Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

의 flybar : 파리에 주류 관리

doi: 10.3791/50442 Published: May 18, 2014

Summary

초파리는 알코올에 대한 행동 반응의 세포 및 분자 토대를 해부를위한 중요한 모델 시스템으로 떠오르고있다. 여기에서 우리는 쉽게 다른 실험에 적용 할 수 있고 학부 연구에 매우 적합하다주기 컨텍스트에서 주류 감도 데이터의 수집을위한 프로토콜을 제시한다.

Abstract

초파리 (Drosophila의 melanogaster의)은 알코올 연구 및주기 생물학 모두 설치 한 모델입니다. 최근에는주기 클록 주류 감도 아니지만 관용의 형성을 조절하는 것이 보였다. 여기, 우리는 세부 사항에 우리의 프로토콜을 설명합니다. 알콜의 flybar를 사용 파리에 투여된다. 이 설정에서, 포화 알코올 증기는 설정 비율 가습 공기와 혼합되고, 최대 4 개의 튜브에서 파리에 투여. 파리는 반복 실험 사이의 변화를 최소화하기 위해 표준화 된 조건에서 사육된다. 다른 유전자형이나 치료의 3 일 된 파리는 바람직하게는 직접 비교가 가능하게하는 두 개의 서로 다른 시점 (예를 들어, CT 5, CT 17)의 파리를 일치시켜, 실험에 사용됩니다. 실험 동안, 플라이는 휘어진 (LORR)을 보상하기의 손실을 나타내는 알코올 증기의 미리 결정된 비율 및 해충의 수에 1 시간 동안 노출되거나 나오지 아르ATION은 5 분마다 계산됩니다. 데이터는 세 개의 서로 다른 통계적인 방법을 사용하여 분석 할 수있다. 첫 번째는 파리의 50 %가 자신의 복원력 반사를 잃은하는 시간을 확인하고 유의 한 차이는 시점 사이에 존재 여부를 확인하기 위해 분산 분석 (ANOVA)을 사용하는 것입니다. 두 번째는 ANOVA 분석 한 다음 특정 시간 (분), 후 LORR을 보여 백분율 파리를 결정하는 것입니다. 마지막 방법은 다변량 통계를 사용하여 전체 시간 시리즈를 분석하는 것입니다. 프로토콜은 유전자형 간의 비주기 실험이나 비교에 사용될 수있다.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

초파리 melanogaster의이2,3에 대한 인간의 응답과 유사하다 알코올 1 이상성 행동 반응을 보여줍니다. , 및 진정 작용 (응답 모터 활동의 완전한 부족 : 알코올 농도가 낮은 초기 노출되면, 모터 조정의 부족, 자세 제어의 손실 보상하기 반사 (LORR 바로 잡는 반​​사 손실)로 대체, 전시 증가 운동 활성을 날아 기계적인 자극에) 알코올에 노출이 4-9 진행됨. 내인성주기 클록 생쥐 10,11, 12 래트에서 관찰로서 주류 감도 및 독성의 강한 변조기이고, 13 인간. 초파리 연구의 최근 발전은주기 시계가 급성 알코올 감도 있지만 알코올 내성 1 변조 보여 주었다. 돌연변이 연구와 공간의 유전자 조작을 통해 초파리에서 사용할 수있는 강력한 유전 적 접근 방법시간적 유전자 발현 복잡한 동작을위한 내부 세포 및 분자 메커니즘을 식별 약진을 허용하는 시스템을 제공한다. 조사 도구로 초파리의 사용은 급속히 포유류 14-16로 번역 할 수있는 알코올의 신경 생물학을 이해하는 실질적인 발전을 허용했다. 일 주기성 시계가 주류 감도를 변조 통해 분자 메커니즘의 이해를 용이하게하기 위해 균일주기 ​​시점 걸쳐 행동 반응, 희미한 적색 광 조건에서 사용하기에 적합한 알코올 투여 프로토콜을 측정하기 위해 필요하다. 초파리의 경우, 알코올 만성 노출 또는 안정적으로 급성 노출에 대한 증기의 형태로 알코올을 투여 통해 음식 섭취를 통해 관리 할 수있다. 여기에서, 우리는 상실 바로 잡는 반사 (LORR) 1주기 변조의 평가뿐만 아니라 적합한 알코올 관리 프로토콜을 설명진정.

일정한 온도에서 12 시간의 LD주기 다음 실험 질문에 따라 2 ~ 5 일 제어 빛 정권에 전송 : 파리는 12 시간으로 동반된다. 초파리는 다른 이름으로 flybar 장치 에탄올 증기에 노출된다. 이 장치에서 공기의 제어 양의 물과 알코올을 통해 발포되며, 증기는 유리 병 주택 파리에 혼합과 연결됩니다. 파리 분마다 5는 반사 신경을 보상하기 또는 진정되고있다 표시하지 않습니다 수 득점됩니다. 각 시점에 대한 LORR 비율은주기 시간 지점 사이 또는 파리의 변종 사이의 계산 및 비교됩니다. 행동 분석 옵션과 결합 된의 flybar 알코올 배달을 사용하여 알코올 배달의 단순성과 신뢰성이 어두운 조건에서 실시주기 실험의 중요한 이점을 제공합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

의 flybar 1. 총회

이론적 근거 및 개요 :이 시스템은 파리에 알코올 증기의 제어 비율을 관리 할 수​​ 있도록 설계되었습니다. 참고도 1의 개략적 인 개요를 제공의 flybar가 셋업 세 단계 (기류 조립, 알코올 및 물 병의 ​​셋업 및 관측 튜브의 조립체)에서 후술하는 바와 같이. 즉, 안정적인 공기 흐름이 각각 알코올과 물을 통해 버블을 혼합, 4 관찰 유리 병에 투여되는 두 개의 분획으로 분리된다.

  1. 공기 흐름의 조립
    1. 유연한 실리콘 튜브 건물 공기 또는 Y-커넥터를 사용하여 일관성있는 공기 흐름 및 분할을 생성하는 수족관 통풍 장치 하나에 짧은 조각을 연결합니다. 시스템 (4 관측 바이알위한 통상적 1,000 ml / 분)를 통해 공기의 총량을 제어하는​​ 공기 유동 조절기를 제 1 분기를 연결한다.
    2. 제 2 튜브의 빠른 커넥터를 삽입공기 스트림은 교정 기류 영향을주지 않고 실험의 시작 부분에 중단 될 수 있도록. Y-커넥터를 추가하고 공기 조절기로 각 분기 튜브를 연결합니다.
    3. 공기 조절기에 튜브를 연결하고 두 개의 공기 흐름 미터를 연결합니다.
  2. 알코올과 물 병의 셋업
    1. 공기 흐름 미터의 출구에 유연한 튜브를 추가하고 튜브의 각 길이의 끝 부분에 90 ° 굴곡과 얇은 유리 튜브 (1 ㎖ 유리 피펫의 부분)을 삽입합니다. 이것은 물과 알코올 병에 유입 공기의 흐름이 될 것입니다.
    2. 알코올과 물이 가득 병에 그들을 통해 2 개의 구멍에 고무 마개를 놓습니다. 수욕을 사용하여 주위 온도보다 높은 일정한 온도 36 ° C의 병에서 모두 유지. 물 목욕은 27 ° C.에있는 동안 우리의 실험에서, 환경의 객실은, 25 ° C에서 유지
    3. 의 직선 유리 피펫을 삽입IR은 고무 마개를 통해 입구 및 병의 바닥으로부터 약 1cm까지 유체로 연장된다.
    4. 유리의 단부가 안쪽 마개 병의 바닥에 닿을 때까지 고무 마개에 남아있는 구멍에 유리 피펫의 팔꿈치 부분을 삽입한다. 튜브의 또 다른 길이의이 공기 출구를 넣습니다.
    5. Y-커넥터를 이용하여 공기 스트림을 재결합하고 두 구멍 뚫린 고무 마개를 통해 삽입 구부러진 유리 피펫 부와 비어 혼합 플라스크 또는 병을 통해 공기 흐름을 위해 실리콘 튜브의 다른 길이를 사용한다. 출구 혼합 된 공기 흐름을 위해 실리콘 튜브의 다른 길이를 사용합니다.
  3. 관측 유리 병의 조립
    1. 다 관찰 바이알 각 실험에 사용될 수 있도록 공기의 4 또는 8 작은 스트림을 구하는 혼합 플라스크 2-3X 신흥 출구 기류 분할. 관찰 유리 병에 유연한 실리콘 튜브를 연결합니다.
    2. observati을 설정유리 튜브는 알코올 증기에 대한 입구 및 출구를 제공하는 두 개의 구멍을 통해 함유 고무 마개로 밀봉 빈 바이알을 사용하여 바이알에.
    3. 그물 제 유리관의 단부를 커버하고 유연한 플라스틱 배관의 작은 조각을 사용하는 대신에 세공을 유지한다. 는 유리 병의 절반 정도의 길이로 확장 될 때까지 첫 번째 구멍을 통해이 튜브를 삽입합니다. 필요한 경우, 아늑한 적합을 얻기 위해 테프론 테이프를 사용합니다.
    4. 는 고무 마개의 안쪽 가장자리에 닿을 때까지 그물로 덮여 끝 또한 제 2 유리 튜브를 삽입합니다.
    5. 희미한 붉은 빛 조건에서 파리와 대비를 극대화하기 위해 가로로 흰색 종이 조각에 튜브를 놓습니다.
    6. 공기 흐름의 혼합 적절한 분수는 알코올을 통해 발포 및 공기 흐름은 물을 통해 버블. 연속적으로 공기 압력을 모니터하고 공기 흐름의 원하는 혼합을 유지하기 위해 필요에 따라 조정한다.
      참고 : 연속 실행작은 방에있는 병렬 또는 하나의 분석에서 여러 플라이 바의 분석의 알코올 증기의 눈에 띄는 축적으로 이어질 수 있습니다. 잠재적으로 밀폐 된 방에있는 연구원에 영향을 줄 수있는 알코올 증기의 지속적인 방출을 방지하기 위해 적절한 시스템이 적절하게 실험 기간 동안 생성 된 알코올 증기를 제거하는 장소에 배치해야합니다. 알코올 증기를 제거 각각의 병에서 튀어 나온 두 번째 유리 튜브에 튜브 ~ 12 인치 조각을 연결, 그들을 묶어 깔때기 진공 시스템에 직접하십시오. 연구원은 또한 실험 시험 장소는 통풍이 있는지 확인해야합니다.

실험 동물의 2. 준비

이론적 근거 및 개요 : 일반 문화와 파리의 하우징은 데이터의 변동성을 줄일 수 있습니다. 이는 파리가 경험 한 스트레스의 표준화 및 최소화를 통해 달성된다. 그 이유를 들어, 마취 (CO 2 또는 대안) 두리를 사용하지 않습니다NG 프로토콜의 다음 단계 중 하나. 또한, 파리는 학습과 기억 실험 17 등 다른 행동 분석을위한 표준으로 변동성을 최소화하기 위해 실험과 시점에 걸쳐 연령을해야한다.

다른 빛 : 어두운 에탄올에 대한 행동 반응주기 시계의 기능을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 낮의 리듬이 있는지 확인하기 위해, 실험은 특정 Zeitgeber 타임즈 (ZT)에서의 성능을 측정하기 위해 정의 된 LD 사이클 하에서 수행 될 수있다. ZT 12 시간 조명이 12시 12분 시간의 LD 사이클의 전원이 꺼져있는 동안 ZT 0, 새벽을 나타내며 LD 사이클에서의 빛의 시간으로 정의된다. 일정 조건 하에서, 시간주기의 시간 (CT)는 환경 신호, 자유 실행 시간의 부재하에 동물에 대한 시간을 측정하고, 이전의 LD 인입 사이클에 관한 것이다. 야생형 초파리에서 CT는 처음 몇 일에 대해 이전 ZT을 반영일정한 프리 런주기 기간 등의 조건과 리듬에들 ~ 24 시간이다. 어두운주기를 한 후 이전의 실험에 지속적으로 어두운 (DD)로 전송 :주기 변조를 측정하고 행동에 급성 조명 효과를 제거하기 위해, 파리는 빛에 동반된다. 주기 실험은 특정 시간주기 시간 (CT)에서 성능을 측정하는 DD의 두 번째 날에 수행됩니다.

초파리에서 연속 빛 (LL) 조건은 핵심주기 유전자와 불규칙한 운동 활성 18-21과 부정맥 단기 기억 (17)에 의해 입증되는 것과 같이 행동주기 리듬의 혼란의 댐핑 또는 폐지 분자 진동과주기 장애의 원인. 프로토콜은 시간주기의 연구에 대해 최적화되어 있고, 다른 실험을 위해 단순화 될 수있다. 튜브 12 인치 사용하는 작은 빨간 불빛, 모든주기 실험은 희미한 붉은 빛 (주위의 오버 헤드 붉은 빛 <벤치 위에 1 룩스를 사용하여 실시하고 있습니다~ 1 룩스의 빛).

  1. 12시 12분 시간 조명 아래 25 ° C에서 후면 파리 : 어두운 유입 조건 (LD).
  2. 1 일의 일 라이트 기간 말에 갓 eclosed 파리를 수집하고 음식의 끈적 거림을 최소화하기 위해 높은 한천 농도 적은 양의 음식을 포함하는 작은 유리 병을 들고 LD 조건에서 24 시간 동안 저장합니다. 참고 : 건강, 일반적으로 개발 파리가 수집되도록하려면 우화는 문화 병에서 시작 후 첫 번째 일 이내에 수집 된 파리를 사용합니다.
  3. 약 30 (25 ~ 35)의 일괄 처리를 수집 점등 기간의 끝으로 2 일에 흡인기, 신선한 유지 병에 송금을 사용하여 날아갑니다.
  4. 유리 병의 끝으로 파리를 직접 강한 광원을 사용합니다. 행동 관찰은 각 실험의 끝에서 계산 파리의 총 수의 백분율로보고로이 범위 내에서 각 유리 병에 파리의 정확한 수는 중요하지 않다.
  5. 25 ° C에서 FO​​에서 DD 조건에서 파리를 유지이일 R.
  6. 실험의 날, 다른 조건이나 실험 전에 적어도 1 시간 동안 방에있는 실험적인 행동 룸 이외의 인큐베이터에 보관되어있는 모든 파리를 놓습니다. 순응 때문에 온도 나 습도의 변화에​​ 변화를 줄일 수 있습니다.
  7. 행동의주기 변조 여부를 테스트하기 위해 여섯 시간 지점 일 (CT 1, 5, 9, 13, 17, 21)에서 관찰합니다.
  8. 실험 설계의 견고성을 향상시키고 하나의 실험에 변화의 특정을 최소화하기위한 행동 실험의 한 세트에서 여러 시간 지점을 비교합니다. 반대의 명암 일정 두 개의 창업 보육 센터가 유입에 사용하는 경우 예를 들어, CT 1 CT (13)의 관찰을 동시에 얻을 수있다.
    주 : 상기 절차가 일정 어둠주기 상태에서 수행 분석을위한 실험 동물의 준비를 설명한다. 다른 빛 : 암 조건은 시계의 기능을 조사하는 데 사용될 수있다알코올에 대한 행동 반응에. 낮의 리듬이 실험은 특정 Zeitgeber 시간 (ZT)에서 성능을 측정하는 LD 사이클에서 수행 할 수 있는지 확인하십시오. 또한, 프로토콜은 실험 테스트주기 부전 일정한 조명 조건 하에서 발생하는 해충으로 사용될 수있다. 조명 상태에서 보관 파리를 테스트 다른 프로토콜의 행동 분석은 여전히​​ 어두운 조건에서 수행되어야한다. 파리 인해 행동에 빛의 급성 효과를 행동의 변화를 최소화하기 위해 실험 전에 1 시간 동안 어둠에 전송해야합니다.

3. 행동 관찰

이론적 근거 및 개요는 다음 알코올 관리 프로토콜은 희미한 붉은 빛 조건 하에서 관찰에 최적화되어 있습니다. 두 가지 행동을 측정 LORR 및 진정 작용 플라이 만취의 두 가지 점을 나타냅니다. LORR는 손실 O를 통합 만취의 늦은 지점을 나타냅니다F 모터 및 자세 제어, 중독의 진정 대책 반면 늦게 종점. 유전자형 또는주기 변조는 다르게이 두 조치에 영향을 미칠 수 있습니다; 따라서 하나는 모두를 검사 할 수 있습니다. 즉, 플라이가 바이알에로드되어, LORR 또는 진정을 표시 파리의 개수가 주류 기상 노광시 5 분마다, 그리고 실험의 끝에 카운트 파리의 총 수를 획득한다.

  1. 실험을 시작하기 전에 적어도 10 분 동안 시스템 (공기, 물과 알코올 병을 통해 발포)를 통해 공기를 실행하고 기류를 보정하는 시간을 사용한다.
  2. 공기 흐름을 중지하려면 빠른 릴리스를 분리합니다. 유리 병에 파리를로드하고 공기 흐름을 다시 연결하고 타이머를 시작합니다. 참고 : 응답 파리 또는 죽은 파리가 유지 유리 병에 남아있는 경우,이 스트레스 조건을 나타낼 수 있습니다. 일반적으로, 이러한 조건은 지주 바이알에 닫기 파리를 수용하거나 소를 사용하여 식품 찰기를 감소시킴으로써 완화 될 수있다음식 준비하는 동안 LY 높은 한천 농도. 최적의 행동 분석과 실험 사이에 최소한의 변화를 들어, 파리는 이전의 실험에 건강해야한다.
  3. 유지하는 정확한 시간, 알코올 노출의 총 시간을 추적하는 하나의 타이머를 사용하여 5 분 간격을 표시하기 위해 두 번째 카운트 다시 타이머를 사용합니다.
  4. 명암 대비가 증가하고 가시성을 비행, 특히 희미한 붉은 빛의 조건에 유리 병 아래에 흰색 종이를 놓습니다.
  5. 일정한 수준을 유지하기 위해 실험 기간 동안 정기적으로 공기 흐름을 확인합니다. 기류가 안정화되면 일반적으로, 이들은 실험의 길이 동안 안정적으로 유지.
  6. 1 시간 동안 5 분마다 한 번 자신의 복원력 반사를 잃은 파리의 수를 계산합니다. 주류 감도 유전자형 및 유전 배경 사이에서 변화로서, 더 자주 평가를 수행하거나 긴 시간에 대한 실험을 수행하는 것이 바람직 할 수있다.
  7. 유리 병 slightl를 들어 올려표면에서 y 및 유리 병 뒤에 종이를 향해 붉은 빛 손전등의 빛을 연출합니다. 희미한 붉은 빛의 조건에서 모든 실험을 위해 1 룩스보다 더 큰 빛 수준을 유지하기 위해 실험 유리 병에 최소 12 인치의 거리에서 핸드 헬드 빨간색 손전등을 유지합니다.
  8. 모든 실험에 대한 표준을 설정하기 위해 노출계를 사용하여 가벼운 수준을 측정합니다.
  9. 유리 병에 회사 탭을 적용하여 자신의 복원력 반사 손실 약 4 초 이내에 스스로를 잘하지 얼마나 많은 파리 계산 한 파리의 수를 결정합니다. LORR을 표시 파리는 여전히 자신의 다리와 날개를 이동할 수 있지만, 똑바로 자신을 켤 수 없습니다.
  10. 세션의 끝에, 각 바이알에있는 파리의 총 수를 센다.
    참고 : 경우에 따라 하나의 플라이로드는 실험 유리 병에 파리 스토퍼와 측면 사이에 잡힐 수 있습니다. 이는 어둠 속에서 수행되기 때문에, 그것은 쉽게 그래서 총 마비를 계산 할 필요가 발견되지 않을 수 있습니다올바르게 백분율을 계산하는 실험의 끝에 파리의 ER.

또한이 절차는 또한 다른 행동 끝점을 나타내는 파리의 진정 작용을 측정하기 위해 사용될 수있다. 진정 파리가 바로 반사를 잃은 반면, 진정 작용이 큰 알코올 노출이 필요합니다. 행동으로, 진정 작용은 파리가 유리 병에 AA 회사 탭 다음 유리 병에 움직 남아있는 명백한 모터 활동의 완전한 부족에 의해 특징 지어 질 수있다. 진정 작용의 경우, 움직임이 더 다리가 유리 병의 회사 탭의 다음 배달을 흔들며 없습니다로 남아 파리의 수를 계산합니다. 또한, 유리 병은 개별 파리는 여전히 잡는 반​​사를 유지할지 여부를 결정하기 위해 좌우로 압연 할 수 있습니다.

4. 데이터 분석

  1. 각각의 병에 파리의 총 수에 따라 평가마다의 비율 LORR를 결정합니다.
  2. calculati하여주기 시점 또는 균주 사이의 견적의 차이S 자 곡선의 직선 부분에 속하는 각각의 샘플에 대한 50 %의 LORR을, (아래 그림 2 참조) 겨.
  3. 다른 통계 :
    1. 유전자형 사이의 비교가 예정되어있는 경우,이 차이는 (도 3) 사후 검사 현저한 것을 시점의 범위를 결정하기 위하여 반복 측정 ANOVAand를 사용하여 전체의 시간 과정을 분석하는 것이 바람직하다. 이 시험을 위해, 우리는 0.001의 값을 사용하는 것을 선호한다. 이것은 개개의 노광 시간에 차이가 곡선의 기울기의 유전자형의 차이뿐만 아니라, 평가 될 수있다.
    2. 감도의 차이는 그래프의 직선 부분 (그림 4)에서 진정 작용과 같은 특정 반응 알코올 노출의 특정 시간에 결정될 수있다.
    3. 균주 또는주기 시점 간의 차이는 표준 F-통계 및 사후 시험을 이용하여 추정 될 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

마커로 50 % LORR를 사용하여 알코올 감도의주기 변조.

하루 동안 주류 감도주기 변조를 보여주는 대표적인 예는도 2에 제시된다. LORR는 캔톤-S의 DD의 2 하루 동안 여섯 시점에서 측정 한 50 % LORR은 각 시점에 대해 결정 하였다. (: F 5,45 = 7.39, P <0.001, N = 6 ~ 10 시간마다 포인트 ANOVA) 분석은 하루 중 상당한 시간을 효과를 보여 주었다. 피셔의 LSD 테스트 CT 21 대 CT13, CT17 대 CT9 및 CT9 대 CT 21, CT9 대 CT17, CT5 대 CT13, CT5 대 CT5, CT5 대 CT1 사이에 유의 한 차이를 보였다.이 결과는 일치 우리의 이전에 발행 된 결과를 1.

야생 형 및 돌연변이 체의 차이점.

두 번째 예는 LORR의 차이 야생형 광저우-S 파리와 FLI 사이에 진정을 보여 시계열을 사용하여같은 유전 적 배경 (1118 원) 기능 상실 흰색 돌연변이 (그림 3)을 들고 에스. 유전자 변형 라인이 종종 W 1118 돌연변이가이 파리와 일주기 시계 유전자에 대한 많은 돌연변이 라인을 사용하여 만들어집니다로 W 1118 돌연변이 초파리 연구에 특별한 관심입니다. 결과는 전체 노출 기간 동안 매 5 분 동안 같이 데이터를 시계열 (그림 3)으로 표시하고 있습니다. 관찰은 빠른 내성 축적 22-24의 효과를 방지하기 위해 60 분으로 제한됩니다. W 1118 돌연변이는 현저하게 감소 LORR의 (과목 F 1,10 사이 ANOVA = 57.12, P <0.001, N = 6) 광저우-S보다 에탄올 증기에 대한 응답 감도를 표시합니다. 의미의 차이 (= 0.001) 60 분 (그림 3A를 통해 20 분에서이 실험에서 발견되었다 1118 광저우-S (W) 사이의 차이는 (과목 F 1,10 = 137.301, P <0.001 사이 ANOVA N = 6) 진정 작용의 비율에서 발견되었다. 진정 작용의 분석에서 유의 한 차이 (= 0.001) 분 (50), (55)에서 발견되었고, 60 (그림 3B). 그들의 눈에서 선별 안료의 부족뿐만 아니라, w 1118 돌연변이는 세로토닌, 도파민과 히스타민 25,26의 수준을 감소시켰다. 생체 아민 수준의 이러한 변화는 W 1118 돌연변이 27,28 에탄올에 변경된 감도를 차지하고있다. 따라서, 정량 유전자형 흰색 발현 수준을 제어하는 단계 에탄올 감도의 정확한 평가에 필수적 일 수있다.

진정 작용의주기 변조.

세 번째 예제에서, 우리는 광저우-S의 비율이 진정 파리 측정진정 작용에 대한 알코올의 효과주기 (그림 4)이 있는지 여부를 확인하려면 시간이 지나면 D. 우리는 CT 5, 17에서 40 분 (30 % 알코올 증기)에 진정 파리의 비율을 비교하고 그 결과가 상당히 적은 진정 파리는 밤 동안 알코올 노출에 비해 하루 동안입니다 (ANOVA 것을 보여줍니다 : F 1,20 = 6.21, P = 0.022, N = 10 (CT5) & 12 (CT17)). 관측이 직접적인 비교를 가능하게하기 위해 우리의 표준 LORR 조건에서 만들어진대로 파리는 시간 이내에 50 %의 진정 점수에 도달하지 않았다. 시간을 넘어 관찰 급속한 허용 22-24의 상승에 문제가 있습니다. 이 실험에서는, 시간주기의 시점에서 어느 파리의 25 % 미만은 이들 군간 전연 진정 감도의 차이가있는 것을 나타내는, 40 분으로 마취시켰다. 진정 작용이 초기 시점에서 데이터를 수집하는 것은 유용한 indicat입니다차이가 존재한다는 이온 그러나 진정 응답의 분포의 형상에 치료의 효과를 결정하는 능력이 제한적이다. 전체 진정 분포에 차이가 있는지를 결정하기 위해, 높은 에탄올 농도는 진정 작용의 빠른 속도를 보장하기 위해 사용되어야한다.

그림 1
그림 1. 과일 파리에서 알코올 감도 및 진정 작용을 측정하기는 flybar.

그림 2
.. 그림 2 일 동안 알코올 감도에 상당한주기 변조를 보여주는 대표적인 예 (ANOVA : F 5,45 = 7.39, p <0.001, N = 6 ~ 10 시간 포인트 당; CT1 대 CT5, CT13, CT17, & CT21와 CT9 CT13 대, CT17, & CT21) 사이에 유의 한 차이.

그림 3
행동 반응에 대한 알코올의 그림 3. 효과는 야생형 캔톤-S가 날아와 비교 LORR에 의해 측정 기능 상실 흰색 1,118 돌연변이 체는.) 광저우-S 파리 알코올 크게 증가 감도를 보여 유의 한 차이입니다 흰색 돌연변이 들고 같은 유전 적 배경 (F 1,10 = 57.12 주제 사이 ANOVA를, P <0.001, N = 6). B) 광저우-S 파리 과목 사이에 1118 돌연변이 (ANOVA W보다 알코올의 진정 작용에 더 취약으로 운항하는 항공사 F 1,10 = 137.301, P <0.001, N = 6). *p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.

그림 4
. 그림 4 캔턴-S의 비율을 비교하는 대표적인 데이터는 CT (5) 및 CT (17) 사이에 40 분에서 진정 파리가 야생 형 파리가 CT 5 (ANOVA에 비해 CT 17에서 초기 진정 작용에서 유의하게 증가 보여줍니다. F 1,20 =을 6.21, P = 0.022, N = 10 (CT5) & 12 (CT17)).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

알코올 남용과 사회에 대한 알코올 중독의 비용은 모두 29 인간과 경제적 비용의 측면에서 엄청난 (30, 31). 초파리 모델로 신속하게 개인의 많은 수의 행동 반응을 조사하는 빠르고 다양한 시스템을 제공하고 같은 광범위 알코올 5,7,32-34 및주기 연구 35-37에 모두 사용하고있다.

여기, 우리는주기 조건에서 성인 파리에 알코올 증기의 제어 관리를위한 간단한 프로토콜을 설명했다.

표준화 된 조건에서 재배 파리는 자신의 복원력 반사를 잃은 파리의 수를 5 분마다 득점하는 동안 1 시간 동안 알코올 증기에 노출되어 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜로 인해 일정 조건에서 유입 및 주택에 대한 추가 요구 사항의주기 실험에 최적화되어 있습니다. 여러 단계를 간소화 할 수 있습니다이러한 적어도 하루 또는 어두운 붉은 빛의 조건 하에서 실험을 수행하는 어둠의 저장과주기 실험에 필수적인 이러한 단계를 제거하여 일반적인 연구를위한 ED. 이 프로토콜은 이후의 생화학 적 또는 분자 분석을위한 다양한 알코올 농도에 제어 방식으로 파리의 다수를 노출 할 수 있습니다. 이러한 학습과 기억의 관찰, 희미한 붉은 빛의 조건에서 행동 반응의 측정과 같은 다른 초파리의 행동 실험와의 일관성을 위해도 비주기 실험을 위해 바람직 할 수있다.

실험의 독립적 인 반복 실험 사이의 변화는 돌연변이 나 유전자 변형 사이 또는주기 시간 지점 사이의 작은 차이를 모호하게 할 수 있습니다. '복제'제거하기 위해 임의의 변수로 추가 할 수 있도록 따라서 동시에 여러 변종 또는주기 시간 지점의 시료 (우리의 예를 참조)에 추천복제본 사이의 변화의 효과.

알코올에 대한 민감도는 변종 사이에 다릅니다. 주류 백분율 (주류 통해 버블 링 기류의 비율)은 그에 따라 조정될 필요가있다. 도 3에 도시 된 바와 같이, 야생형 캔톤-S가 날아간보다 주류 노출의 영향에 덜 민감하다 흰색 돌연변이를 운반 날아간다. 흰색 돌연변이를 운반 라인들의 분석을 위해, 신속한 내성이 발생할 수 주류 더 긴 노출으로 다른 실험의 동일한 시간 프레임에서 행동 적 분석을 수행하도록 날아가 노출되는 알콜의 비율이 증가하는 것이 바람직 할 수있다 개발. 매우 민감한 돌연변이 및 그런 노란색 유전자에 돌연변이를 함유하는 해충에 대해 관찰로 사용 알코올의 비율을 감소시킬 필요가되는 실험에, 기류는 정확하게 주류 포화 기류를 보정하도록 증가 될 필요가있다. 작은 증가가 또는전체 공기 흐름을 reases (± 10 %) (가능한 공기 흐름의 범위는 900-1,100에서 4 관찰 유리 병에 대한 ㎖ / 분)에 부정적인 파리에 영향을 미칠 것 같지 않습니다.

가능하면 1 시간 이상 관찰하기 때문에 알코올 감도에 영향을 미치는 파리 22 ~ 24의 빠른 내성 상승의 잠재력을 피해야한다. 대신, 30 ~ 40 분으로 약 50 %의 LORR 결과 각 변형에 대한 알코올의 비율을 결정합니다. 여러 개의 독립적 인 긴장의 비교가 필요한 경우, 모든 균주에 대해 작동 알코올의 하나의 비율을 선택합니다.

이 프로토콜은 행동 관찰에 크게 의존하므로 표준화 된 프로토콜에 대한 엄격한 준수는 시간이 지남에 따라 행동 관찰에서 드리프트를 방지하는 것이 필수적입니다. 가능하면 관찰자 유전자형 또는 시간 포인트가 테스트되고 맹인되도록, 행동 관찰은 수행되어야한다. 이러한 미지의 다른 요인에 근거 전위 바이어스를 검출하기 위해,그것은 시간 코스의 데이터를 검사하고 관찰 실험 시리즈 전체에 동일한 범위 내에서 남아 있는지 확인하는 것이 좋습니다.

으로 flybar 셋업 특히 학부의 연구자 또는 에탄올의 부정적인 영향에 대한주기 연구에, 파리에 대한 알코올 관리의 다른 방법을 통해 어떤 이점을 제공한다. 파리에서의 모터 제어에 주류의 효과를 측정하기위한 대체 장치가 inebriometer이다 에탄올 증기는 상승 배플 및 자세 제어 또는 플라이의 감도의 손실을 통해 순환되는 수직 열에 걸리는 시간을 측정함으로써 측정 할 수있다 열 (38, 39)의 바닥에 떨어. inebriometer은 상실 자세 제어 자동 판독을 제공하고, 초파리 9,22,39,40 알코올 연구에 대한 가치 입증되었습니다 만,이 행동 패러다임은 상대적으로 고가의 장비, 장치를위한 공간, 그리고 교정 할 시간이 필요합니다조건을 최적화 할 수 있습니다. 따라서, inebriometer은 제한된 예산이나 공간이 많은 학부 교육 실험실, 또는주기 분석을 수행하는 연구자에 적합하지 않을 수 있습니다. 파리에 주류를 전달 및 진정 작용을 측정하는 또 다른 방법은 상부 또는 유리 병의 바닥에 하나 흡수재에 액체 소량의 알코올을 배치하고 주류 시간 41,42으로 증발 할 수 있도록 포함된다. 시간에 따라 알코올 증기의 농도가 증가로서 행동 반응을 평가할 수있다. 이 배송 방법은 셋업하기 쉬운 반면, 파리가 노출되는 알코올 증기의 양이 시간과 조건에 따라 달라집니다. 다름은주기 변조 등의 감도 또는 진정 작용의 초기 속도에 평가되는 실험 질문, 그것은 파리에 전달 알코올 증기의 일정한 수준을 가지고하는 것이 바람직하다. 또한, 알코올, 노광의 일정 금액에 파리의 많은 수의 노출전자,의 flybar 수행으로, 하류 세포 또는 생화학 적 분석의 정확한 성능을 위해 바람직하다. 초기 초파리 주류 연구에서 공통 파리에 주류를 전달하는 또 다른 방법은 제조되었을 때 식품에 주류를 혼합 한 개인. 이 방법은 간단하고 작은 세트 업을해야하지만, 그것은 시간에 알코올 변화의 농도가 일을 통해 만성 알콜 노출에 가장 적합하다.

더 정교하고 자동화 된 방법은 영상 활동 기록 및 이미지 분석 소프트웨어 7,43 등의 알코올 노출로 파리의 전위의 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 에탄올의 양, 하이퍼 활성화 효과를 평가하기위한, 특히 강력하다. 그러나 이러한 자동화 된 방법은 학부 연구 프로젝트 나 교육 실험실 비싸다 할 수 있으며, 최적주기 조건에서 비행의 많은 수의 분석을 위해 설계되지 않을 수 있습니다tions (예를 들어, 어두운 조건에서 비디오 캡처가 균형을 필요로하며, 적외선 조명 및 적외선에 민감한 카메라를 확산). 우리의 flybar 알코올 전달 시스템 및 조건 및 실험실의 다양한 디자인에 매우 적합하다 알코올 행동 반응의 평가를위한 설정을 위하여, 비용 효율적인 방법 쉬운을 제공한다고 생각합니다.

PROTOCOL 수정 :

상기 프로토콜은 상실 보상하기 리플렉스주기 컨텍스트에 주류 노출의 효과를 검사 대상으로한다. 그러나, 프로토콜은 쉽게 주류 실험의 다른 유형을 수용하도록 변형 될 수있다.

12 시간 - 12 시간 명암에 따라 알코올에 대한 반응 검사 (LD를, Zeitgeber 시간) 조건 : 12 시간에서 파리를 유지 : 12 시간의 LD주기를 실험까지. 빛 단계 (ZT 1, 5에 실시 실험 전에 어두운 약 1 시간에 파리로 이동및 9)의 일. 이는 빛의 급성 효과 결과를 교란되지 않도록한다.

자신의 일주기 시계 18 ~ 21과 알코올 노출 1 부정맥 응답의 중단에 일정한 조명 조건의 결과에 따라 배양 파리 : 일정한 조명 조건에서 알코올에 대한 반응을 조사. 초파리는 LD 또는 DD 조건에서 유지 파리와 동일한 조건 하에서 시험되도록 파리는 실험 전에 어두운 약 1 시간에 전송 될 수있다.

진정 작용 : 파리가 LORR 날아 동안 여전히 자신의 날개, 머리와 다리를 움직일 것, 유리 병의 바닥에 움직 남아 있기 때문에 진정되는 파리는 LORR에서 분리 될 수는 파리. 유리 병이 방해 될 때 전시 LORR은 여전히​​ 미묘한 움직임에 반응한다는 파리. 파리의 진정 작용은 회사 후 파리 남아있는 움직임의 수를 계산 TA에 의해 결정된다유리 병에 피. 또한, 유리 병의 말기 개별 파리는 여전히 자신 잡는 휘어진을 유지하는지 여부를 결정하는데 사용될 수있다.

복구 : 행동 분석이 주류 응답의 추가적인 파라미터로서 회수를 측정함으로써 확장 될 수있다. 알코올 노출을 중단하고 LORR마다 5 분에 대한 관찰을 계속 만들고있다. 회복 기간 동안 튜브를 통해 가습 된 공기의 유동을 계속한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

이 연구를위한 자금 조달은 플로리다 주립 대학 의과 대학 및 FSU의 생물 과학부의 지원에서 신경 과학 상에 프로그램에 의해 제공되었다. 추가 자금은 보조금의 에이드 알코올 음료 제조 업체의 연구 기금에 의해 제공되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol 190 proof Various
Aerator Local pet store We use Whisper 60
Silicone tubing 1/8” VWR 408060-0030
120° Y-connector VWR 82017-256
Quick disconnects VWR 46600-048
Plastic tube clamps Bell-art products 132250000 Either this or next
Miniature air regulator McMaster-Carr 8727K11 Either this or previous
Miniature air regulator mounting bracket McMaster-Carr 9891K66
Gilmont size 12 flow meter VWR 29895-242
Tool clips McMaster-Carr 1722A43 To hold flow meters
Vial VWR 89092-722
Rubber stopper with two holes VWR 59585-186 Fits in vials
5 mm Pyrex glass tubes Trikinetics PGT5x65 Fits best in previous stopper
Teflon tape Hardware store To achieve snug fit in stoppers if necessary
Rubber stopper with two holes VWR 59582-122 Fits our bottles
Disposable glass pipets VWR 53283-768 Cut to length and bend by heating
Very fine nylon netting VWR Various
15 watt bulbs Hardware store Overhead red light
Photographic red safe light filters Overhead red light
Mini flashlights with red filters Mag-light

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
  2. Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
  3. Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
  4. Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
  5. Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
  6. Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
  7. Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
  8. Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
  9. Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
  10. Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
  11. Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
  12. Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
  13. Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
  14. Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12, (1), 87-97 (2012).
  15. Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
  16. Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
  17. Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
  18. Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
  19. Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
  20. Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
  21. Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
  22. Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
  23. Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
  24. Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
  25. Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
  26. Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
  27. Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
  28. Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
  29. Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. Deaths: Final data for 2007. U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention: National Center for Health Statistics. (2010).
  30. The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. Columbia University. (2009).
  31. NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. Available from: www.medtext.com/hdcn.htm (1992).
  32. Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
  33. Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
  34. Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
  35. Boothroyd, C. E., Young, M. W. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. Pfaff, D. W., Kieffer, B. 1129, Blackwell Publishing. 350-357 (2008).
  36. Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
  37. Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
  38. Cohan, F. M., Graf, J. -D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. 278-293 (1985).
  39. Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
  40. Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
  41. Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. (2013).
  42. Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
  43. Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).
의 flybar : 파리에 주류 관리
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Linde, K., Fumagalli, E., Roman, G., Lyons, L. C. The FlyBar: Administering Alcohol to Flies. J. Vis. Exp. (87), e50442, doi:10.3791/50442 (2014).More

van der Linde, K., Fumagalli, E., Roman, G., Lyons, L. C. The FlyBar: Administering Alcohol to Flies. J. Vis. Exp. (87), e50442, doi:10.3791/50442 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter