Summary
中性粒细胞是白细胞在血液中含量最丰富的。中性粒细胞具有转录调控功能，如生产的炎性细胞因子和抑制细胞凋亡。这些函数可以用这里介绍的方法，它允许核因素，通过流式细胞术检测和定量在孤立的核研究
Abstract
中性粒细胞是最丰富的外周血白细胞。这些细胞是第一次出现在炎症和感染的网站，从而成为第一线的防御入侵的微生物。中性粒细胞具有重要的抗菌功能的吞噬作用，细胞溶解酶的释放，生产的活性氧等。除了这些重要的防御功能，中性粒细胞生产的炎性细胞因子和细胞凋亡的抑制感染，如执行其他任务。细胞因子招募其他的白细胞，帮助清除感染和抑制细胞凋亡，使中性粒细胞在受感染的网站活的时间更长。这些功能是在转录水平的调节。但是，由于中性粒细胞是短命的细胞，在这些细胞中的转录调控的响应研究不能进行与传统的报告基因的方法，因为没有效率cient中性粒细胞转染技术。在这里，我们提出了一个简单而有效的方法，它允许在孤立和immunolabeled的核的流式细胞仪检测和定量的核因子。我们描述的技术来隔离纯粹从人外周血中性粒细胞，刺激这些细胞与抗受体抗体，隔离和immunolabel核，并用流式细胞仪分析核。该方法已成功地用于检测NF-κB和核因子Elk-1的中性粒细胞和其他类型细胞的细胞核中。因此，这种方法代表一个选项用于分析从多种类型的细胞在孤立的核转录因子的激活。
Introduction
中性粒细胞是最丰富的外周血中的白细胞1。在炎症和感染过程中嗜中性粒细胞是出现在受影响的部位，在那里他们作为防御2的第一行的第一个细胞。中性粒细胞具有几种抗菌机制的吞噬能力，生产的活性氧的溶解酶脱颗粒，释放和生产，促炎细胞因子4,5。中性粒细胞是短命的细胞得到迅速激活，通过从不同的细胞表面受体的信号。虽然中性粒细胞被认为是终末细胞，由于其短暂的一生，因为它们发生细胞凋亡，除非激活在炎症过程，它现在很清楚，他们也可以修改他们的表型改变特定基因的转录水平。生产的细胞因子5和抑制凋亡7,8两个important活化依赖的细胞功能调节在嗜中性粒细胞中的转录水平。核因子κB（NF-κB）参与细胞因子的生产4，在调节细胞的存活和凋亡9-11在各种细胞类型中的转录控制。
导致核因子激活的信号通路研究报告基因检测或电泳迁移率分析（EMSA）。但是，由于中性粒细胞是短命的细胞，在这些细胞中的转录调控的响应研究不能进行与报告基因检测中，因为不存在有效的中性粒细胞转染技术。 EMSA分析已被用于在嗜中性粒细胞，探讨核因子活化12,13，然而，这种方法是复杂和昂贵的，因为它涉及使用放射性物质。核转染是另一种技术，已被用于成功。LLY转染单核细胞14。因此，至少在理论上，核因子的活化可以在中性粒细胞通过转染检测（尽管效率低）。然而，该技术将更加昂贵，耗时的和可能不太定量。在细胞核中，也可用于免疫染色的细胞的显微分析检测核因素。事实上，我们已检测NF-κB的易位到细胞核中这种方式15。不幸的是，这种技术也是耗时，量变少，和受观察员的偏置。
在这里，我们提出了一个简单而有效的方法，它允许在孤立和immunolabeled的核的流式细胞仪检测和定量的核因子。我们描述技术从人外周血中分离出中性粒细胞，刺激这些细胞通过整合或Fc受体的抗受体抗体，隔离和immunolabel核，并通过流式细胞仪分析核（FIGURE 1）。该方法已成功地用于检测NF-κB和Elk-1的16个核因子中性粒细胞的细胞核。了该方法的灵敏度允许在细胞核中的核因子水平的小的变化的检测。此方法也可用于从其他类型的细胞的核转录因子分析的水平。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。从人血中分离中性粒细胞（PMN）
- 约20毫升人体血液中作为抗凝血剂肝素（10 U / ml）的使用。从健康成年志愿者venopuncture采集血液。所有的实验都做生物伦理委员会在研究所德Investigaciones的Biomédicas - 墨西哥国立自治大学的批准下。
- 将2毫升在PBS中的6％葡聚糖T500到15毫升锥形离心管中，并加入10毫升的血液。颠倒试管混合两次或三次，并让它坐45分钟，以允许血沉。
- 在一个新的15毫升锥形离心管中，将5毫升的Ficoll-Paque联合应用。
- 以富含白细胞的血浆上方形成沉淀的红细胞，并仔细吸取试剂的Ficoll-Paque联合形成的第二层的顶部上。确保有两个阶段。
- 在4℃下离心20分钟，在516×g离心离心分离后，在血浆和Ficoll-Paque的相间有单核细胞的层。氖在试管底部utrophils是。
- 消除上清液，通过轻敲管针对机架打破细胞沉淀，重悬细胞，加入10毫升冷的（4℃）的PBS。 注：重悬细胞通过上下吹打不推荐使用，因为这是太破坏细胞。
- 细胞悬浮液转移到50毫升锥形离心管中，离心，在290×g离心5分钟，在4℃下
- 如前额的细胞沉淀，并加入10毫升冷的（4℃）低渗溶液（0.2％的NaCl，1％BSA的20mM的Hepes，pH值= 7.4），以溶解红细胞。混合管用手轻轻摇晃了整整一分钟。
- 加入10毫升冷的（4℃）高渗溶液（1.6％的NaCl，1％BSA的20mM HEPES，pH值= 7.4），混合，并计数细胞用血细胞计数器（通常> 95％是中性粒细胞）。
注意：保持冰的细胞计数管的细胞悬液。 - 像以前那样离心，重悬在10 PMN7细胞/毫升在低温（4℃）PBS。请在冰上。
注：嗜中性粒细胞仍然可行的和功能性的，在4℃下进行约6〜8小时。
2。激活中性粒细胞
- 将100μl的PMN悬浮液（1×10 7个细胞/ ml）至1.5 ml Eppendorf管中。
注：样品管，应该至少一式两份。通常阴性对照应该包括：第一的抗体只，和二次抗体。 - 添加相应的抗integrin或抗Fc受体的单克隆抗体（mAb），10微克/毫升，并在冰上孵育15分钟。
- 通过加入1毫升的冷（4℃）PBS中，于1,743 xg离心（4,500 rpm转速）在离心的离心，吸取上清液。洗净PMN的
- 额攻丝针对机架的底部的管，将细胞沉淀，加入1ml冷的PBS中，洗2次以上，在前面的步骤。
注意：这些洗涤除去未结合的抗体。 - 重悬相同（PMNitial）量的温水（37°C）PBS含60μg/ ml的F（AB'）2的羊抗鼠IgG。
注：的二次抗小鼠IgG抗体将结合到第一抗受体抗体，将导致该受体的交联。 - 在37℃下孵育1至20分钟，这取决于对核因子的权益。 NF-κB的通常为15分钟，和Elk-1的通常为5分钟。
注：孵化的细胞在37℃下诱导受体交联，这是不可能发生的，在4℃下 - 加入1ml冷PBS，并在1743 XG中的微量离心3分钟。
- 除去上清液
- 冻结PMN立即在dry-ice/ethanol浴，让他们有10分钟。
3。隔离和固定的核
- 冷冻中性粒细胞沉淀重悬在100μl冷（4℃）的低渗缓冲液（10mM的HEPES，10 mM KCl中，1.5毫摩尔MgCl 2，和 1 mM的新鲜增值DL-二硫苏糖醇（DTT），pH值= 7.9）。建议采取管满分在dry-ice/ethanol浴一步法由一个，并加入低渗缓冲液之前，擦拭干净的试管底部。
- 置于冰上，并检查核完整的细胞核悬浮液用台盼蓝染色的等分。核举目四顾，蓝色。完整的中性粒细胞被染色，并显示为蓝色颗粒形状不规则的细胞碎片。
注：如果细胞核悬浮液中含有许多完整的细胞或碎片，最好是放弃的准备和与其它样本重复上述步骤。 - 离心机核在775 XG（3000转）的微量离心10分钟，寒冷的房间内。在这一点上核是很脆弱的，格外小心，应采取冷的样品，而不是在过大的力离心。
- 除去上清液非常小心的移液。
- 加入100μl冷的4％多聚甲醛固定核。
注：颗粒是非常松散的D添加缓冲液是足够的重悬细胞核。上下吹打应加以避免。 - 在冰上孵育20分钟。
- immunolabel原子核用于流式细胞仪，或将其维持长达24小时，在4℃下
4。核应用免疫流式细胞仪分析
- 离心1743的XG（4500转），原子核的离心1分钟，然后取出上清液很温柔的移液。
- 加入100μl的冷（4℃），0.1％的Triton X-100，在PBS中的4％多聚甲醛透性核。在冰中孵育10分钟。
- 在1743 XG中的微量离心机透核，小心地取出上清液。此时细胞核粒料不附加在试管底部。建议再次离心，沉淀得到宽松。
- 重悬细胞核在500μl的冷的4％牛胎儿血清（FBS）在PBS中，以阻断非特异性结合位点，并在冰上孵育20分钟。离心分离原子核在1743 XG的离心3分钟，小心地取出上清液。
- 重悬在100μl冷PBS含4％FBS和2.5微克/毫升的单克隆抗体对核因子的利息的原子核。在冰上孵育20分钟。
注：常住阴性对照只应包括抗核因子抗体，FITC标记的二次抗体只。 - 用500μl冷的PBS洗两次，用4％的FBS和在1743×g离心3分钟离心。
- 非常小心除去上清液，重悬核在冷PBS100μl的含有4％FBS和10微克/毫升，相应的FITC-标记的第二抗体，并在冰上孵育20分钟。
- 用500μl的冷PBS洗净细胞核两次与4％的FBS，如在前面的步骤。
- 重悬在400μl的冷的4％多聚甲醛的PBS中的原子核。
注：核被放置在多聚甲醛，让样品数天而不会受到污染，被存储血清的存在下，在可能发生的问题。 - 分析立即用流式细胞仪或存放在黑暗中，在4°C长达三天。
5。流式细胞仪分析
- 分析immunolabeled核流式细胞仪在FACScan（Becton Dickinson公司，新泽西州富兰克林湖）或类似的设备。
- 调整收购的设置，在日志规模在10-1：FSC，SSC在日志规模在196和栅极核点图。
- 采集每个样品10000核。
- 通过分析FITC染色的细胞核的荧光FL-1通道（506 nm）的日志规模在400。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
这里所描述的纯化方法通常提供未受刺激的嗜中性粒细胞（PMN）的纯度大于95％（ 图1A）。隔离PMN然后，可以通过交联的特定受体的特异性单克隆抗体的刺激。我们已刺激的PMN通过Fc受体和整合（ 图1B）。一旦受到刺激，中性粒细胞裂解和细胞核被隔离，产量高。细胞核，然后为一个特定的核转录因子核因子κB（NF-κB），与特定的抗体（ 图1B），如immunolabeled。
作为一个不同的人口从完整的中性粒细胞与一个点图（ 图2A）的流式细胞仪中的原子核，可以很容易地确认。在静息中性粒细胞基础水平的NF-κB在细胞核内（ 图2B）。通过交联β1整合素刺激后，NF-κB被转运到细胞核内，这个增量在核的NF-κB的耳鼻喉科检测到的荧光的增加（ 图2B）。同样地，通过交联β2整合也刺激的PMN诱导的NF-κB活化，所表示的荧光的增加（ 图2C）。了该方法的灵敏度允许检测小核因子水平的变化，这一事实证明了，β1整合素，其结合，如纤连蛋白，诱导更强的NF-κB活化大于β2整合素，其结合于其他细胞粘附分子的细胞外基质蛋白（比较图2B和2C）。
这种方法也被成功地用于检测Fc受体刺激的中性粒细胞NF-κB和Elk-1的16个核因子在孤立核后。这种方法简单，经济的，因此它可以很容易地修改，以在其他类型的细胞中核因子分析。
内容的“Fo：保持together.within”页面=“总是”>
图1。示意性表示从血液中的嗜中性粒细胞（PMN）的纯化，刺激细胞，隔离的核，在孤立的核的核因子和免疫标记A）肝素处理的血 液混合，用葡聚糖凝集红细胞。红细胞的沉淀物后，富含白细胞的血浆是顶部的红色细胞。这种白细胞丰富的等离子转移和分层的Ficoll-Paque在另一个管。离心分离后，单核细胞（MNC）的层被发现在血浆和Ficoll-Paque的相间。中性粒细胞被发现在该管的底部。B）隔离PMN由交联细胞膜受体的特异性单克隆抗体（mAb）的（橙色）和二次抗体（暗绿色刺激）。核因子kappa B（NF-κB）的分离及其抑制因子IκB和translocates进入细胞核。细胞核，然后分离，透和immunolabeled对NF-κB的或另一个核转录因子与特定的单克隆抗体（黄色），和FITC标记的二次抗体（浅绿色）。固定核分析用流式细胞仪（FACS） 点击此处查看大图 。
图2。分析NF-κB激活的中性粒细胞（PMN）A）完整的的PMN（左图）或孤立的核（右图）出现在流式细胞仪检测点积图的两个不同的群体。细胞和细胞核可以独立进行分析创建不同的门，R1（红色）的完整细胞，孤立的核R2（蓝色），B和C）的原子核分离出中性粒细胞，immunolabeled（NF-κBp50亚基）（绿色虚线），或单元格后被激活通过交联的（B）与TS2/16（蓝线）;或β2整合的特异性单克隆抗体的特异性单克隆抗体IB4（红色线）（C）与β1整合素。的灰色区域是从单独的FITC标记的二次抗体的荧光基底。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里所描述的纯化方法允许隔离未受刺激的嗜中性粒细胞（PMN）的纯度大于95％（通过显微镜观察评估），在很短的时间。有时，中性粒细胞被污染的红细胞，如果后者不完全溶解。通常这并不影响技术，通过流式细胞仪检测，因为红细胞和中性粒细胞可以很容易地被区分为不同的细胞群。隔离PMN然后，可以通过交联的特定受体的特异性单克隆抗体的刺激。事实上，中性粒细胞也可以被刺激的药理装置或通过粘合的各种基材上或其它细胞。这里介绍的方法可用于分析的信号转导途径，导致在中性粒细胞的细胞核的核因子的变化，细胞被激活后，由几乎任何相关的生物刺激。
一旦中性粒细胞有刺激作用，本文中所描述的方法可以快速，effici核耳鼻喉科净化和检测，在这些细胞核中NF-κB免疫荧光和流式细胞仪分析。 PMN刺激某些受体后，在细胞质中的NF-κB被释放及其抑制剂IκB，然后traslocated到细胞核中（ 图1B）。因此，NF-κB活化的水平确定的量，在细胞核中NF-κB的本。因为这种方法可以检测和测量NF-κB在细胞核中，它可以很容易地确定这种核转录因子的激活。以类似的方式，该方法可以检测其他核因子，活化的，当它们的激活被链接到在核的水平的变化。 ，激活核因素的变化可能是由于因子存在于细胞核中的量中的变化的情况下，因为它是为NF-kB的;或如磷酸化的变化，在分子结构中的因子的情况下，因为它是为ELK-1。此方法可用于检测Changes核水平的任何分子的特异性抗体是可用的。
这种方法产生一个纯粹的核的人口在一个简单而快速的方式。在低渗缓冲，突发的细胞，并留下完整的细胞核，细胞冷冻和溶解。完整的中性粒细胞或孤立的原子核通常会出现两个不同的群体，在流式细胞仪检测点积图。可以独立进行分析，通过创建不同的门完整的细胞，孤立的核细胞和细胞核。在一个完整的细胞样品的栅极被创建在大多数细胞出现的区域周围。同样地，与原子核样品的栅极被创建大多数原子核出现的区域周围。正常情况下，这两个门是在不同的地方的点图图。粒子，有时也检测出这些门，通常是细胞或核碎片，他们被排除在分析。如果细胞和细胞核门的重叠，这通常意味着核的准备是不骑士一个。此核的准备的分析是不可靠的，并和新鲜的缓冲液，最好是重复该过程。
开发工作与人类中性粒细胞的方法，但它也被成功地应用到各种细胞株中白细胞起源15。的方法，可以很容易地适于隔离原子核从各种细胞类型。重要的是开始的程序具有至少为1×10 6个细胞，为高效率的流式细胞术分析，以获得足够的原子核。如果结束时获得的小的晶核数目，最好是经常启动的方法，用3×10 6个细胞。
在裂解步骤中，不应该被允许冷冻细胞解冻。这将导致在产量低的，由于电池劣化。因此，可以建议采取一次一管满分的dry-ice/ethanol浴中裂解细胞。此外，它是重要的擦拭干净的管的外侧，然后再添加低渗裂解缓冲区。如果不这样做，有时会冻结的缓冲管，效率低下的细胞裂解，造成核污染的准备，以完整的细胞。尽管如此，这是不是一个严重的问题，因为，在大多数情况下的完整细胞和核可以用流式细胞仪分离。
由于原子核是非常脆弱的，才得到固定的，重要的是所有的缓冲溶液在4°C冷，让他们在冰。离心后，细胞核小球有时在试管底部松散，所以格外小心时，应采取除去上清液。这是更好地做比用微量真空抽吸。有时，可再次离心管，但不宜过多，因为这损害了核推荐的离心力量。
检测到的方法，使用特异性抗体的p50亚基（ 图2）的NF-κB活化，和ALSØp65亚基15本核因子。此外，核受体激活ERK和Elk-1的定量分析也成功地实现了16通过这种方法，这些分子使用相应的特异性抗体。此外，该方法允许检测的灵敏度在NF-κB核水平的小的变化，由于不同类型的整合（ 图2）由差刺激的PMN，也由于Fc的药理抑制受体启动的信号转导通路16 。一个良好的特异性抗体的结合和高效率的荧光标记的第二抗体，提供了很大的灵敏度，和允许检测小变化的量中的核因子的内部原子核的兴趣。这允许不同的刺激条件之前和之后的核因子的水平的定量比较。另外，该方法可以检测在孤立的女CLEI，其中一个很好的特异性抗体可几乎所有的分子。此外，免疫标记部分可以简化通过使用直接标记的抗体，该抗体与fluorochome，它除了将改善敏感性。最后，该方法提出了很大的灵活性，因为可以使用许多不同的fluorochomes。因此，该方法可以应用到许多不同的信号转导研究，涉及在细胞核中的蛋白质水平的变化。
最后，本文中所描述的方法的广泛适用性和灵敏度，把它作为一个简单的和经济的选择涉及在细胞核中的多种类型的细胞中的蛋白质水平变化的信号转导研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
作者要感谢南希·莫拉她的技术援助。
这项工作是由研究资助48573-M和168098从担任Consejo国家CIENCIAŸTECNOLOGIA，墨西哥，的补助IN212308和IN205311转向系总Asuntos DEL个人Academico，墨西哥国立自治大学，墨西哥。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur | |
References
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
