Summary
Este protocolo descreve um elevado através do método colorimétrico de colocar que se baseia na formação de um complexo entre o iodo e cadeias de moléculas de glucose em amido. Iodo forma complexos com tanto amilose e amilopectina em longas cadeias. Após a adição de iodo a uma amostra de amido, o máximo de absorção de amilose e amilopectina ocorre a 620 e 550 nm, respectivamente. A proporção de amilose / amilopectina pode ser estimada a partir da razão dos valores de absorvância de 620 e 550 nm e comparando-os com uma curva padrão em que as concentrações específicas conhecidas são traçados em função de valores de absorção. Esta alta taxa de transferência, método barato é confiável e reprodutível, permitindo a avaliação de grandes populações de clones de batata.
Abstract
Este protocolo descreve um elevado através do método colorimétrico de colocar que se baseia na formação de um complexo entre o iodo e cadeias de moléculas de glucose em amido. Iodo forma complexos com tanto amilose e amilopectina em longas cadeias. Após a adição de iodo a uma amostra de amido, o máximo de absorção de amilose e amilopectina ocorre a 620 e 550 nm, respectivamente. A proporção de amilose / amilopectina pode ser estimada a partir da razão dos valores de absorvância de 620 e 550 nm e comparando-os com uma curva padrão em que as concentrações específicas conhecidas são traçados em função de valores de absorção. Esta alta taxa de transferência, método barato é confiável e reprodutível, permitindo a avaliação de grandes populações de clones de batata.
Introduction
Cerca de 80% do peso fresco de um tubérculo da batata é água; quase toda a matéria seca remanescente é de amido 1. A maior parte do amido (70%) é composto de amilopectina, enquanto que o restante é amilose. A relação entre a amilose e amilopectina é a propriedade mais importante que influencia as propriedades físicas do amido. Amilose é um alfa 1-4 cadeia glicose linear, enquanto a amilopectina é uma cadeia alfa 1-4 linear com alfa 1-6 ramos 2. Métodos tais como iodo de ligação, calorimetria diferencial de varrimento (DSC), cromatografia de exclusão de tamanho de elevado desempenho (HPSEC) e concanavalina A interacções têm sido desenvolvidos para a determinação de amido em diferentes espécies de plantas 3,4. Cada protocolo requer habilidades e equipamentos especiais, o que torna difícil para escalar até quantificar numerosas amostras de cada vez. O método que apresentamos aqui é um protocolo modificado de Hovenkamp-Hermelink et al. 5, que é uma associação de iodo comprimento de onda duplométodo baseado em grânulos de amido coradas. As vantagens deste método em relação a outras incluir a determinação do teor de amilose de amido em bruto sem purificação e a utilização do sistema de duplo comprimento de onda para aumentar a precisão do método 4,6.
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Protocol
1. Determinação de amilose de batata Tuber Amido
- Descasque e corte os tubérculos frescos em cubos pequenos.
- Coloque cubos de batata em pequenos sacos castanhos e armazenar durante a noite a -80 ° C.
- Transfira os cubos de batata para sacos de nylon e por liofilização.
- Depois de liofilizado, moer a amostra de batata em pó utilizando almofariz e pilão ou um Wiley Mill.
- Num tubo de 50 ml, adicionar 20-30 mg da, amostra tubérculo solo seco por congelação.
- Prepara-se uma solução de 45% (w / v) de ácido perclórico (misturar 24,4 ml de ácido perclórico a 60% e 25,6 ml de água ultra-pura.
- Adicionar 500 mL de 45% (w / v) de ácido perclórico e agitar ou agite-a para dispersar os grânulos de amido.
- Após um período de incubação de quatro minutos à temperatura ambiente, adicionar 16 ml de água ultra-pura a solução e misturar por vortex.
- Depois que o material não solúvel tem assentado no fundo do tubo (7-10 minutos mais tarde), a transferência de 40 mL da solução a uma placa de microtitulação (evitando a pipetagem de quaisquer partículas).
- Adicionar 50 ul de solução de iodo (2 g de KI e 1 g de I 2 por 900 ml de água ultra-pura) e misturar a amostra por pipetagem.
- Ler a absorvância a 550 nm e 620 nm imediatamente.
- Determinar a percentagem de amilose depois de comparar a proporção de amilose / amilopectina de cada amostra (620 nm/550 nm de absorvância) com uma curva padrão gerada a partir de amilose e amilopectina soluções a uma gama de concentrações. Este procedimento será descrito a seguir. Leia a (solução de iodo e ácido perclórico) em branco juntamente com as amostras de teste. Use apagado dados para as análises.
2. Amilose / amilopectina Curve
- Em tubos separados pesa 12,5 mg de teor de amilose e de amilopectina de 12,5 mg.
- Adicionar a cada tubo 5 mL de 45% (w / v) de ácido perclórico e dissolver completamente.
- Para cada uma das soluções (amilose e amilopectina) e levar a um volume final de 50 ml com água ultra-pura.
- Misture 6,25ml de estoque de amilose da etapa anterior com 18,75 ml de água ultra-pura. Isso fará com que uma solução de amilose 6,25 mg / ml.
- Repetir o procedimento para a solução de amilopectina.
- Usando o teor de amilose e amilopectina soluções padrão a partir de passos 2.4 e 2.5, preparar os padrões de amilose por cento que são 0-100% de amilose (100-0% de amilopectina) com um volume final de 5 mL para criar a curva padrão em intervalos de 10%.
Por exemplo, para se preparar:
A amilose / amilopectina padrão de 100% a 0%, pipeta de 5 ml de solução de amilopectina.
A amilose / amilopectina de 90% norma 10%, 0,5 ml de combinar amilose e 4,5 ml de soluções de amilopectina.
A amilose / amilopectina padrão de 80% a 20%, misture 1,0 ml de amilose e amilopectina 4,0 ml de soluções.
A amilose / amilopectina de 70% norma 30%, 1,5 ml de combinar amilose e 3,5 ml de soluções de amilopectina.
A amilose / amilopectina de 60% norma 40%, 2,0 ml combinar amilose e 2,0 ml de soluções de amilopectina.
O teor de amilose de 50%/ 50% de amilopectina padrão, combinar 2,5 ml de amilose e amilopectina com 2,5 ml de soluções.
A amilose / amilopectina de 40% norma 60%, 3,0 ml combinar amilose e amilopectina de 2,0 ml, e assim por diante). - Transferir 40 uL de cada mistura de padrão para uma placa de microtitulação. Incluir um poço com 40 uL de 45% (w / v) de ácido perclórico como o branco.
- Adicionar 50 ul de solução de iodo (2 g de KI e 1 g de I 2 por 900 ml de água ultra-pura) e misturar cada amostra (incluindo a branco) por pipetagem.
- Ler as absorvâncias a 550 nm e 620 nm imediatamente e calcular a proporção de amilose / amilopectina, para cada concentração.
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Representative Results
A curva padrão construída a partir de dados inibidas de soluções de concentração de amilose / amilopectina diferentes mostra proporções aproximadas de absorvância entre 0,7 e 1,6 (Tabela 1). Uma linha de tendência de regressão linear a partir destes dados é utilizada mais tarde para inferir o teor de amilose no liofilizadas amostras de batata (Figura 1).
O ambiente de produção da planta tem algum efeito sobre o teor de amilose do tubérculo 7. Replicados determinações conteúdo de amilose, em dois locais de campo separados apresentaram baixa variação entre os tubérculos de batata (Tabela 2). Pigmentos em batatas cor de carne não parecem afetar o ensaio de determinação de amilose.
| % Solução de amilose 1 | 550 nm de absorvância | 620 nm de absorvância | Razão 2 620 nm nm/550 |
| 0 | 0,223 | 0,156 | 0.700 |
| 10 | 0,225 | 0.181 | 0,804 |
| 20 | 0,221 | 0,203 | 0,919 |
| 30 | 0.220 | 0,219 | 0.995 |
| 40 | 0,223 | 0,246 | 1.103 |
| 60 | 0.216 | 0.280 | 1.296 |
| 70 | 0,231 | 0,319 | 1.381 |
| 90 | 0,225 | 0,347 | 1.542 |
| 100 | 0,219 | 0,357 | 1.630 |
Tabela 1. Relação entre a concentração de amilose e razão de absorvância (620 nm/550 nm). Relação de absorvância vs cento de amilose está representada na Figura 1 </ Strong> para a determinação de teor de amilose 1. Solução de amilose Percentagem foi feita a partir de amilose e amilopectina soluções estoque em diferentes concentrações 2. Rácio calculado a partir de dados inibidas as absorvâncias a 620 nm e 550 nm.
| Cultivar | Loc | 550 nm | 620 nm | Relação | Amilose% |
| Adirondack Azul | 1 | 1.86 | 1.78 | 0,955 | 25,5 |
| 2 | 2.28 | 2.15 | 0,946 | 24,4 | |
| Cedo Rose | 1 | 2.17 | 2.12 | 0,977 | 27,8 |
| 2 | 2.22 | 2.14 | 0,967 | 26,7 | |
| FreEdom Russet | 1 | 1.99 | 1.92 | 0,965 | 26,5 |
| 2 | 1.98 | 1.93 | 0,973 | 27,4 | |
| Inca Ouro | 1 | 1.95 | 2,00 | 1.021 | 32,6 |
| 2 | 2.27 | 2.28 | 1.004 | 30,7 | |
| Rangers Russet | 1 | 1.88 | 1.84 | 0.975 | 27,6 |
| 2 | 2.15 | 2.08 | 0,967 | 26,7 | |
| Russet Norkotah | 1 | 1.84 | 1.79 | 0,972 | 27,3 |
| 2 | 1.90 | 1.86 | 0.975 | 27,6 | |
| Snowden | 1 | 2.23 | 2.13 | 0,956 | 25,5 |
| 2 | 1.64 | 1.61 | 0,979 | 28,0 | |
| Pearl White | 1 | 2.32 | 2.28 | 0,986 | 28,7 |
| 2 | 2.22 | 2.18 | 0,983 | 28,5 |
Tabela 2. Avaliação replicado de teor de amilose em cultivares de batata de dois locais de produção de campo diferentes (LOC).
Figura 1. Amilose curva padrão de concentração usado para inferir o teor de amilose por cento em tubérculos de batata.
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Discussion
Teor de amilose em tubérculos de batata geralmente varia de 20-35% 7,8. Se a maioria dos valores estão do lado de fora deste intervalo, considerar estes erros possíveis: 1) Os dados brutos foram usados em vez de dados inibidas para a construção da curva padrão de amilose / amilopectina, 2) Os dados brutos foram usados em vez de dados inibidas para a determinação do teor de amilose / proporções de amilopectina das amostras de batata, ou 3) a água utilizada para a análise não foi suficientemente puro. Percebemos que, usando água destilada e água não ultra-pura na análise, os valores obtidos não foram reprodutíveis. Uma maneira fácil de verificar que a solução de iodo é preparado corretamente ou se ainda é muito velho para ser usado é verificar se o valor de absorbância bruto da amostra em branco a 550 nm é de cerca de 0,1.
Precisão na preparação do iodo e as soluções de amilopectina / amilose é crucial para a obtenção de determinações de amilose fiáveis. Uma vez que estamos a determinação da proporção de amyperder o conteúdo em vez do que a quantidade exacta de amilose no amido de batata, não há nenhum passo de purificação para o isolamento de amido puro a partir do pó de batata tal como apresentado por outros métodos de determinação.
Para a determinação do teor de amilose em cultivares de batata, duas congelar tubérculos secos independentes de cada cultivar foram processados em cada localidade. Descobrimos que a variação de teor de amilose entre os tubérculos de batata era pequeno (menos de um ponto percentual) e não significativo.
Não houve diferença na determinação do teor de amilose, devido à quantidade inicial de amido de batata, entre 20-30 mg. Fora deste intervalo, os resultados se tornaram confiáveis ou indetectável pelo nosso leitor de placas. Apesar de Hovenkamp-Hermelink et al. 5 sugerem a adição de um volume de água, se a amostra está muito concentrada, recomendamos nova pesagem da amostra e repetir o procedimento.
Este estudo presents dados com base em branco batatas polpa. Além disso, nós avaliamos este método com batatas carne coloridas (amarelo, vermelho e roxo). Não há interferência com o complexo de iodo / amilose foi detectado. No entanto, como com qualquer ensaio de ligação ao iodo, a proporção de amilose é susceptível de ser sobrestimada um pouco devido à ligação de iodo a cadeias lineares em que as moléculas de amilopectina. Este ensaio destina-se para o rastreio de grandes números de amostras. Uma vez que os indivíduos de alto teor de amilose são identificados, recomendamos re-testes com um ensaio específico da amilose, tais como concanavalina A 9,10. Este ensaio é mais caro e que o ensaio de ligação ao iodo de trabalho intensivo, mas determina mais precisamente os níveis de amilose.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
O financiamento para esta pesquisa foi fornecido em parte pelo Programa de Pesquisa Associado USDA-ARS e do Comitê de culturas de Germoplasma do USDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Amylose | Sigma | 859656 | |
| Amylopectin | Sigma | A8515 | |
| Perchloric Acid 60% | Sigma | 311413 | Very hazardous to skin and eyes |
| Iodine | Sigma | 23214TD | |
| Potassium iodide | Sigma | 08625JE | |
| Equipment | |||
| Plate Reader | Bio Tek | ELx800 | |
References
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