Procedurer for rekonstituering af en prototype spændingsstyret kaliumkanal i lipidmembraner beskrevet. De rekonstituerede kanaler er egnet til biokemiske analyser, elektriske optagelser, ligand screening og elektron krystallografiske studier. Disse metoder kan have generelle anvendelser til de strukturelle og funktionelle studier af andre membranproteiner.
At undersøge lipid-protein-interaktion i en reduktionistisk måde, er det nødvendigt at inkorporere membranproteiner i membraner af veldefineret lipidsammensætning. Vi studerer lipid-afhængige gating effekter i en prototype spændingsstyret kalium (Kv) kanal og har arbejdet detaljerede procedurer at rekonstruere kanalerne i forskellige membran-systemer. Vores rekonstituering procedurer tager hensyn til både vaskemiddel-induceret fusion af vesikler og sammensmeltningen af protein / detergent miceller med lipid / detergent blandede miceller samt betydningen af at nå en ligevægt fordeling af lipider blandt protein / detergent / lipid og detergent / lipid blandede miceller. Vores data antydede, at indsættelsen af kanalerne i lipidvesiklerne er forholdsvis tilfældigt i orienteringer, og rekonstituering effektivitet er så høj, at ingen påviselige protein aggregater blev set i fraktionering eksperimenter. Vi har udnyttet rekonstituered kanaler til at bestemme de konformationelle tilstande af kanalerne i forskellige lipider, registrerer elektriske aktiviteter af et lille antal kanaler er indarbejdet i plane lipiddobbeltlag, skærm til kropsbygning-specifikke ligander fra en fag-viste peptid bibliotek og støtte væksten i 2D krystaller af kanalerne i membranerne. Rekonstitueringen her beskrevne procedurer kan tilpasses til at studere andre membranproteiner i lipiddobbeltlag, især til undersøgelse af lipid effekter på eukaryote spændingsstyrede ionkanaler.
Celler udveksle materialer og information med deres omgivelser gennem funktionerne af specifikke membranproteiner 1.. Membranproteiner i cellemembraner fungerer som pumper, kanaler, receptorer, intramembrane enzymer, linkere og strukturelle støtter tværs membraner. Mutationer, der påvirker membranproteiner har været relateret til mange humane sygdomme. Faktisk har mange membranproteiner været de primære lægemiddelkandidater, fordi de er vigtige og let tilgængelige i cellemembraner. Det er derfor meget vigtigt at forstå strukturen og funktionen af forskellige membranproteiner i membraner, og gøre det muligt at udforme nye metoder til at afhjælpe de skadelige virkninger fra de mutante proteiner i humane sygdomme.
Lipider omgiver alle membranproteiner integreret i dobbeltlag 2, 3. I eukaryote membraner, er de forskellige typer af lipider kendt for at være organiseret i mikrodomæner 4, 5.Mange membranproteiner viste sig at være fordelt blandt disse mikrodomæner samt voluminøse flydende fase af membraner 3, 6. Mekanismen bag organiseringen af mikrodomæner og levering af membranproteiner ind i dem, og den fysiologiske betydning af sådanne distributioner er helt klart vigtigt, men forbliver dårligt forstået. En større tekniske vanskeligheder i at studere lipid effekter på membranproteiner er pålidelig rekonstituering af biokemisk oprensede membranproteiner i membraner af velkontrollerede lipid sammensætning, således at næsten alle rekonstitueres proteiner er funktionelle 7.. I de sidste par år har vi udviklet metoder til at rekonstruere prototype spændingsstyret kaliumkanal fra A. pernix (KvAP) i forskellige membran systemer til strukturelle og funktionelle studier 8-10. Dataene fra andre og os sammen viste, at lipiderne er sandsynligvis en bestemmende faktor i konformationelle ændringer i spænding-sensingdomæner af en spænding ionkanal og kan forme strukturerne af nogle af disse kanaler 11. I den næste, vil vi give en detaljeret beskrivelse af vores metoder og vil tilbyde kritiske tekniske tips, der vil sandsynligvis sikre en vellykket reproduktion af vores resultater samt en udvidelse af vores metoder til studier af andre membranproteiner.
Rekonstituering af KvAP kanaler i forskellige membraner har været anvendt i flere undersøgelser 8-10. Efter ideen om at sikre fordelingen af lipider mellem vaske / lipid blandede miceller og protein / detergent / lipid blandede miceller, er vi i stand til at nå op på næsten fuldstændig opløst KvAP i membraner lavet af meget forskellige lipider. Hver tetramere KvAP kanal behov ~ 100 lipid molekyler til fuldt ud at dække sit transmembrane domæne. Det væsentlige krav er at tillade nok lipidmoleky…
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelserne vedrørende KvAP i Jiang lab har fået betydelig hjælp fra Dr. Roderick MacKinnon laboratorium på Rockefeller University. En særlig tak til Dr. Kathlynn Brown og Michael McQuire for deres råd og hjælp på vores fag-screen eksperimenter. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (GM088745 og GM093271 til Q-XJ) og AHA (12IRG9400019 til Q-XJ).
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
NaCl | Fisher | S271-3 | |
Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
PMSF | SIGMA | P7626 | |
Dnase I | Roche | 13407000 | |
Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
Pentane | Fisher | R399-1 | |
Decane | TCI America | D0011 | |
MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |