Summary
Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans le sang. Les neutrophiles possèdent des fonctions transcription régulés tels que la production de cytokines pro-inflammatoires et l'inhibition de l'apoptose. Ces fonctions peuvent être étudiés avec la méthode présentée ici, qui permet la détection et la quantification des facteurs nucléaires par cytométrie en flux dans les noyaux isolés
Abstract
Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans le sang périphérique. Ces cellules sont les premiers à apparaître sur les sites de l'inflammation et de l'infection, devenant ainsi la première ligne de défense contre les micro-organismes envahisseurs. Les neutrophiles possèdent d'importantes fonctions antimicrobiennes tels que la phagocytose, la libération d'enzymes lytiques, et la production d'espèces réactives de l'oxygène. En plus de ces fonctions de défense importants, les neutrophiles effectuer d'autres tâches en réponse à l'infection, comme la production de cytokines pro-inflammatoires et l'inhibition de l'apoptose. Cytokines recruter d'autres leucocytes qui aident à éliminer l'infection, et l'inhibition de l'apoptose des neutrophiles permet de vivre plus longtemps sur le site de l'infection. Ces fonctions sont réglementés au niveau de la transcription. Cependant, parce que les neutrophiles sont des cellules de courte durée, l'étude des réponses transcriptionnellement réglementées dans ces cellules ne peuvent pas être effectuées avec les méthodes classiques de gènes rapporteurs puisqu'il n'y a pas effitechniques santes pour la transfection des neutrophiles. Ici, nous présentons une méthode simple et efficace qui permet la détection et la quantification des facteurs nucléaires dans des noyaux isolés et immunomarquées par cytométrie en flux. Nous décrivons les techniques pour isoler les neutrophiles purs à partir de sang périphérique humain, de stimuler ces cellules avec des anticorps anti-récepteurs, d'isoler et de noyaux immunolabel, et d'analyser les noyaux par cytométrie en flux. La méthode a été utilisée avec succès pour détecter NF-kB et Elk-1 facteurs nucléaires dans les noyaux des neutrophiles et d'autres types cellulaires. Ainsi, cette méthode représente une option pour analyser l'activation des facteurs de transcription dans des noyaux isolés à partir d'une variété de types de cellules.
Introduction
Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans le sang périphérique 1. Au cours de neutrophiles inflammation et l'infection sont les premières cellules à apparaître sur le site touchée où ils agissent comme première ligne de défense 2. Les neutrophiles possèdent plusieurs mécanismes antimicrobiens 3, notamment la phagocytose, production d'espèces réactives de l'oxygène, la libération d'enzymes lytiques par la dégranulation et la production de cytokines pro-inflammatoires 4,5. Les neutrophiles sont des cellules de courte durée qui se rapidement activés par la signalisation de divers récepteurs de surface cellulaire. Bien que les neutrophiles ont été considérés cellules terminales en raison de leur courte durée de vie et parce qu'ils subissent une apoptose à moins activées pendant le processus inflammatoire 6, il est maintenant clair qu'ils peuvent également modifier leur phénotype en changeant le niveau de la transcription de gènes particuliers. La production de cytokines 5 et l'inhibition de l'apoptose 7,8 sont deux important fonctions cellulaires dépendant de l'activation régulée au niveau de la transcription dans les cellules neutrophiles. Le facteur nucléaire kB (NF-kB) participe à la régulation transcriptionnelle de 4 la production de cytokines et dans la régulation de la survie cellulaire et l'apoptose 9-11 dans différents types cellulaires.
Les voies de signalisation qui conduisent à l'activation du facteur nucléaire sont habituellement étudiées par des essais de gène rapporteur ou par électrophorèse des essais de décalage de mobilité (EMSA). Cependant, parce que les neutrophiles sont des cellules de courte durée, l'étude des réponses transcription régulés dans ces cellules ne peuvent pas être réalisées avec des dosages de gènes rapporteurs, car il n'existe pas de techniques efficaces pour la transfection des neutrophiles. Analyses EMSA ont été utilisés dans les neutrophiles d'explorer l'activation du facteur nucléaire 12,13; toutefois, cette méthode est compliquée et coûteuse car elle implique l'utilisation de matières radioactives. Nucléofection est une autre technique qui a été utilisée successfully pour transfecter monocytes 14. Ainsi, au moins en théorie, l'activation du facteur nucléaire a pu être détectée dans les neutrophiles par transfection (malgré la faible efficacité). Cependant, cette technique serait plus coûteux, fastidieux et probablement moins quantitative. L'analyse microscopique des cellules immunocolorées pourrait également être utilisé pour détecter les facteurs nucléaires dans le noyau. En effet, nous avons détecté une translocation de NF-kB dans le noyau de cette façon 15. Malheureusement, cette technique est aussi beaucoup de temps, moins quantitative, et sujettes à des biais de l'observateur.
Ici, nous présentons une méthode simple et efficace qui permet la détection et la quantification des facteurs nucléaires dans des noyaux isolés et immunomarquées par cytométrie en flux. On décrit des techniques pour isoler des neutrophiles du sang périphérique humain, stimuler ces cellules par l'intermédiaire des intégrines ou des récepteurs Fc avec des anticorps anti-récepteurs, d'isoler et de noyaux immunolabel, et analyser les noyaux par cytométrie de flux (Figure 1). La méthode a été utilisée avec succès pour détecter NF-kB 15 et Elk-1 16 facteurs nucléaires dans les noyaux des neutrophiles. La sensibilité de cette méthode permet la détection de petits changements dans les niveaux de facteurs nucléaires dans le noyau. Cette méthode peut également être utilisée pour analyser le niveau des facteurs de transcription dans le noyau à partir d'autres types cellulaires.
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Protocol
1. Isolement des neutrophiles (PMN) à partir de sang humain
- Utilisez environ 20 ml de sang humain avec de l'héparine (10 U / ml) comme anticoagulant. Le sang a été recueilli à partir adultes volontaires en bonne santé par ponction veineuse. Toutes les expériences ont été réalisées en cours d'approbation du Comité de bioéthique à l'Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM.
- Mettre 2 ml de 6% de dextrane T500 dans du PBS dans un tube à centrifuger conique de 15 ml et ajouter 10 ml de sang. Mélanger en inversant le tube deux ou trois fois et laisser reposer pendant 45 min pour permettre de sédimentation.
- Dans un tube à centrifuger frais 15 ml conique mettre 5 ml de Ficoll-Paque.
- Prenez le plasma riche en leucocytes qui s'est formé au-dessus érythrocytes sédimentés, et soigneusement pipette au-dessus du Ficoll-Paque former une deuxième couche. Assurez-vous qu'il ya deux phases.
- Centrifuger à 516 xg pendant 20 min à 4 ° C. Après centrifugation, à l'interphase de plasma et de Ficoll-Paque se trouve une couche de cellules mononucléées. Neutrophils sont au fond du tube.
- Eliminer le surnageant, briser le culot cellulaire en appuyant sur le tube contre une grille, et remettre les cellules en ajoutant 10 ml d'eau froide (4 ° C) PBS. Remarque: La remise en suspension des cellules par pipetage de haut en bas n'est pas recommandée car elle est trop dommageables pour les cellules.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifugation de 50 ml coniques et centrifuger à 290 xg pendant 5 min à 4 ° C.
- Briser le culot cellulaire comme avant et ajouter 10 ml d'eau froide (4 ° C) une solution hypotonique (0,2% de NaCl, 1% de BSA, 20 mM de HEPES, pH = 7,4) pour lyser les érythrocytes. Mélanger en agitant doucement le tube à la main pendant exactement une minute.
- Ajouter 10 ml d'eau froide (4 ° C) solution hypertonique (1,6% de NaCl, 1% de BSA, 20 mM d'HEPES, pH = 7,4), mélanger et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre (généralement> 95% sont des PMN).
Remarque: Conservez le tube avec la suspension cellulaire sur la glace tout en comptant les cellules. - Centrifuger comme avant et remettre en suspension PMN à 107 cellules / ml dans le froid (4 ° C) PBS. Garder sur la glace.
Remarque: Les neutrophiles demeurer viable et fonctionnelle à 4 ° C pendant environ 6 à 8 heures.
2. Activation PMN
- Mettez 100 pl de suspension de PMN (1 x 10 7 cellules / ml) dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.
Remarque: Les tubes échantillons doivent se faire au moins en double. Habituelles du contrôle négatif doit inclure premier anticorps seul, et l'anticorps secondaire. - Ajouter l'anticorps récepteur correspondant anti-intégrine ou anti-Fc monoclonal (Acm) à 10 pg / ml et incuber sur de la glace pendant 15 min.
- Laver PMN en ajoutant 1 ml d'eau froide (4 ° C) PBS, centrifugation à 1743 xg (4.500 rpm) dans une microcentrifugeuse, et l'aspiration du surnageant.
- Briser le culot cellulaire en appuyant sur la partie inférieure du tube contre une grille, ajouter 1 ml de PBS froid, et laver deux fois plus que lors de l'étape précédente.
Remarque: Ce lave éliminer les anticorps non liés. - PMN remettre en suspension dans la même (enitial) le volume d'eau tiède (37 ° C) PBS contenant 60 ug / ml de F (ab ') 2 de chèvre anti-IgG de souris.
Remarque: Le secondaire anti-IgG de souris se lie à la première anticorps anti-récepteur et provoquer la réticulation du récepteur. - Incuber à 37 ° C pendant 1 à 20 min, en fonction du facteur nucléaire de l'intérêt. Pour le NF-kB généralement de 15 min, et pour Elk-1 habituellement de 5 min.
Remarque: L'incubation des cellules à 37 ° C réticulation récepteur induit, ce qui ne peut avoir lieu à 4 ° C. - Ajouter 1 ml de PBS froid et centrifuger 3 min à 1743 xg dans microcentrifugeuse.
- Retirer le surnageant
- Congelez PMN immédiatement dans le bain dry-ice/ethanol et les y maintenir pendant 10 min.
3. L'isolement et la fixation des noyaux
- Remettre en suspension congelée PMN concentré dans 100 ul froid (4 ° C) tampon hypotonique (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, et 1 mM fraîchement ajoutée DL-dithiothreitol [DTT], PH = 7,9). Il est recommandé de prendre les tubes du bain une dry-ice/ethanol par un, et pour essuyer le fond du tube avant d'ajouter le tampon hypotonique.
- Placer sur la glace, et de vérifier l'intégrité des noyaux par coloration d'une aliquote de la suspension noyaux avec du bleu trypan. Noyaux regarder autour et bleu. PMN Intact ne se tacher, et les débris cellulaires apparaît sous forme de particules bleues de forme irrégulière.
Remarque: Si la suspension contient de nombreux noyaux des cellules intactes ou des débris, il est préférable de jeter la préparation et répéter la procédure avec un autre échantillon. - Centrifuger à 775 xg noyaux (3.000 rpm) microcentrifugeuse pendant 10 min dans une chambre froide. A ce point de noyaux sont très fragiles et des soins supplémentaires doivent être prises pour maintenir les échantillons à froid et non centrifugation à des forces excessives.
- Retirer le surnageant par pipetage très prudent.
- Ajouter 100 ul de paraformaldéhyde 4% dans du PBS froid pour fixer les noyaux.
Remarque: Le culot est très facilement perdre uned ajoutant le tampon est suffisant pour remettre en suspension les noyaux. Aspiration et refoulement doit être évitée. - Incuber dans la glace pendant 20 min.
- Noyaux Immunolabel la cytométrie de flux ou de les conserver jusqu'à 24 heures à 4 ° C.
4. L'immunomarquage des noyaux d'analyse de cytométrie en flux
- Centrifuger à 1743 xg noyaux (4.500 rpm) microcentrifugeuse pendant 1 min, puis retirez surnageant par pipetage très doux.
- Ajouter 100 ul de froid (4 ° C) 0,1% de Triton X-100, le paraformaldéhyde 4% dans du PBS à perméabiliser noyaux. Incuber dans la glace pendant 10 min.
- Centrifugeuse perméabilisées noyaux à 1743 xg dans microcentrifugeuse et retirer délicatement le surnageant. A ce stade, pellets noyaux n'attachent pas bien au fond du tube. Il est recommandé de centrifuger à nouveau si le culot se détache.
- Noyaux remettre en suspension dans 500 ul de sérum froid 4% de veau fœtal (FBS) dans du PBS pour bloquer les sites de liaison non spécifiques, et incuber sur de la glace pendant 20 min. Centrifugernoyaux à 1743 xg pendant 3 min dans microcentrifugeuse et retirer délicatement le surnageant.
- Resuspendre noyaux dans 100 ul de PBS froid contenant 4% de FBS et 2,5 ug / ml de l'anticorps monoclonal contre le facteur nucléaire des intérêts. Incuber dans la glace pendant 20 min.
Remarque: Usual contrôles négatifs doivent inclure anticorps anti-facteur nucléaire seulement, et marqué au FITC anticorps secondaire seul. - Laver deux fois avec 500 ul de PBS froid avec 4% de FBS et centrifugation à 1743 xg pendant 3 min.
- Retirer le surnageant avec beaucoup de soin, les noyaux remettre en suspension dans 100 ul de PBS froid contenant 4% de FBS et 10 pg / ml de la correspondante marqué au FITC anticorps secondaire et incuber sur de la glace pendant 20 min.
- Laver deux fois les noyaux avec 500 ul de PBS froid avec du FBS 4% comme dans l'étape précédente.
- Remettre en suspension dans 400 ul noyaux de paraformaldéhyde 4% dans du PBS froid.
Remarque: Les noyaux sont placés dans du paraformaldéhyde à permettre à l'échantillon doit être stocké pendant plusieurs jours sans contaminationproblèmes qui peuvent se produire en présence de sérum. - Analyser immédiatement par cytométrie en flux ou conserver à l'obscurité à 4 ° C pendant un maximum de trois jours.
5. Analyse par cytométrie en flux
- Analyser noyaux immunomarquées dans un cytomètre de flux tels un FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) appareil ou similaire.
- Réglez les paramètres d'acquisition d': FSC à échelle logarithmique à 10-1, SSC à échelle logarithmique à 196, et les noyaux de grille dans un point-parcelle.
- Acquérir dix mille noyaux par échantillon.
- Analyser la fluorescence du FITC-noyaux colorés par l'intermédiaire du canal FL-1 (506 nm) fixé à échelle logarithmique à 400.
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Representative Results
Le procédé de purification décrit ici fournit habituellement neutrophiles non stimulés (PMN) de pureté supérieure à 95% (figure 1A). PMN isolé peut ensuite être stimulée par les récepteurs spécifiques de réticulation avec des anticorps monoclonaux spécifiques. Nous avons stimulé PMN par le biais des récepteurs Fc et les intégrines (figure 1B). Une fois stimulés, PMN sont lysées et les noyaux sont isolés avec des rendements élevés. Les noyaux sont ensuite immunomarquées pour un facteur particulier nucléaire, tels que le facteur nucléaire kB (NF-kB), avec des anticorps spécifiques (figure 1B).
Les noyaux peuvent être facilement reconnus comme une population différente de PMN intacte dans le cytomètre en flux avec un point-plot (figure 2A). En PMN se reposer un niveau basal de NF-kB se trouve dans le noyau de la cellule (figure 2B). Lors de la stimulation par réticulation β1 intégrines, NF-kB est transloqué dans le noyau, ce qui increm ent en nucléaire NF-kB est détectée par une augmentation de la fluorescence (Figure 2B). De même, la stimulation des PMN par réticulation β2 intégrines a également induit l'activation de NF-kB comme indiqué par une augmentation de la fluorescence (figure 2C). La sensibilité de cette méthode permet la détection de petits changements dans les niveaux de facteurs nucléaires, comme en témoigne le fait que β1 intégrines, protéines qui se lient à la matrice extracellulaire tels que la fibronectine, induite forte activation de NF-kB de β2 intégrines, qui se lient aux molécules d'adhésion sur les cellules d'autres (comparer les figures 2B et 2C).
Cette méthode a également été utilisée avec succès pour détecter NF-kB 15 et Elk-1 16 facteurs nucléaires dans des noyaux isolés après la stimulation des récepteurs Fc des PMN. Cette méthode est simple et économique, ainsi il peut facilement être modifié pour analyser les facteurs nucléaires dans d'autres types cellulaires.
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Figure 1. Représentation schématique de neutrophiles (PMN) purification du sang, de la stimulation des cellules, l'isolement des noyaux, et immunomarquage de facteurs nucléaires de noyaux isolés. A) traité à l'héparine du sang est mélangé avec du dextrane à agglutiner des érythrocytes. Après sédiments érythrocytes, le plasma riche en leucocytes est au-dessus des globules rouges. Ce plasma riche en leucocytes est transférée et stratifiée sur Ficoll-Paque dans un autre tube. Après centrifugation, une couche de cellules mononucléaires (MNC) se trouve à l'interphase de plasma et de Ficoll-Paque. PMN se trouvent au fond du tube. B) Isolé PMN sont stimulés par réticulation membrane cellulaire des récepteurs spécifiques avec des anticorps monoclonaux (AcM) (orange) et un anticorps secondaire (vert foncé). Facteur nucléaire kappa B (NF-KB) se sépare de son inhibiteur IkB et une translocation dans le noyau. Les noyaux sont ensuite isolés, perméabilisées et immunomarquées contre NF-kB ou un autre facteur nucléaire avec des anticorps monoclonaux spécifiques (jaune), et un anticorps secondaire marqué au FITC (vert clair). Noyaux fixes sont analysés par cytométrie de flux (FACS). Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Analyse de l'activation de NF-kB dans les neutrophiles (PMN). A) PMN Intact (panneau de gauche) ou des noyaux isolés (panneau de droite) apparaissent comme deux populations distinctes de cytométrie en flux dot-plot graphiques. Cellules et des noyaux peuvent être analysées indépendamment parcréer différentes portes, R1 (rouge) pour des cellules intactes, et R2 (bleu) pour des noyaux isolés. B et C) Les noyaux isolés de PMN ont été immunomarquées pour NF-kB (p50 subunit), avant (ligne verte en pointillés), ou après que les cellules ont été activés par réticulation β1 intégrines (B) avec l'anticorps monoclonal spécifique TS2/16 (ligne bleue), ou β2 intégrines (C) avec l'anticorps monoclonal spécifique IB4 (ligne rouge). La zone grise est la fluorescence basale de l'anticorps marqué au FITC secondaire seul.
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Discussion
Le procédé de purification décrit ici permet d'isoler les neutrophiles non stimulés (PMN) de pureté supérieure à 95% (évaluée par l'observation microscopique), dans un court laps de temps. Parfois, les neutrophiles peuvent être contaminés par les érythrocytes si celui-ci ne sont pas lysées complètement. Cela ne devrait pas nuire à la technique, les érythrocytes et les PMN peuvent facilement être distingués comme des populations cellulaires distinctes par cytométrie en flux. PMN isolé peut ensuite être stimulée par les récepteurs spécifiques de réticulation avec des anticorps monoclonaux spécifiques. En fait, PMN peut également être stimulée par des moyens pharmacologiques ou par adhésion sur divers substrats ou d'autres cellules. La méthode présentée ici peut être utilisé pour analyser les voies de signalisation qui conduisent à des changements de facteurs nucléaires dans les noyaux PMN après que les cellules sont activées par pratiquement n'importe quel stimulus pertinent biologique.
Une fois PMN sont stimulés, la méthode décrite dans ce document permet de rapidement et efficient purification des noyaux et pour la détection, dans ces noyaux de NF-kB par immunofluorescence et cytométrie en flux. Après la stimulation de certains récepteurs PMN, NF-kB dans le cytoplasme est libérée de son inhibiteur IkB, puis traslocated dans le noyau (figure 1B). Ainsi, le niveau de l'activation de NF-kB est déterminée par la quantité de NF-kB dans le noyau. Parce que cette méthode peut détecter et mesurer la quantité de NF-kB dans le noyau, il peut facilement déterminer l'activation de ce facteur nucléaire. Le procédé peut de la même manière de détecter l'activation d'autres facteurs nucléaires, lors de leur activation est liée aux changements des niveaux nucléaires. Activation des changements de facteurs nucléaires peut être due à des changements dans la quantité de facteur présent dans le noyau, comme c'est le cas pour NF-kB, ou des changements tels que la phosphorylation, dans la structure moléculaire du facteur, comme c'est le cas pour Elk-1. Cette méthode peut être utilisée pour détecter changements de niveaux nucléaires de toute molécule pour laquelle un anticorps spécifique.
Cette méthode donne une population noyaux purs d'une manière simple et rapide. Les cellules sont congelées et lysées dans un tampon hypotonique qui a fait éclater les cellules ouvertes et laisse les noyaux intacts. PMN intacte ou noyaux isolés apparaissent généralement comme deux populations distinctes de cytométrie en flux dot-plot graphiques. Cellules et des noyaux peuvent être analysées indépendamment par la création de différentes portes de cellules intactes, et pour des noyaux isolés. Dans un échantillon de cellules intactes est un portail créé autour de la zone où la plupart des cellules apparaissent. De la même façon, avec un échantillon de noyaux d'un portail est créé autour de la zone où la plupart des noyaux apparaissent. Normalement, ces deux portes sont dans des endroits différents du graphe dot-plot. Les particules qui sont parfois détectés en dehors de ces portes, sont généralement de cellules ou de débris noyaux, et ils sont exclus de l'analyse. Si les portes des cellules et des noyaux se chevauchent, cela signifie généralement que la préparation des noyaux n'est pas cleune. L'analyse de cette préparation noyaux ne sont pas fiables, et il est préférable de répéter la procédure avec des tampons fraîchement préparés.
La méthode a été développée pour travailler avec les PMN humains, mais il a également été appliquée avec succès à diverses lignées cellulaires d'origine leucocytaire 15. La méthode peut facilement être adapté pour isoler les noyaux de différents types cellulaires. Il est important de commencer la procédure avec un minimum de 1 x 10 6 cellules, pour obtenir suffisamment de noyaux pour une analyse par cytométrie en flux efficace. Si un petit nombre de noyaux sont obtenus à la fin, il est préférable de commencer systématiquement la méthode avec 3 x 10 6 cellules.
Au cours de l'étape de lyse, les cellules congelées ne doivent pas être autorisés à dégeler. Cela se traduit par un faible rendement en raison de la dégradation des cellules. Ainsi, il est recommandé de prendre un tube à la fois hors de la salle de bain dry-ice/ethanol pour lyser les cellules. En outre, il est important pour essuyer l'extérieur du tube avant d'ajouter la lyse hypotoniquetampon. Lorsque cela n'est pas fait, le tampon se bloque parfois dans le tube, ce qui donne une lyse cellulaire inefficace et entraîne des préparations de noyaux qui sont contaminés par des cellules intactes. Pourtant, ce n'est pas un problème grave étant donné que dans la plupart des cas, les cellules intactes et les noyaux peuvent être séparés par cytométrie en flux.
Car les noyaux sont très fragiles avant qu'ils ne soient fixés, il est important d'avoir toutes les solutions tampons froide à 4 ° C en les gardant dans la glace. Après centrifugation, les pastilles noyaux sont parfois lâche au fond du tube, soins afin supplémentaires doivent être prises lors du retrait du surnageant. Ceci est mieux fait avec une micropipette à l'aspiration. À l'occasion, le tube peut être centrifugé de nouveau, mais les forces de centrifugation recommandées ne doivent pas être excessive, car cela endommage les noyaux.
Procédé détecté activation de NF-kB à l'aide d'anticorps spécifiques à la sous-unité p50 (figure 2), et also la sous-unité p65 15 de ce facteur nucléaire. En outre, la quantification des récepteurs à l'initiative activation nucléaire de ERK et Elk-1 a également été réalisée avec succès par cette méthode 16, en utilisant des anticorps spécifiques correspondantes contre ces molécules. En outre, la sensibilité de cette méthode a permis la détection de petits changements dans les niveaux de NF-kB nucléaires, en raison de la stimulation différentielle des PMN par différents types d'intégrines (figure 2), et aussi en raison de l'inhibition pharmacologique de récepteur Fc-initié voies de signalisation 16 . La combinaison d'un anticorps spécifique et une bonne efficacité anticorps marqué par fluorescence secondaire fournit une grande sensibilité et permet de détecter de petits changements dans la quantité du facteur nucléaire des noyaux d'intérêt à l'intérieur. Ce qui permet une comparaison quantitative des niveaux du facteur nucléaire avant et après différentes conditions de stimulation. En outre, cette méthode peut détecter dans les régions isolées nuClei, pratiquement toute molécule contre laquelle un anticorps produit spécifique est disponible. En outre, la partie immunomarquage peut être simplifiée en utilisant un anticorps marqué directement avec le fluorochome, qui en plus permettra d'améliorer la sensibilité. Enfin, la méthode présente une grande flexibilité car de nombreux fluorochomes différentes peuvent être utilisées. Ainsi, cette méthode peut être appliquée à de nombreuses études de transduction du signal qui impliquent des changements de taux de protéines dans le noyau.
En conclusion, la large applicabilité et la sensibilité de la méthode décrite dans le présent document, placez-le comme une option simple et économique pour les études de transduction du signal qui impliquent des changements de taux de protéines dans le noyau d'une variété de types de cellules.
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Disclosures
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Nancy Mora pour son assistance technique.
Ce travail a été financé par des subventions de recherche 48573-M et 168098 du Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, au Mexique, et par des subventions IN212308 et IN205311-2 à partir de Dirección General de Asuntos del Personal Academico, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, au Mexique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur | |
References
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