Beredning av ett Kv Channel i lipidmembraner för strukturella och funktionella studier
Summary
Rutiner för fullständig upplösning av en prototyp spänning-gated kalium kanal till lipidmembranen beskrivs. De ombildade kanaler är lämpliga för biokemiska analyser, elektriska inspelningar, ligand screening och elektron studier kristallografiska. Dessa metoder kan ha generella applikationer till de strukturella och funktionella studier av andra membranproteiner.
Abstract
För att studera lipid-protein-interaktion i en reduktionistiska sätt, är det nödvändigt att införliva membranproteinerna till membran med väldefinierad lipidkomposition. Vi studerar lipidberoende slussning effekter i en prototyp spänning-gated kalium (Kv) kanal, och har utarbetat detaljerade förfaranden att rekonstruera kanalerna i olika membran system. Våra rekonstitutionslösningar förfaranden ta hänsyn till både tvättmedel-inducerad fusion av blåsor och fusion av protein / detergentmiceller med lipid / detergent blandade miceller samt vikten av att nå en jämvikt fördelning av lipider mellan protein / tvättmedel / lipid och tvättmedel / lipid-blandade miceller. Våra data tyder på att införandet av kanalerna i lipidvesiklarna är relativt slumpmässigt i orienteringar, och rekonstituering effektivitet är så hög att inga detekterbara proteinaggregat sågs i fraktionering experiment. Vi har utnyttjat rekonstruerad kanaler för att bestämma de konformationstillstånd av kanalerna i olika lipider, registrerar elektriska verksamheten i ett litet antal kanaler som ingår i plana lipidbiskikten, skärm för konformation-specifika ligander från en fag visas-peptid bibliotek och stödja framväxten av 2D-kristaller av kanalerna i membranen. Rekonstitutionslösningar som beskrivs här kan anpassas för att studera andra membranproteiner i lipidbiskikten, speciellt för undersökning av lipid effekter på eukaryota spänning-jonkanaler.
Introduction
Celler utbyta material och information med sin omgivning genom funktioner specifika membranproteiner 1. Membranproteiner i cellmembranen fungerar som pumpar, kanaler, receptorer, enzymer intramembrane, länkare och strukturella supportrar över membran. Mutationer som påverkar membranproteiner har anknytning till många mänskliga sjukdomar. I själva verket har många membranproteiner varit de främsta läkemedelsmål eftersom de är viktiga och lätt åtkomliga i cellmembran. Det är därför mycket viktigt att förstå strukturen och funktionen hos olika membranproteiner i membran, och göra det möjligt att ta fram nya metoder för att lindra de skadliga effekterna från de mutanta proteiner i mänskliga sjukdomar.
Lipider omger alla membranproteiner integrerade i dubbelskikten 2, 3. I eukaryota membran är de olika olika typer av lipider kända för att vara organiserade i mikroområdena 4, 5.Många membranproteiner visades att fördelas mellan dessa mikrodomäner samt skrymmande vätskefasen av membran 3, 6. Mekanismen bakom organisationen av mikroområdena och leverans av membranproteiner i dem och den fysiologiska betydelsen av dessa distributioner är självklart viktigt, men fortfarande dåligt kända. En stor teknisk svårighet studera lipid effekter på membranproteiner är tillförlitlig beredning av biokemiskt renade membranproteiner i membran av välkontrollerade lipidsammansättning så att nästan alla rekonstitueras proteiner är funktionella 7. Under de senaste åren har vi utvecklat metoder för att rekonstruera prototypen spänning-gated kalium kanal från A. Pernix (KvAP) i olika membran system för strukturella och funktionella studier 8-10. Data från andra och oss visade tillsammans att lipider är sannolikt en faktor i konformationsförändringarna av spänning-avkänningdomänerna av en spänning-jonkanal och kan forma strukturerna för några av dessa kanaler 11. I nästa, kommer vi att ge en detaljerad beskrivning av våra metoder och kommer att erbjuda kritiska tekniska tips som sannolikt kommer att säkerställa en framgångsrik reproduktion av våra resultat samt en förlängning av våra metoder för studier av andra membranproteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rekonstruktionen av KvAP kanaler i olika membran har använts i flera studier 8-10. Efter idén av att säkerställa fördelningen av lipider mellan detergent / lipid blandade miceller och proteinet / tvättmedel / lipid blandade miceller, kan vi nå nästan fullständig upplösning av KvAP till membran tillverkade av mycket olika lipider. Varje tetramerisk KvAP kanal behöver ~ 100 lipidmolekyler till fullo täcker dess transmembrandomän. Det väsentliga kravet är att tillåta tillräckligt lipidmolekyler …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studierna på KvAP i Jiang labbet har fått betydande hjälp från Dr Roderick MacKinnon laboratorium vid Rockefeller University. Speciella tack går till Dr Kathlynn Brown och Michael McQuire för deras råd och hjälp på våra fag-skärmen experiment. Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH (GM088745 och GM093271 till Q-XJ) och AHA (12IRG9400019 till Q-XJ).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
| Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
| n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
| Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
| Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
| DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
| Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
| NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentane | Fisher | R399-1 | |
| Decane | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
References
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).
- Lee, A. G. How lipids affect the activities of integral membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).
- Anderson, R. G. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67, 199 (1998).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269 (2004).
- Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257 (2003).
- Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. J. Vis. Exp. (20), e1033 (2008).
- Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel. Nat. Commun. 2, 250 (2011).
- Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444, 775 (2006).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, 180 (2003).
- Jiang, Q. X., Gonen, T. The influence of lipids on voltage-gated ion channels. Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884 (2012).
- Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).
- Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso. Eur. J. Biochem. 243, 798 (1997).
- Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal. Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179 (1990).
- Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase. Biophys. J. 72, 2545 (1997).
- Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283 (1992).
- Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane. The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).
- Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).
- Hanke, W., Schlue, W. -. R., Sattelle, D. B. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. Biological Techniques. , 133 (1993).
- Tien, H. T. . Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice. , 655-65 (1974).
- Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution. The Journal of Membrane Biology. 10, 11 (1972).
- Henn, F. A., Thompson, T. E. Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies. Journal of Molecular Biology. 31, 227 (1968).
- Tao, X., MacKinnon, R. Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers. J. Mol. Biol. 382, 24 (2008).
- Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes. The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).
- Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).
- McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands. Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).
- Rigaud, J. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753 (2002).
- Chami, M., et al. Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins. J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).
- Kuhlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of membrane proteins. Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).
- Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65 (2003).
- Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. J. Struct. Biol. 121 (2), 142 (1998).
- Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin. J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).
- Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).
- Iacovache, I., et al. The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife. J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).
