يتم وصف إجراءات إعادة كاملة من قناة البوتاسيوم الجهد بوابات النموذج في الأغشية الدهنية. القنوات المعاد هي مناسبة لفحوصات الكيمياء الحيوية، والتسجيلات الكهربائية، وفحص يجند والدراسات البلورات الإلكترون. قد يكون هذه الأساليب التطبيقات العامة للدراسات الهيكلية والوظيفية للبروتينات غشاء الأخرى.
لدراسة التفاعل دهون، بروتين بطريقة reductionistic، فمن الضروري دمج بروتينات الغشاء في الأغشية من تكوين الدهون واضحة المعالم. نحن ندرس آثار النابضة التي تعتمد على الدهون في البوتاسيوم الجهد بوابات (كيلو فولت) قناة النموذج الأولي، وعملت الإجراءات المفصلة لإعادة تشكيل قنوات في غشاء أنظمة مختلفة. إجراءات إعادة النظر في اتخاذ لدينا على حد سواء الانصهار المنظفات التي يسببها من الحويصلات والانصهار من البروتين / المنظفات المذيلات مع دهن / المنظفات المذيلات المختلطة فضلا عن أهمية التوصل إلى توزيع توازن الدهون بين البروتين / المنظفات / الدهون والمنظفات المذيلات المختلطة / الدهون. اقترح البيانات المتوفرة لدينا أن الإدراج من القنوات في حويصلات الدهنية هو عشوائي نسبيا في التوجهات، وكفاءة إعادة مرتفع بحيث لم تظهر أية المجاميع البروتين التي يمكن اكتشافها في التجارب تجزئة. لقد استخدمت إعادةقنوات D لتحديد الدول بتكوين جزئي من القنوات في الدهون المختلفة، وتسجيل الأنشطة الكهربائية من عدد قليل من القنوات إدراجها في طبقات ثنائية الدهون مستو، وشاشة لبروابط التشكل محددة من مكتبة الببتيد عرض-فج، ودعم نمو بلورات 2D من القنوات في الأغشية. يمكن تكييفها إجراءات إعادة الموصوفة هنا لدراسة بروتينات غشاء أخرى في طبقات ثنائية الدهون، وخاصة للتحقيق في آثار الدهون على القنوات الأيونية الجهد بوابات حقيقية النواة.
الخلايا تبادل المواد والمعلومات مع بيئتها من خلال وظائف بروتينات غشاء محددة 1. بروتينات الغشاء في أغشية الخلايا تؤدي وظيفة ومضخات، والقنوات، المستقبلات، والإنزيمات intramembrane، ينكرز وأنصار الهيكلي عبر الأغشية. كانت الطفرات التي تؤثر على بروتينات الغشاء ذات الصلة العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان. في الواقع، كانت العديد من البروتينات الغشاء الأهداف المخدرات الأولية لأنها مهمة ويمكن الوصول إليها بسهولة في أغشية الخلايا. ولذا فمن المهم جدا لفهم بنية ووظيفة البروتينات الغشاء مختلف في الأغشية، وتجعل من الممكن استنباط أساليب جديدة للتخفيف من الآثار الضارة من البروتينات متحولة في الأمراض التي تصيب الإنسان.
الدهون تحيط بكل بروتينات غشاء متكاملة في طبقات ثنائية 2، 3. في الأغشية حقيقية النواة، من المعروف أن مختلف أنواع مختلفة من الدهون التي سيتم تنظيمها في microdomains 4، 5.وقد أظهرت العديد من البروتينات الغشاء ليتم توزيعها بين هذه microdomains فضلا عن مرحلة السوائل ضخمة من الأغشية 3، 6. الآلية التي يقوم عليها التنظيم من microdomains وتسليم بروتينات الغشاء الى لهم وأهمية الفسيولوجية مثل هذه التوزيعات هي مهمة بوضوح ولكن لا تزال غير مفهومة تماما. إحدى الصعوبات التقنية الرئيسية في دراسة آثار الدهون على بروتينات الغشاء هو إعادة موثوقة من تنقية البروتينات كيميائيا الغشاء في الأغشية التي تسيطر عليها جيدا تركيبة الدهون حتى يتسنى لجميع البروتينات أعادت تقريبا وظيفية 7. في السنوات القليلة الماضية، قمنا بتطوير طرق لإعادة تشكيل قناة البوتاسيوم الجهد بوابات النموذج الأولي من A. pernix (KvAP) في النظم المختلفة لغشاء الهيكلية والوظيفية دراسات 8-10. وأظهرت بيانات من الآخرين، ولنا معا أن الدهون من المرجح عاملا محددا في التغييرات متعلق بتكوين من الجهد الاستشعارالمجالات من قناة أيون الجهد بوابات وربما تشكيل هياكل بعض من هذه القنوات 11. في القادم، وسوف نقدم وصفا مفصلا لأساليب عملنا وسوف نقدم نصائح تقنية الحرجة التي من المرجح أن ضمان نجاح الاستنساخ من نتائجنا وكذلك تمديد طرقنا على دراسات للبروتينات غشاء الأخرى.
وقد استخدم إعادة تشكيل قنوات KvAP في الأغشية المختلفة في العديد من الدراسات 8-10. بعد فكرة ضمان توزيع الدهون بين المنظفات / الدهون المذيلات المختلطة والبروتين / المنظفات / الدهون المذيلات المختلطة، ونحن قادرون على الوصول إلى إعادة شبه كاملة من KvAP في الأغشية المصنوع…
The authors have nothing to disclose.
وقد حصل على دراسات في KvAP في المختبر جيانغ مساعدة كبيرة من رودريك ماكينون معمل د. في جامعة روكفلر. شكر خاص إلى الدكتور Kathlynn براون ومايكل McQuire للحصول على المشورة والمساعدة على التجارب بشاشة فج لدينا. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (GM088745 وGM093271 إلى Q-XJ) وAHA (12IRG9400019 إلى Q-XJ).
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
NaCl | Fisher | S271-3 | |
Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
PMSF | SIGMA | P7626 | |
Dnase I | Roche | 13407000 | |
Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
Pentane | Fisher | R399-1 | |
Decane | TCI America | D0011 | |
MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |