Summary
Bu protokol, iyot ve nişastadan glukoz moleküllerinin zincirleri arasında bir kompleks oluşumuna dayanır koymak kolorimetrik yöntem sayesinde yüksek tarif etmektedir. İyot amiloz ve amilopektin içinde uzun zincirleri hem de kompleksler oluşturur. Bir nişasta örnek iyot ilave edildikten sonra, amiloz ve amilopektin maksimum emme, sırasıyla, 620 ve 550 nm'de meydana gelmektedir. Amiloz / amilopektin oranının 620 ve 550 nm absorbans değerlerinin oranından tahmin edilir ve belirli bir bilinen konsantrasyonları emme değerlerine karşı grafiğe dökülmektedir edildiği bir standart eğri ile mukayese edilebilir. Bu yüksek verimlilik, ucuz bir yöntem patates klonları geniş popülasyonların değerlendirilmesini sağlayan, güvenilir ve tekrarlanabilir.
Abstract
Bu protokol, iyot ve nişastadan glukoz moleküllerinin zincirleri arasında bir kompleks oluşumuna dayanır koymak kolorimetrik yöntem sayesinde yüksek tarif etmektedir. İyot amiloz ve amilopektin içinde uzun zincirleri hem de kompleksler oluşturur. Bir nişasta örnek iyot ilave edildikten sonra, amiloz ve amilopektin maksimum emme, sırasıyla, 620 ve 550 nm'de meydana gelmektedir. Amiloz / amilopektin oranının 620 ve 550 nm absorbans değerlerinin oranından tahmin edilir ve belirli bir bilinen konsantrasyonları emme değerlerine karşı grafiğe dökülmektedir edildiği bir standart eğri ile mukayese edilebilir. Bu yüksek verimlilik, ucuz bir yöntem patates klonları geniş popülasyonların değerlendirilmesini sağlayan, güvenilir ve tekrarlanabilir.
Introduction
Bir patates yumru taze ağırlığının, yaklaşık% 80 su, hemen hemen tüm kalan kuru maddenin nişasta 1'dir. Kalan amiloz ise nişasta (% 70) çoğu, amilopektin oluşmaktadır. Amiloz ve amilopektin arasındaki oran nişastanın fiziksel özelliklerini etkileyen en önemli özelliktir. Amilopektin alfa 1-6 dalları 2 olan bir doğrusal zincirli alfa 1-4 iken, amiloz, lineer alfa 1-4 glukoz zinciridir. Örneğin iyot gibi bağlama yöntemleri, diferansiyel tarama kalorimetrisi (DSC), yüksek performanslı boyut dışlama kromatografisi (HPSEC) ve konkanavalin A etkileşimleri farklı bitki türlerinde 3,4 in nişasta tayini için geliştirilmiştir. Her protokol zor bir anda çok sayıda örnekleri ölçmek büyütmek için yapım, özel beceri ve ekipman gerektirir. Burada mevcut yöntem, bağlayıcı bir dual dalga boyu iyottur Hovenkamp-Hermelink et al., 5'den değiştirilmiş bir protokoldürlekeli nişasta granüllerinin dayanan yöntem. Diğerleri karşı Bu yöntemin avantajı, temizleme olmadan ham nişastadan amiloz kararlılık ve yöntem 4,6 hassasiyetini artırmak için ikili dalga boyu sisteminin kullanımını içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Patates yumru Starch'tan Amiloz belirlenmesi
- Peel ve küçük küpler halinde taze yumrular kesti.
- Küçük kahverengi torbalarda patates küpleri koyun ve -80 ° C'de gece boyunca depolamak
- Naylon torba ve dondurarak kurutma için patates küpleri aktarın.
- Dondurularak kurutulduktan sonra, harç ve havan tokmağı ve bir Wiley değirmen kullanılarak toz haline öğütmek patates örnek.
- 50 ml'lik bir tüp içinde, dondurularak kurutulmuş, öğütülmüş yumru örneğin 20-30 mg ekleyin.
- % 45 oranında bir solüsyonu hazırlayın (ağ / h) perklorik asit (% 60 perklorik asit 24.4 ml ve ultra-saf su 25,6 ml karıştırın.
- % 45 500 ul (ağ / hac) perklorik asit ilave edin ve çalkalayın veya nişasta granüllerinin dağıtmak için girdap.
- Oda sıcaklığında dört dakikalık bir inkübasyon süresinden sonra, çözeltiye ultra-saf su ekleyin ve 16 ml vorteks ile karıştırın.
- Çözünür olmayan madde, tüp dibine yerleşmiş sonra (7-10 dakika sonra), (a mikrotiter plakaya çözeltisi 40 ul transferHerhangi bir parçacık pipetleme kaçınarak).
- Iyot çözeltisi (2 g + 1 g KI I ultra-saf su 900 ml 2) 50 ul ekle ve pipetleme örnek karıştırın.
- 550 nm'de absorbans okuma ve hemen 620 nm.
- Bir konsantrasyon aralığında amiloz ve amilopektin çözeltilerinden oluşturulan standart bir eğri ile her bir numunenin amiloz / amilopektin oranının (620 nm/550 nm absorbans) karşılaştırarak sonra amiloz yüzdesini belirlemek. Bu işlem aşağıda tarif edilecektir. Test örnekleri ile birlikte boş (iyot çözeltisi ve perklorik asit) okuyun. Kullanım analizler için veri blanked.
2. Amiloz / amilopektin Eğrisi
- Ayrı tüpler içinde amiloz 12.5 mg ve 12.5 mg amilopektin tartın.
- % 45 her bir tüp, 5 ml ekle (ağ / hac) perklorik asit ve tamamen çözülür.
- Çözeltilerin (amiloz ve amilopektin) her biri için, ultra-saf su ile 50 ml lik bir son hacme getirmek.
- 6.25 Mix18.75 ml ultra saf su ile önceki adımdaki amiloz stoklar ml. Bu bir 6.25 mg / ml amiloz çözüm sağlayacaktır.
- Amilopektin çözüm için prosedürü tekrarlayın.
- Adım 2.4 ve 2.5 arasındaki amiloz ve amilopektin standart çözüm kullanılarak,% 10 aralıklarla, standart eğri oluşturmak için 5 ml'lik bir nihai hacme kadar% 0-100 amiloz (100-0% amilopektin) olan yüzde amiloz standartlar hazırlandı.
Örneğin hazırlanması için:
0% amiloz /% 100 amilopektin standart pipet 5 ml amilopektin çözüm.
% 10 amiloz /% 90 amilopektin standart, 0.5 ml amiloz ve amilopektin 4.5 ml çözüm birleştirir.
% 20 amiloz /% 80 amilopektin standart, 1.0 ml amiloz ve amilopektin 4,0 ml çözümler birleştirir.
% 30 amiloz /% 70 amilopektin standart, 1.5 ml amiloz ve amilopektin 3.5 ml çözüm birleştirir.
% 40 amiloz /% 60 amilopektin standart, 2.0 ml amiloz ve amilopektin 2.0 ml çözüm birleştirir.
% 50 amiloz/% 50 amilopektin standart, 2.5 ml amiloz ve amilopektin 2.5 ml çözüm birleştirir.
% 60 amiloz /% 40 amilopektin standart, 3.0 ml amiloz ve amilopektin 2.0 ml birleştirmek, ve benzeri). - Bir mikrotitre plakasının her bir standart karışımın 40 ul aktarın. Boş olarak iyi olarak 40 ul% 45 (ağ / hac) perklorik asit içerir.
- Iyot çözeltisi (2 g + 1 g KI I ultra-saf su 900 ml 2) 50 ul ekle ve pipetleme (boş dahil) her bir örnek karıştırın.
- 550 nm'de absorbans okuma ve hemen 620 nm ve her bir konsantrasyon için amiloz / amilopektin oranının hesaplanması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farklı amiloz / amilopektin konsantrasyon çözümler boşaltılır veriler kullanılarak oluşturulmuştur Standart eğri, 0.7 ila 1.6 (Tablo 1) arasında değişen yaklaşık absorbans oranlarını göstermektedir. Bu verilerden bir lineer regresyon eğilim çizgi daha sonra dondurularak kurutuldu, patates örneklerinde amiloz içeriği (Şekil 1) çıkarım için kullanılır.
Bitki Üretim ortamında patates yumru 7 amiloz içeriği üzerinde bir etkisi vardır. Iki ayrı alan yerlerde çoğaltılmış amiloz içeriği tespitler patates yumruları arasında düşük bir varyasyon (Tablo 2) gösterdi. Renkli eti patatesin pigmentler amiloz belirleme deneyi etkileyecek gibi görünmüyor.
| % 1 çözelti Amiloz | 550 nm absorbans | 620 nm absorbans | Oranı 2 620 nm/550 nm |
| 0 | 0,223 | 0.156 | 0.700 |
| 10 | 0.225 | 0.181 | 0.804 |
| 20 | 0.221 | 0.203 | 0.919 |
| 30 | 0.220 | 0.219 | 0.995 |
| 40 | 0,223 | 0.246 | 1.103 |
| 60 | 0.216 | 0.280 | 1.296 |
| 70 | 0.231 | 0.319 | 1.381 |
| 90 | 0.225 | 0.347 | 1.542 |
| 100 | 0.219 | 0.357 | 1.630 |
Yüzde amiloz vs amiloz konsantrasyon ve absorbans oranı (620 nm/550 nm) arasında Tablo 1.. İlişki. Absorbans oranı Şekil 1 <çizilirAmiloz belirlenmesi 1> / strong. Yüzde amiloz çözelti, farklı konsantrasyonlarda 2 de amiloz ve amilopektin stok çözeltiler hazırlandı. Battaniye verilerinden hesaplanan oran 620 nm ve 550 nm'de Absorbanslar.
| Çeşidinde | Loc | 550 nm | 620 nm | Oran | Amiloz% |
| Adirondack Mavi | 1 | 1.86 | 1.78 | 0.955 | 25.5 |
| 2 | 2.28 | 2.15 | 0.946 | 24.4 | |
| Erken Gül | 1 | 2.17 | 2.12 | 0,977 | 27.8 |
| 2 | 2.22 | 2.14 | 0.967 | 26.7 | |
| Freedom Russet | 1 | 1.99 | 1.92 | 0.965 | 26.5 |
| 2 | 1.98 | 1.93 | 0.973 | 27.4 | |
| Inca Gold | 1 | 1.95 | 2.00 | 1.021 | 32.6 |
| 2 | 2.27 | 2.28 | 1.004 | 30.7 | |
| Ranger Russet | 1 | 1.88 | 1.84 | 0.975 | 27.6 |
| 2 | 2.15 | 2.08 | 0.967 | 26.7 | |
| Kızıl Norkotah | 1 | 1.84 | 1.79 | 0.972 | 27.3 |
| 2 | 1.90 | 1.86 | 0.975 | 27.6 | |
| Snowden | 1 | 2.23 | 2.13 | 0,956 | 25.5 |
| 2 | 1.64 | 1.61 | 0.979 | 28.0 | |
| White Pearl | 1 | 2.32 | 2.28 | 0.986 | 28.7 |
| 2 | 2.22 | 2.18 | 0,983 | 28.5 |
Tablo 2. İki farklı alan üretim yerleri (Loc) Patates çeşitlerinde amiloz içeriği çoğaltılır değerlendirilmesi.
Şekil 1.. Amilozlu konsantrasyonu standart eğri patates yumruları içinde amiloz yüzde içeriğini anlaması için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Patates yumruları içinde amiloz içeriği tipik olarak% 20-35 7,8 arasında değişir. En Değerler bu aralığın dışında olursa, bu olası hataları göz önünde bulundurun: 1) ham veri amiloz / amilopektin, standart eğrisinin oluşturulması için kesilmesinin yerine veri kullanılmıştır, 2) ham veri amiloz belirlenmesi için yerine boşaltılır verileri kullanılmıştır / amilopektin patates örneklerinden oranları veya 3) Analiz için kullanılan su yeterince saf değildi. Bu analizde distile su olup, ultra-saf su kullanılarak, elde edilen değerler tekrarlanabilir olmadığını fark. Hala kullanılabilecek kadar eski ise iyot çözeltisi doğru hazırlanmış veya doğrulamak için kolay bir yolu 550 nm de boş numunenin ham absorbans değeri yaklaşık 0,1 olup olmadığını kontrol etmektir.
Iyot ve amilopektin / amiloz çözeltilerin hazırlanmasında Precision güvenilir amiloz saptamaları almak için çok önemlidir. Biz amy oranını belirlerken bu yanayerine patates nişastası içinde amilozun tam miktarı daha içeriği kaybeder, diğer belirleme yöntemleri tarafından sunulan patates tozundan saf nişasta izolasyonu için bir saflaştırma adımı yoktur.
Patates çeşitte amiloz içeriğinin tayini için, her iki çeşidinden bağımsız olarak, dondurularak kurutuldu, kök her mevkiinde işlenmiştir. Biz patates yumruları arasında amiloz içeriği için varyasyon (az bir puan), küçük ve anlamlı değildi bulundu.
Amiloz içeriği belirlenmesinde bir farklılık, 20-30 mg arasında patates nişastası başlangıç miktarının, hiç yoktu. Bu aralığın dışında Elde edilen sonuçlar plaka okuyucusu ile güvenilmez veya tespit edilemeyecek hale gelmiştir. Hovenkamp-Hermelink vd. 5. örnek, çok konsantre ise su hacmi ekleyerek önermek bile, biz örnek tartılarak ve prosedür tekrar öneririz.
Bu çalışma presebeyaz etli patates dayalı NTS veri. Buna ek olarak, biz renkli eti patates (sarı, kırmızı ve mor) ile bu yöntemi değerlendirdi. Iyot / amiloz kompleksi ile hiçbir girişim tespit edildi. Ancak, herhangi bir iyot bağlanma tahlilinde olduğu gibi, amiloz oranı nedeniyle amilopektin molekülleri düz zincirleri iyot bağlayıcı biraz abartılmıştır olması muhtemeldir. Bu deney, numune çok sayıda taranması için tasarlanmıştır. Bir kez yüksek amiloz kişiler tespit edilir, böyle bir 9,10 concanavalin gibi bir amiloz özgü deneyi ile yeniden test öneririz. Bu deney, daha pahalı ve emek-yoğun bir iyot bağlanma tahlili göre, ancak daha kesin bir amiloz seviyelerini ana hatlarıyla belirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu araştırma için fon USDA-ARS Araştırma İşbirliği Programı ve USDA Bitki Germplazm Komitesi tarafından kısmen sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Amylose | Sigma | 859656 | |
| Amylopectin | Sigma | A8515 | |
| Perchloric Acid 60% | Sigma | 311413 | Very hazardous to skin and eyes |
| Iodine | Sigma | 23214TD | |
| Potassium iodide | Sigma | 08625JE | |
| Equipment | |||
| Plate Reader | Bio Tek | ELx800 | |
References
- Composition Hoover, R. molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review. Carbohydr. 45 (3), 253-267 (2001).
- Bertoft, E., Blennow, A.
- Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds. Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).
- Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique. Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).
- Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato. Potato Res. 31, 241-246 (1988).
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. Starch. , 3rd ed, Elsevier Inc. 23-82 (2009).
- Haase, N. U., Plate, J. Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors. Stärke. 48 (5), 167-171 (1996).
- Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules. Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).
- Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A. J. Cereal Sci. 25 (2), 111-119 (1997).
- Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -H. Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A. Starch. 42, 302-305 (1990).
