ressuspender adicionando 300 ml BD Perm / Wash Buffer frio.
- Vortex brevemente.
- Transferir a suspensão enquanto a filtragem para tubos FACS.
- Manter os tubos em um ambiente escuro e frio até à análise.
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Representative Results
São apresentados exemplos de análise de citometria de fluxo em células gengivais. Células gengivais agrupados a partir de dois ratos foram executados em um citômetro de fluxo LSR II e analisados usando o software FlowJo. Figura 3A demonstrou a distribuição de células gengivais de camundongos ingênuos em uma dispersão lateral (SSC) em relação ao gráfico de dispersão (FSC). Gating estratégia para identificar (i) os linfócitos (ii) os monócitos / células dendríticas e (iii) os granulócitos é indicado. Para efeito de comparação, apresentamos também um enredo FACS ilustrando células gengivais purificadas de P. gingivalis infectados ratinhos 21 dias após a administração por sonda oral, em uma configuração de periodontite experimental como descrito anteriormente (Figura 3B). Um aumento das várias populações de células imunitárias pode ser facilmente detectado em ratinhos infectados, em comparação com os ratos sem tratamento prévio. Em seguida, identifica-se as células imunitárias na gengiva processada pela passagem sobre as células que expressam o marcador hematopoéticas CD45 (Figura 4A). T stas células ainda segregado em células CD3-positivas representativas de células T (figura 4B). Foram também identificados neutrófilos gengivais de acordo com a expressão de moléculas do Ly6G e CD11b (Figura 4C). Finalmente, células de Langerhans, um subconjunto de células epiteliais dendríticas (DC), foram identificados por gating em MHC de classe II, as células CD11c + + (um marcador de DCs murinas) e a expressão de Ep-CAM e langerin/CD207 (coloração intracelular) (Figura 4D).
Figura 1. Diagrama esquemático mostrando os pontos anatômicos da gengiva.
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Figura 2. Representação esquemática de rato cavidade oral, resultando após completar o passo 1.3 Os tecidos moles da parte de trás para a frente:. Músculo masseter (MM), palato mole (SP), palato duro (HP), gengiva (G). Tecido duro: molares e incisivos. O principal objectivo desta técnica é para isolar o tecido gengival que rodeia os três molares (no interior da oval preta).
Figura 3. Representante FACS parcelas demonstrando distribuição celular de leucócitos gengivais. Amostras gengivais processados foram executados no citômetro de fluxo LSR II e analisados usando o software FlowJo. Dispersão lateral (SSC) versus dispersão (FSC) parcelas frente das células gengivais de (a) camundongos ingênuos ou (B) gengiva inflamada são prestura orientada. A localização do (I), linfócitos (ii) os monócitos / células dendríticas e (iii) as populações granulócitos é indicado.
Figura 4. Representante FACS parcelas demonstrando análise de células gengivais imunes. (A) As células imunológicas foram identificadas de acordo com a expressão de CD45. Após propagação em células CD45-positivas e população de linfócitos, expressão de CD3 permitiu segmentação subconjunto de células T. (B) Os neutrófilos foram identificados na gengiva de acordo com a capacidade das células CD45 + para expressar também Ly6G e CD11b. (C) As células dendríticas foram identificado por gating em células CD45 + a partir da população de monócitos / dendrítica [Figura 3, portão (ii)], e, em seguida, de MHC de classe II e as células positivas CD11c.
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Discussion
Tecidos gengivais Maxilla obtidos a partir de um único rato são suficientes para análise de sub-populações de linfócitos T e B, bem como a sua capacidade para expressar moléculas extracelulares e intracelulares, como previamente descrito 1. No entanto, se as populações de células raras são de interesse (por exemplo, DCs), recomenda-se a tecidos de piscina 2-3 ratinhos. De nota, se preferível, é possível descascar ambos os tecidos gengivais e palatal e, depois, para extirpar a gengiva (uma modificação do passo de 1,8-1,9). Também deve ser mencionado que mandibular gengiva podem ser coletadas, bem como, ainda, o seu isolamento é mais complicado e pode incluir outros tecidos que possam interferir com a análise.
Técnicas comuns para estudar células do sistema imunológico na gengiva são imunohistoquímica e imunofluorescência. Estas técnicas permitem a visualização da distribuição de uma molécula alvo / célula através da gengiva, e rastreio de numerosas campos é necessária a fim de estudar uma determinada área. Considerando que a localização fisiológica de certas células não pode ser determinada por citometria de fluxo, devido ao processamento gengival, esta abordagem oferece várias outras vantagens: (1) por citometria de fluxo é um método simples e rápido para analisar os grandes números de células (2) reduz a erros de análise originar da heterogeneidade do tecido (3) que permite a análise de populações de células raras (4) que permite a análise simultânea de diversas variáveis (5) que permite a discriminação entre as células vivas e mortas (6) que permite a análise funcional das células resultantes.
A capacidade de realizar a análise de citometria de fluxo no tecido gengival durante a doença periodontal experimental aumenta a nossa capacidade de revelar os mecanismos imunológicos envolvidos neste processo. Estudo longitudinal de alterações celulares que ocorrem na gengiva após a exposição a patógenos orais devem fornecer informações mais relevantes ao invés de medir as respostas imunes systemically. Este aspecto é de particular importância quando se analisa o fenótipo e cinética das células inflamatórias inata e adaptativa na gengiva inflamada.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por doações da Fundação para a Ciência Israel (n º 1418/11) para AHH e (n º 1933/12) para AW, a Fundação israelense alemão para jovens investigadores (GIF jovem) para AHH, eo Dr. I . Fundo Cabakoff Research Endowment da Universidade Hadassah-Faculdade de Medicina Dentária de AHH e AW hebraico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp. | CLS-2 | |
| DNAse I | SIGMA | DN25-1G | |
| EDTA | SIGMA | E6758-100G | |
| Dulbecco's PBS | SIGMA | D8537 | |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-121-1 | Heat Inactivated |
| Vacuum-Driven Filter | Jet Biofil | FPE-204-500 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352052 | |
| Cell Strainer 70 μm | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Tissue Culture Dish 35×10 mm | NUNC | 153066 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD45.2 antibody | Biolegend | 109819 | Clone 104 |
| Anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 100413 | Clone GK1.5 |
| Anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100733 | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD3 antibody | Biolegend | 100214 | Clone 17A2 |
| Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody | Biolegend | 118219 | Clone G8.8 |
| Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody | Imgenex | DDX0362D | Clone 929F3.01 |
| Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody | Biolegend | 115010 | Clone 39-10-8 |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo Software v 7.6.5 | Tree Star |
References
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