Процедуры для полного восстановления прототип напряжения закрытого калиевых каналов в липидных мембран описаны. Восстановленные каналы подходят для биохимических анализов, электрические записи, лиганд скрининга и электронно исследования кристаллографических. Эти методы могут иметь общего применения в структурных и функциональных исследований других мембранных белков.
Для изучения липид-белковых взаимодействий в редукционистский моды, необходимо включить мембранных белков в мембранах четко определенных липидной композиции. Мы изучаем липидов зависит эффект стробирования в прототипе напряжения закрытого калия (кВ) канал и разработали подробные процедуры для восстановления каналов в различных системах мембраны. Наши процедуры восстановления принимать рассмотрение как моющее средство индуцированного слияния пузырьков и слитый белок / детергент мицеллы с липидной / детергент смешанные мицеллы, а также важность достижения равновесного распределения липидов у белка / детергент / липид и моющего средства / липид смешанные мицеллы. Наши данные свидетельствуют о том, что введение каналов в липидных везикул относительно случайной ориентации, а также восстановление эффективность настолько высока, что нет обнаруживаемых совокупностей белка были замечены в фракционирование экспериментов. Мы использовали восстановитьд каналов для определения конформационных состояний каналов в различных липидов записи электрических деятельности небольшим количеством каналов включены в плоских липидных бислоев, экран конформационно-специфических лигандов из пептидных фаговых дисплеев, библиотеку и поддерживать рост кристаллов 2D каналов в мембранах. Восстановление процедуры, описанные здесь, могут быть адаптированы для изучения других мембранных белков в липидных двойных слоев, особенно для исследования липидов действие на эукариотические напряжения закрытого ионных каналов.
Клетки обмена материалами и информацией с окружающей средой через функции специфических белков мембраны 1. Мембранные белки в клеточных мембранах функционировать как насосы, каналы, рецепторы, ферменты внутримембранных, линкеры и структурные сторонников через мембраны. Мутации, которые влияют на мембранные белки были связаны со многими заболеваниями человека. В самом деле, многие мембранные белки были основными целями наркотиков, потому что они важны и легко доступны в клеточных мембранах. Поэтому очень важно понимать структуру и функцию различных мембранных белков в мембранах, и делают возможным разработать новые методы, чтобы облегчить вредных эффектов от мутантных белков в человеческих болезней.
Липиды окружают все мембранные белки интегрированы в 2 бислоя, 3. В эукариотических мембраны, различные типы липидов, как известно, организованных в микродоменов 4, 5.Многие мембранные белки, как было показано, распределяется между этими микродоменов а также громоздкие жидкой фазы мембран 3, 6. Механизм, лежащий организации микродоменов и поставка мембранных белков в них и физиологическое значение таких распределений явно важна, но остаются плохо изученными. Одним из основных технических трудностей в изучении влияния на липидный мембранных белков является надежным восстановления биохимически очищенных мембранных белков в мембраны хорошо контролируемых липидный состав, так что почти все восстановленные белки являются функциональными 7. В последние несколько лет, мы разработали методы для восстановления прототипа напряжения закрытого канала калия из A. Pernix (KvAP) в различные мембранные системы для структурных и функциональных исследований 8-10. Данные от других и нас вместе показали, что липиды, вероятно определителя в конформационные изменения напряжения зондированиядоменами напряжения закрытого ионных каналов и может формировать структуры некоторых из этих каналов 11. В следующем, мы предоставим подробное описание наших методов и предложит важные технические советы, которые, скорее всего, обеспечить успешное воспроизводство наших результатах, а также расширение наших методов в исследованиях других мембранных белков.
Восстановление KvAP каналов в различных мембран был использован в нескольких исследованиях 8-10. Следуя идее обеспечения распределение липидов между моющего средства / смешанные мицеллы липидов и белков / моющее средство / липидного смешанные мицеллы, мы способны достичь почти полн…
The authors have nothing to disclose.
Исследования по KvAP в Цзян лаборатории получили значительную помощь от лаборатории доктора Родерик МакКиннон автора в Университете Рокфеллера. Особая благодарность доктору Kathlynn Браун и Майкл McQuire за их советы и помощь в нашей фага экране экспериментов. Работа выполнена при поддержке грантов от NIH (GM088745 и GM093271 к Q-XJ) и AHA (12IRG9400019 к Q-XJ).
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
NaCl | Fisher | S271-3 | |
Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
PMSF | SIGMA | P7626 | |
Dnase I | Roche | 13407000 | |
Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
Pentane | Fisher | R399-1 | |
Decane | TCI America | D0011 | |
MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |