Summary
Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im Blut. Neutrophile besitzen transkriptionell reguliert Funktionen wie Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen und Hemmung der Apoptose. Diese Funktionen können mit dem hier vorgestellten Verfahren, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren können mittels Durchflusszytometrie in isolierten Zellkernen untersucht werden
Abstract
Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im peripheren Blut. Diese Zellen sind die ersten, an den Standorten der Entzündung und Infektion auftreten und somit als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroorganismen. Neutrophile besitzen wichtige Funktionen wie antimikrobielle Phagozytose, Freisetzung von lytische Enzyme, und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies. Zusätzlich zu diesen wichtigen Abwehrmechanismus funktioniert, führen Neutrophilen andere Aufgaben in Reaktion auf eine Infektion wie die Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen und Hemmung der Apoptose. Zytokine rekrutieren andere Leukozyten, die klar die Infektion zu helfen, und die Hemmung der Apoptose ermöglicht die Neutrophilen, länger zu leben am Ort der Infektion. Diese Funktionen werden auf der Ebene der Transkription reguliert. Da jedoch Neutrophilen kurzlebigen Zellen sind, kann die Untersuchung von transkriptionell reguliert Reaktionen in diesen Zellen nicht mit herkömmlichen Reportergen Verfahren durchgeführt werden, da es keine effiziente sindziente Techniken für neutrophilen Transfektion. Hier stellen wir eine einfache und effiziente Methode, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren isoliert und immunmarkierten Kerne mittels Durchflusszytometrie erlaubt. Wir beschreiben Methoden zur reinen Neutrophilen aus humanen peripheren Blut zu isolieren, diese Zellen zu stimulieren mit anti-Rezeptor-Antikörpern, zu isolieren und immunolabel Kerne und analysieren Kerne durch Durchflusszytometrie. Die Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um NF-kappaB und Elk-1 Kernfaktoren in Kernen von Neutrophilen und anderen Zelltypen erkennen. Somit stellt diese Methode eine Option zum Analysieren Aktivierung von Transkriptionsfaktoren an isolierten Kernen aus einer Vielzahl von Zelltypen.
Introduction
Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im peripheren Blut ein. Während Entzündungen und Infektionen Neutrophile sind die ersten Zellen, die an der betroffenen Stelle erscheinen, wo sie als erste Verteidigungslinie 2 handeln. Neutrophile besitzen mehrere antimikrobielle Mechanismen 3 einschließlich Phagozytose, die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, die Freisetzung von lytischen Enzymen durch Degranulation und Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen 4,5. Neutrophile sind kurzlebige Zellen, die sich schnell durch Signalisierung von verschiedenen Rezeptoren auf der Zelloberfläche werden aktiviert. Obwohl Neutrophilen wurden berücksichtigt terminalen Zellen aufgrund ihrer kurzen Lebensdauer und weil sie Apoptose, wenn während des entzündlichen Prozesses 6 aktiviert unterziehen, ist es nun klar, dass sie auch ändern ihren Phänotyp, indem Sie die Ebene der Transkription bestimmter Gene. Die Produktion von Cytokinen 5 und der Hemmung der Apoptose 7,8 sind zwei iW ichtig aktivierungsabhängige Zellfunktionen auf der Ebene der Transkription in Neutrophilen reguliert. Nuclear factor kappaB (NF-kB) beteiligt sich an der transkriptionalen Kontrolle Zytokinproduktion 4 und bei der Regulation der Apoptose und Überleben der Zellen 9-11 in verschiedenen Zelltypen.
Die Signalwege, die nuclear factor-Aktivierung führen, sind in der Regel durch Reportergen-Assays oder durch elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (EMSA) untersucht. Da jedoch Neutrophilen kurzlebigen Zellen sind, kann die Untersuchung von transkriptionell reguliert Reaktionen in diesen Zellen nicht mit Reportergen-Assays durchgeführt werden, da es keine effiziente Methoden zur Transfektion sind Neutrophilen. EMSA-Assays wurden in Neutrophilen verwendet worden, um nuclear factor-Aktivierung 12,13 erkunden, allerdings ist diese Methode aufwendig und teuer, da es die Verwendung von radioaktivem Material beinhaltet. Nukleofektion ist eine weitere Technik, die verwendet wurde successfully zu transfizieren Monozyten 14. Somit zumindest theoretisch könnte Kernfaktor Aktivierung der neutrophilen Granulozyten durch Transfektion detektiert werden (trotz niedriger Effizienz). Jedoch würde diese Technik teurer sein, zeitaufwendig und wahrscheinlich weniger quantitativ. Mikroskopische Analyse immunogefärbten Zellen könnten auch verwendet werden, um atomaren Faktoren im Kern zu erfassen. Tatsächlich haben wir NF-KB-Translokation in den Zellkern 15 auf diese Weise detektiert. Leider ist diese Technik auch zeitaufwendig, weniger quantitative und vorbehaltlich des Betrachters Bias.
Hier stellen wir eine einfache und effiziente Methode, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren isoliert und immunmarkierten Kerne mittels Durchflusszytometrie erlaubt. Wir beschreiben Techniken an Neutrophile aus humanen peripheren Blut zu isolieren, diese Zellen zu stimulieren über Integrine oder Fc-Rezeptoren mit anti-Rezeptor-Antikörpern, zu isolieren und immunolabel Kerne und analysieren Kerne durch Durchflusszytometrie (FBBILDUNG 1). Die Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um NF-kappaB 15 und Elk-1 16 Kernfaktoren in neutrophilen Kerne zu erkennen. Die Empfindlichkeit dieses Verfahren ermöglicht den Nachweis von kleinen Änderungen in nuclear factor Ebenen im Zellkern. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um das Niveau von Transkriptionsfaktoren in Kernen von anderen Zellarten zu analysieren.
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Protocol
Ein. Isolation von Neutrophilen (PMN) aus menschlichem Blut
- Verwenden etwa 20 ml Humanblut mit Heparin (10 U / ml) als Antikoagulans. Blut wurde von gesunden erwachsenen Freiwilligen durch intravenösen gesammelt. UNAM - Alle Experimente wurden unter Zustimmung des Bioethik-Ausschusses am Instituto de Investigaciones Biomédicas getan.
- Geben Sie 2 ml 6% Dextran T500 in PBS in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen und 10 ml Blut. Mix durch Invertieren des Röhrchens zwei oder drei Mal und lassen Sie es für 45 Minuten sitzen, um für Blutsenkungsgeschwindigkeit ermöglichen.
- In einem frischen 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen legte 5 ml Ficoll-Paque.
- Nehmen Sie die Leukozyten-reiche Plasma, das über sedimentiert Erythrozyten gebildet und sorgfältige Pipettierung es oben auf der Ficoll-Paque Bildung einer zweiten Schicht. Stellen Sie sicher, gibt es zwei Phasen.
- Zentrifuge bei 516 × g für 20 min bei 4 ° C. Nach der Zentrifugation an der Interphase von Plasma und Ficoll-Paque befindet sich eine Schicht von mononukleären Zellen. Neutrophils sind am Boden des Röhrchens.
- Beseitigen Sie den Überstand, brechen das Zellpellet indem das Rohr gegen ein Rack und die Zellen resuspendieren durch Zugabe von 10 ml kaltem (4 ° C) PBS. Hinweis: Resuspendieren der Zellen durch Auf-und Abpipettieren wird nicht empfohlen, da dies zu schädlich für die Zellen.
- Übertragen der Zellsuspension in ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 290 × g für 5 min bei 4 ° C.
- Brechen Sie das Zellpellet nach wie vor und mit 10 ml kaltem (4 ° C) hypotone Lösung (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4), um Erythrozyten zu lysieren. Mix durch Verwirbelung das Rohr vorsichtig von Hand genau eine Minute.
- 10 ml kaltem (4 ° C) hypertonischen Lösung (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4), mischen und zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometer (in der Regel> 95% PMN).
Hinweis: Bewahren Sie den Schlauch mit der Zellsuspension auf Eis beim Zählen der Zellen. - Zentrifuge nach vor und resuspendieren PMN bei 107 Zellen / ml in kaltem (4 ° C) PBS. Halten Sie auf dem Eis.
Hinweis: Neutrophile lebensfähig bleiben und funktionelle bei 4 ° C für etwa 6 bis 8 Stunden.
2. Aktivieren PMN
- Legen Sie 100 ul PMN Suspension (1 x 10 7 Zellen / ml) in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
Hinweis: Probengefäss sollte mindestens in Doppelbestimmung durchgeführt werden. Übliche negative Kontrollen sollten erste Antikörper nur, und sekundären Antikörper nur die. - Fügen Sie die entsprechenden Anti-Integrin oder anti-Fc-Rezeptor monoklonaler Antikörper (mAb) mit 10 ug / ml und Inkubation auf Eis für 15 min.
- Waschen PMN durch Zugabe von 1 ml kaltem (4 ° C) PBS, Zentrifugation bei 1.743 xg (4.500 rpm) in einer Mikrozentrifuge und Absaugen des Überstandes.
- Brechen Sie das Zellpellet durch Antippen der Unterseite des Rohrs gegen ein Rack, 1 ml kaltem PBS, und waschen Sie noch zwei weitere Male, wie im vorherigen Schritt.
Hinweis: Diese wäscht Entfernung ungebundener Antikörper. - Resuspendieren PMN in der gleichen (initial) Volumen von warmem (37 ° C) PBS, enthaltend 60 ug / ml F (ab ') 2 Ziegen anti-Maus-IgG.
Anmerkung: Die sekundären anti-Maus-IgG-Antikörper wird an den ersten anti-Rezeptor-Antikörper zu binden und Vernetzung des Rezeptors verursachen. - Bei 37 ° C während 1 bis 20 min, je nach Kernfaktor von Interesse. Für NF-KB üblicherweise 15 min und für Elk-1 üblicherweise 5 min.
Hinweis: Die Inkubation der Zellen bei 37 ° C induziert Rezeptor-Vernetzung, die nicht stattfinden kann bei 4 ° C. - 1 ml kaltem PBS und zentrifugieren 3 min bei 1.743 xg in Mikrozentrifuge.
- Überstand entfernen
- Frieren PMN sofort dry-ice/ethanol Bad und halten sie dort für 10 min.
3. Isolation und Fixierung der Kerne
- Resuspendieren gefrorenen PMN Pellet in 100 ul kaltem (4 ° C) hypotonischen Puffer (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, und 1 mM frisch-added DL-Dithiothreitol [DTT], PH = 7,9). Es wird empfohlen, die Rohre nehmen aus dem dry-ice/ethanol Bad eins nach dem anderen, und Wischen Sie die Unterseite des Rohres vor der Zugabe der hypotonen Puffer.
- Auf Eis, und überprüfen Kerne Integrität durch Färbung einen aliquoten Teil der Kerne Suspension mit Trypanblau. Kerne umsehen und blau. PMN intakten nicht angefärbt, erhalten und Zelltrümmer erscheint als blaue Teilchen von unregelmäßiger Form.
Hinweis: Wenn Kerne Suspension enthält viele intakte Zellen oder Schmutz, ist es besser, die Vorbereitung zu verwerfen und wiederholen Sie den Vorgang mit einer anderen Probe. - Zentrifuge Kerne bei 775 xg (3.000 rpm) in Mikrozentrifuge für 10 min in einem kalten Raum. An diesem Punkt Kerne sehr zerbrechlich und besondere Sorgfalt sollte im Einklang die Proben kalt und nicht Zentrifugieren bei übermäßigen Kräften getroffen werden.
- Überstand entfernen, indem Sie sehr vorsichtig Pipettieren.
- Je 100 ul kaltem 4% Paraformaldehyd in PBS auf Kerne zu fixieren.
Hinweis: Das Pellet wird sehr locker eind Zugabe des Puffers ausreicht, um die Kerne zu resuspendieren. Und Abpipettieren sollte vermieden werden. - Inkubieren auf Eis für 20 min.
- Immunolabel Kerne für die Durchflusszytometrie oder halten sie für bis zu 24 Stunden bei 4 ° C.
4. Kerne Immunmarkierung für die Durchflusszytometrie-Analyse
- Zentrifuge Kerne bei 1.743 xg (4.500 rpm) in Mikrozentrifuge für 1 min, und entfernen Sie Überstand durch sehr vorsichtiges Pipettieren.
- Je 100 ul kaltem (4 ° C) 0,1% Triton X-100, 4% Paraformaldehyd in PBS auf Kerne permeabilisieren. Inkubieren auf Eis für 10 min.
- Centrifuge permeabilisiert Kerne bei 1.743 xg in Mikrozentrifuge und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. An diesem Punkt Kerne Pellets nicht gut befestigen am Boden des Röhrchens. Es wird empfohlen, wieder zentrifugiert, wenn das Pellet wird locker.
- Resuspendieren Kerne in 500 ul kaltem 4% fötales Rinderserum (FBS) in PBS unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, und Inkubieren auf Eis für 20 min. ZentrifugierenKerne bei 1.743 xg für 3 min in Mikrozentrifuge und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
- Resuspendieren Kerne in 100 ul kaltem PBS mit 4% FBS und 2,5 ug / ml des mAb gegen den nuclear factor von Interesse. Inkubieren auf Eis für 20 min.
Hinweis: Übliche negative Kontrollen sollten Anti-Atomkraft-Antikörper nur beinhalten, und FITC-markierten sekundären Antikörper nur. - Zweimal waschen mit 500 ul kaltem PBS mit 4% FBS und Zentrifugation bei 1743 xg für 3 min.
- Entfernen Sie den Überstand sehr vorsichtig resuspendieren Kerne in 100 ul kaltem PBS mit 4% FBS und 10 ug / ml des entsprechenden FITC-markierten sekundären Antikörper und Inkubation auf Eis für 20 min.
- Waschen Kerne zweimal mit 500 &mgr; l kaltem PBS mit 4% FBS wie in den vorangegangenen Schritt.
- Resuspendieren Kerne in 400 &mgr; l kaltem 4% Paraformaldehyd in PBS.
Anmerkung: Die Zellkerne werden in Paraformaldehyd platziert, damit die Probe für mehrere Tage gelagert werden ohne KontaminationProbleme, die in der Gegenwart von Serum auftreten kann. - Analysieren sofort durch Durchflusszytometrie oder dunkel lagern bei 4 ° C bis zu drei Tage.
5. Durchflusszytometrie-Analyse
- Analysieren immunmarkierten Kerne in einem Durchflußzytometer wie einem FACScan (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ) oder einer ähnlichen Vorrichtung.
- Passen Akquisition Einstellungen: FSC bei log-Skala auf 10-1, SSC bei log-Skala bei 196 und Gate-Kerne in einem Dot-Plot.
- Erwerben zehntausend Kerne pro Probe.
- Analysieren Fluoreszenz von FITC-gefärbten Zellkernen durch die FL-1-Kanal (506 nm) bei log-Skala auf 400 eingestellt.
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Representative Results
Die Reinigung hier beschriebene Methode der Regel bietet unstimulierten Neutrophilen (PMN) mit einer Reinheit von mehr als 95% (Abbildung 1A). Isoliert PMN kann dann durch Vernetzung insbesondere Rezeptoren mit spezifischen monoklonalen Antikörpern stimuliert werden. Wir haben PMN durch Fc-Rezeptoren und Integrine (1B) stimuliert. Einmal stimuliert, PMN lysiert und Kerne mit hohen Ausbeuten isoliert. Kerne werden dann für eine bestimmte nuclear factor, wie die Kernfaktor kappaB (NF-kB), mit spezifischen Antikörpern (1B) immunmarkiert.
Kerne können leicht als andere Population aus intakten PMN im Durchflusszytometer mit einem Dot-Plot (Abbildung 2A) erkannt werden. In ruht PMN ein Grundniveau von NF-kappaB ist im Zellkern (Abbildung 2B) gefunden. Bei Stimulierung durch Vernetzen β1-Integrine, wird NF-kB in den Zellkern und dieser Kettenmaß transloziert ent in nuklearen NF-kB wird als eine Zunahme der Fluoreszenz (2B) detektiert. Ähnlich Stimulation von PMN durch Vernetzen β2-Integrine auch NF-KB-Aktivierung induziert, wie durch einen Anstieg der Fluoreszenz (2C) angedeutet. Die Empfindlichkeit dieses Verfahren ermöglicht den Nachweis von kleinen Änderungen in nuclear factor Ebenen wie durch die Tatsache belegt, dass β1-Integrine, die Proteine der extrazellulären Matrix, wie Fibronektin, induzierte stärkere NF-KB-Aktivierung als β2-Integrine, die Adhäsionsmoleküle gebunden auf anderen Zellen binden (vgl. 2B und 2C).
Diese Methode wurde auch erfolgreich verwendet, um NF-kappaB 15 und Elk-1 16 Kernfaktoren in isolierten Zellkernen nach Fc-Rezeptor-Stimulation von PMN zu erkennen. Dieses Verfahren ist einfach und kostengünstig, so kann es leicht modifiziert werden, um nukleare Faktoren in anderen Zelltypen zu analysieren.
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Abbildung 1. Schematische Darstellung der Neutrophilen (PMN) Reinigung von Blut, Stimulation von Zellen, Isolation von Zellkernen und Immunomarkierung der nuklearen Faktoren in isolierten Zellkernen. A) Heparin behandelten Blut mit Dextran gemischt, um Erythrozyten agglutiniert. Nach Erythrozyten sedimentieren, ist die Leukozyten-reiche Plasma oben auf den Erythrozyten. Diese Leukozyten-reiche Plasma übertragen wird und geschichtet oben auf Ficoll-Paque in ein anderes Röhrchen. Nach Zentrifugation wird eine Schicht von mononukleären Zellen (MNC) an der Interphase von Plasma und Ficoll-Paque gefunden. PMN sind am unteren Rand des Rohres vorhanden. B) Isolierte PMN durch Vernetzen Zellmembran-Rezeptoren mit spezifischen monoklonalen Antikörpern (mAb) (orange) und einem sekundären Antikörper (dunkelgrün angeregt). Nuclear factor kappa B (NF-kappaB) trennt sich von seinem Inhibitor IKB und transloziert in den Zellkern. Kerne werden dann getrennt, permeabilisiert und immunmarkiert gegen NF-kB oder eine andere Kernfaktor mit einer spezifischen mAb (Gelb), und einem FITC-markierten sekundären Antikörper (hellgrün). Feste Kerne werden mittels Durchflusszytometrie (FACS) analysiert. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2. Analyse von NF-kappaB Aktivierung der neutrophilen Granulozyten (PMN). A) Intact PMN (links) oder isolierten Kernen (rechts) erscheinen als zwei unterschiedliche Populationen in der Durchflusszytometrie Dot-Plot Grafiken. Zellen und Kerne können unabhängig vom analysiert werdenErstellen verschiedener Tore, R1 (rot) für intakte Zellen und R2 (blau) für isolierte Kerne. B und C) Kerne aus PMN isoliert wurden für die NF-kappaB (p50-Untereinheit) immunmarkiert vor (grün gestrichelte Linie), oder nachdem die Zellen aktiviert wurden durch Vernetzen β1-Integrine (B) mit dem spezifischen monoklonalen Antikörper TS2/16 (blaue Linie), oder β2-Integrine (C) mit dem spezifischen monoklonalen Antikörper IB4 (rote Linie). Der graue Bereich ist die Fluoreszenz von der basalen FITC-markierten sekundären Antikörper alleine.
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Discussion
Die Reinigung hier beschriebene Methode ermöglicht die Isolierung von unstimulierten Neutrophilen (PMN) mit einer Reinheit größer als 95% (bestimmt durch mikroskopische Beobachtung), in einer kurzen Zeit. Manchmal kann durch Neutrophile Erythrozyten kontaminiert werden, wenn letztere nicht vollständig lysiert werden. Dies bedeutet in der Regel nicht auf die Technik, da Erythrozyten und PMN kann leicht als deutliche Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie unterschieden werden. Isoliert PMN kann dann durch Vernetzung insbesondere Rezeptoren mit spezifischen monoklonalen Antikörpern stimuliert werden. In der Tat kann auch durch PMN pharmakologischen Mitteln oder durch Haftung auf verschiedenen Substraten oder anderen Zellen stimuliert werden. Die hier vorgestellte Methode kann verwendet werden, um Signalwege, die zu Veränderungen der nuklearen Faktoren in PMN Kernen führen, nachdem die Zellen von praktisch allen relevanten biologischen Stimulus aktiviert analysieren.
Sobald PMN stimuliert werden, ermöglicht das Verfahren in dieser Veröffentlichung beschrieben zur raschen und efizienteent Reinigung von Kernen und zum Nachweis, zur in diesen Kernen von NF-kB durch Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie-Analyse. Nach PMN Stimulation bestimmter Rezeptoren, wird NF-kB in dem Cytoplasma von der Inhibitor IKB freigesetzt und dann in den Kern traslocated (1B). Somit wird der Pegel des NF-KB-Aktivierung durch die Menge an NF-KB im Kern bestimmt. Da diese Methode können erkennen und messen die Menge an NF-KB im Zellkern, kann es leicht zu bestimmen Aktivierung dieses nuclear factor. Das Verfahren kann in einer ähnlichen Weise detektieren Aktivierung anderer Faktoren nuklearen bei ihrer Aktivierung auf Änderungen Kernniveaus verknüpft ist. Aktivieren von Änderungen der nuklearen Faktoren können aufgrund von Veränderungen in der Menge des Faktors im Kern vorhanden, wie es der Fall für die NF-kB ist, oder Veränderungen wie Phosphorylierung, in der molekularen Struktur des Faktors, wie es der Fall ist für Elk-1. Diese Methode kann verwendet werden, um c erkennenorbehalten von Kernniveaus eines Moleküls, für die ein spezifischer Antikörper ist.
Diese Methode liefert eine reine Kerne Bevölkerung in eine einfache und schnelle Art und Weise. Zellen werden eingefroren und in einer hypotonischen Puffer, der die Zellen aufplatzen und verlässt intakten Zellkerne lysiert. Intact PMN oder isolierte Kerne erscheinen normalerweise als zwei getrennte Populationen in der Durchflusszytometrie Dot-Plot Grafiken. Zellen und Kerne können unabhängig indem verschiedene Tore für intakte Zellen und zur isolierten Kernen analysiert werden. In einer intakten Zelle Probe ein Gate ist um den Bereich, wo die meisten Zellen erscheinen erstellt. Ebenso mit einem Kerne Probe ein Tor in der Gegend, wo die meisten Kerne erscheinen erstellt. Normalerweise sind diese zwei Tore sind in verschiedenen Orten der Dot-Plot Diagramm. Teilchen, die manchmal sind aus diesen Toren detektiert, sind normalerweise Zelle oder Kerne Schutt, und sie werden aus der Analyse gelassen. Wenn die Zelle und Kerne Toren überlappen, bedeutet das normalerweise, dass die Kerne Zubereitung nicht cleein. Analyse dieser Kerne Zubereitung ist nicht zuverlässig, und es ist besser, das Verfahren mit frisch zubereiteten Puffern wiederholen.
Das Verfahren wurde entwickelt, um mit der menschlichen PMN arbeiten, aber es wurde auch erfolgreich auf verschiedenen Zelllinien von Leukozyten Ursprungs 15 angewendet. Das Verfahren kann ohne weiteres an Kernen aus unterschiedlichen Zelltypen zu isolieren. Es ist wichtig, das Verfahren mit einem Minimum von 1 x 10 6 Zellen beginnen, um genügend Kerne für eine effiziente Durchflusszytometrie Analyse zu erhalten. Wenn eine kleine Anzahl von Kernen am Ende erhalten werden, ist es besser, routinemäßig startet das Verfahren mit 3 × 10 6 Zellen.
Während der Lyse Schritt sollte gefrorenen Zellen nicht erlaubt, auftauen. Dies führt in geringer Ausbeute durch Zellabbau. So ist es empfehlenswert, einen Röhre zu einer Zeit aus dem Bad, um dry-ice/ethanol Zellen zu lysieren. Außerdem ist es wichtig, Wischen reinigt das Äußere des Rohres vor der Zugabe des hypotonische LysePuffer. Wenn dies nicht getan wird, der Puffer manchmal friert in dem Rohr, wodurch ein ineffizientes Zelllyse und resultierenden Zubereitungen in Kernen, die von intakten Zellen kontaminiert sind. Dennoch ist dies kein ernsthaftes Problem gegeben, dass in den meisten Fällen intakten Zellen und Zellkerne mittels Durchflusszytometrie getrennt werden können.
Weil Kerne sehr zerbrechlich sind, bevor sie fixiert werden, ist es wichtig, dass alle Pufferlösungen kalten bei 4 ° C, indem man sie in Eis. Nach Zentrifugation Kerne Pellets manchmal lose am unteren Ende des Rohres ist, sollte besondere Sorgfalt, damit beim Herausnehmen der Überstand werden. Das ist besser mit einer Mikropipette als mit Vakuumaspiration getan. Gelegentlich kann das Rohr erneut zentrifugiert werden, aber die empfohlenen Zentrifugalkräften sollte nicht sein, weil diese Schäden die Kerne übertrieben.
Das Verfahren detektiert NF-KB-Aktivierung unter Verwendung von Antikörpern spezifisch für die p50-Untereinheit (Abbildung 2) und ALSo Der p65-Untereinheit 15 dieser nuclear factor. Auch wurde die Quantifizierung von Rezeptor-initiierte nukleäre Aktivierung von ERK und Elk-1 auch erfolgreich durch diese Methode 16 erreicht, wobei die entsprechenden spezifischen Antikörper gegen diese Moleküle. Darüber hinaus ist die Empfindlichkeit dieser Methode erlaubt Nachweis von kleinen Änderungen in NF-KB Kernniveaus, aufgrund unterschiedlicher Stimulierung von PMN durch verschiedene Arten von Integrinen (Abbildung 2), und auch aufgrund pharmakologische Hemmung der Fc-Rezeptor-initiierten Signalwege 16 . Die Kombination einer guten spezifischen Antikörper und einem effizienten fluoreszenzmarkierten zweiten Antikörper bietet große Empfindlichkeit und erlaubt die Detektion von kleinen Änderungen in der Menge des nukleären Faktors von Interesse innerhalb Kernen. Dies ermöglicht einen quantitativen Vergleich der Ebenen der Kernfaktor vor und nach verschiedenen Stimulationsbedingungen. Außerdem kann dieses Verfahren in isolierten nu detektierenCLEI, praktisch jedes beliebige Molekül, gegen die eine gute spezifische Antikörper zur Verfügung steht. Weiterhin kann die Immunmarkierung teilweise durch die Verwendung eines Antikörpers direkt mit dem fluorochome, die zusätzlich Sensibilität zu verbessern markierten vereinfacht werden. Schließlich stellt das Verfahren eine hohe Flexibilität, weil viele verschiedene fluorochomes können verwendet werden. Somit kann dieses Verfahren auf viele verschiedene Studien, die Signaltransduktion Veränderungen der Protein-Spiegel im Nucleus umfassen aufgebracht werden.
Zusammenfassend stellt die breite Anwendbarkeit und Sensitivität des Verfahrens in dieser Veröffentlichung beschrieben ist, stellen sie als eine einfache und kostengünstige Möglichkeit für die Signaltransduktion Studien, die Veränderungen der Protein-Spiegel in den Kern einer Vielzahl von Zelltypen umfassen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Nancy Mora für ihre technische Unterstützung danken.
Diese Arbeit wurde durch Forschungsgelder 48.573-M und 168098 vom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Mexiko und durch Zuschüsse IN212308 und IN205311-2 von Dirección General de Asuntos del Personal Academico, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Mexico finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur | |
References
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