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Neuroscience

Paddelstange: Verwaltung Alkohol zu Flies

doi: 10.3791/50442 Published: May 18, 2014

Summary

Drosophila ist als bedeutsamer Modellsystem zum Zerlegen der zellulären und molekularen Grundlagen von Verhaltensreaktionen auf Alkohol entstanden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Sammlung von Alkohol Empfindlichkeit von Daten in einem zirkadianen Kontext, die leicht auf andere Experimente angewendet werden kann und ist für Bachelor-Forschung gut geeignet.

Abstract

Fruchtfliegen (Drosophila melanogaster) sind ein etabliertes Modell sowohl für Alkoholforschung und circadianen Biologie. Kürzlich haben wir gezeigt, dass die innere Uhr moduliert Alkoholempfindlichkeit, aber nicht die Bildung von Toleranz. Hier beschreiben wir unser Protokoll im Detail. Alkohol wird den Fliegen mit dem Paddelstange verabreicht. Bei diesem Aufbau wird gesättigten Alkohol mit Dampf befeuchtete Luft in der Serie Verhältnissen gemischt, und die Fliegen in vier Röhrchen gleichzeitig verabreicht werden. Fliegen sind unter standardisierten Bedingungen, um die Abweichung zwischen den Replikaten minimieren aufgezogen. Drei Tage alte Fliegen der verschiedenen Genotypen oder Behandlungen werden für die Experimente bevorzugt durch Anpassen entfernt von zwei verschiedenen Zeitpunkten (z. B. CT 5 und CT 17) direkte Vergleiche möglich eingesetzt. Während des Versuchs werden entfernt für 1 h in den vorbestimmten Prozentsatz der Alkoholdampf und der Anzahl von Fliegen, die den Verlust des Stellreflexes (LORR) aufweisen ausgesetzt oder Sedation werden alle 5 min gezählt. Die Daten können unter Verwendung von drei verschiedenen statistischen Methoden analysiert werden. Die erste ist die Zeit, bei der 50% der Fliegen ihre Aufrichtungsreflexes verloren bestimmen und eine Analyse der Varianz (ANOVA), um festzustellen, ob wesentliche Unterschiede zwischen den Zeitpunkten vorhanden sein. Die zweite ist die Prozent Fliegen, die LORR zeigen nach einer bestimmten Anzahl von Minuten, gefolgt von einer ANOVA-Analyse zu bestimmen. Die letzte Methode ist, um die gesamte Zeitreihe mit multivariaten Statistiken zu analysieren. Das Protokoll kann auch für Nicht-circadianen Experimente oder Vergleiche zwischen Genotypen verwendet werden.

Introduction

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Drosophila melanogaster zeigen zweiphasige Verhaltensreaktionen auf Alkohol ein, die analog zu menschlichen Reaktionen auf dieses Medikament 2,3 sind. Bei der ersten Exposition gegenüber niedrigen Konzentrationen von Alkohol, fliegt eine erhöhte Bewegungsaktivität, durch einen Mangel an Bewegungskoordination, den Verlust der Haltungskontrolle und Stellreflexe (Verlust des Stellreflexes: LORR) ersetzt, und Sedierung (vollständige Fehlen der motorischen Aktivität in Reaktion auf mechanische Stimulation) die Exposition gegenüber Alkohol fort 4-9. Die endogenen circadianen Uhr ist ein starker Modulator von Alkohol Empfindlichkeit und Toxizität in Mäusen 10,11, 12 Ratten beobachtet, und Menschen 13. Jüngste Fortschritte in der Drosophila-Forschung haben gezeigt, die innere Uhr moduliert akuten Alkoholempfindlichkeit, aber nicht ein Alkoholtoleranz. Die leistungsfähigen genetischen Ansätzen in Drosophila-Mutanten verfügbar durch Studien und transgenen Manipulationen der Raumund zeitliche Genexpression ein System, das eine schnelle Fortschritte bei der Identifizierung der zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen für komplexe Verhalten ermöglicht. Die Verwendung von Drosophila als Untersuchungswerkzeug hat inhaltliche Fortschritte im Verständnis der Neurobiologie Alkohol, die schnell zu den Säugetieren 14-16 übersetzt werden kann, erlaubt. Um das Verständnis der molekularen Mechanismen, durch die der circadianen Uhr moduliert Alkohol Empfindlichkeit zu erleichtern und Verhaltensreaktionen über zirkadianen Zeitpunkten, eine Alkoholverwaltung Protokoll für den Einsatz bei schlechten Lichtverhältnissen rot gleichmäßig zu messen ist nicht erforderlich. Für Drosophila kann Alkohol durch Nahrungsergänzung für die chronische Exposition oder zuverlässig durch die Verwaltung Alkohol in Form von Dampf für die akute Exposition verabreicht werden. Hier ein Alkoholverwaltung Protokoll für die Beurteilung der Modulation der zirkadianen Loss-of-Stellreflex (LORR) 1 als auch beschreiben wirSedierung.

12-Stunden-LD-Zyklen bei konstanter Temperatur und dann auf eine gesteuerte Lichtregelung für 2-5 Tage, je nach Versuchs Frage übertragen: Fliegen sind mit 12 Stunden mitgenommen. Fliegen sind zu Ethanol Dampf in einem Gerät wie der Paddelstange bekannte ausgesetzt. In dieser Vorrichtung werden gesteuerte Mengen von Luft durch Wasser und Alkohol blasen; die Dämpfe werden dann gemischt und in eine Ampulle Gehäuse die Fliegen gerichtet. Alle 5 min die Fliegen für die Nummer, die angezeigt werden Stellreflexe oder haben sich nicht sediert erzielt. LORR Prozentsätze für jeden Zeitpunkt berechnet werden und unter zirkadianen Zeitpunkten oder zwischen Stämmen verglichen entfernt. Die Einfachheit und Zuverlässigkeit der Lieferung Alkohol mit der Paddelstange Alkohol Lieferung kombiniert mit Verhaltensanalyse-Optionen bietet einen bedeutenden Vorteil für circadiane Experimente unter dunklen Bedingungen durchgeführt.

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Protocol

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1. Versammlung der Paddelstange

Begründung und Übersicht: Das System ist so konzipiert, gesteuert Prozentsätze der Alkoholdampf, um Fliegen zu verwalten. Hinweis: Abbildung 1 zeigt eine schematische Übersicht über die Paddelstange Set-up, wie unten in drei Stufen (Montage des Luftstroms, Set-up des Alkohol-und Wasserflaschen, und die Montage der Beobachtung Fläschchen) beschrieben. Kurz gesagt, ist ein stetiger Luftstrom in zwei Fraktionen, die durch Alkohol und Wasser sprudelte werden jeweils gemischt und auf 4 Beobachtungs Fläschchen verabreicht aufgeteilt.

  1. Versammlung der Airflow
    1. Schließen Sie ein kurzes Stück von flexiblen Silikonschlauch, entweder Gebäude Luft oder ein Aquarium Belüfter, um eine konsistente Luftstrom und Split mit einem y-Stecker zu erzeugen. Verbinden den ersten Zweig mit dem Luftstromregler, der die Gesamtmenge der Luft durch das System (typischerweise 1.000 ml / min für 4 Beobachtungs Vials) steuert.
    2. Legen Sie eine Schnellkupplung in der zweiten Röhreso dass der Luftstrom am Anfang des Versuchs, ohne die Luftströmung kalibriert unterbrochen werden. Fügen Sie einen Y-Stecker und verbinden jeden Verzweigungsrohr mit dem Volumenstromregler.
    3. Schließen Sie den Schlauch an Volumenstromregler und verbinden zwei Meter Luftstrom.
  2. Set-up der Alkohol-und Wasserflaschen
    1. In flexiblen Schlauch an den Ausgang der Luftmengenmesser und führen Sie einen dünnen Glasrohr (Abschnitte von 1 ml Glaspipetten) mit einer 90 °-Bogen in das Ende eines jeden Rohrlänge. Dies wird als der Einlassluftstrom in den Wasser-und Alkohol-Flaschen dienen.
    2. Platzieren Gummistopfen mit 2 Löchern durch sie in die Flaschen mit Alkohol und Wasser. Halten beider Flaschen bei einer konstanten Temperatur 2 ° C höher als die Umgebungslufttemperatur unter Verwendung eines Wasserbades. In unseren Experimenten wird die Umgebungsraum bei 25 ° C gehalten wird, während das Wasserbad auf 27 ° C.
    3. Stecken Sie das gerade Glaspipette für die einir durch den Gummistopfen Einlass und erstrecken sich in die Flüssigkeit bis ungefähr 1 cm von der Unterseite der Flasche.
    4. Legen Sie eine Kniestückabschnitt Glaspipette in die verbleibende Öffnung in dem Gummi-Stopper, bis das Ende des Glas bündig mit der Unterseite des Stopfens in der Flasche. Fügen Sie diesen Luftaustritt in einem anderen Rohrlänge.
    5. Vereinige die Luftströme mit einem y-Stecker und eine andere Länge der Silikonschlauch um den Luftstrom durch eine leere Mischflasche oder Flasche mit gebogenen Glaspipette Schnitte durch eine zwei-Loch Gummistopfen eingesetzt lenken. Verwenden Sie eine andere Länge der Silikonschlauch für den Austritt Mischluftstrom.
  3. Versammlung der Beobachtung Vial
    1. Teilen die Austrittsluftstrom, der aus dem Mischkolben 2-3x bis 4 oder 8 kleinere Luftströme zu erhalten, so dass mehrere Beobachtungs Fläschchen können in jedem Experiment verwendet werden. Schließen Sie den flexiblen Silikonschlauch auf die Beobachtung Fläschchen.
    2. Richten Sie die Beobauf Phiolen mit leeren Flaschen mit einem Gummistopfen mit zwei Löchern, durch die Glasrohre liefern einen Einlass und einen Auslass für den Alkoholdampf abgedichtet.
    3. Decken Sie die Ende des ersten Glasrohr mit Netz und halten das Netz an Ort und Stelle mit einem kleinen Stück aus flexiblem Kunststoffrohr. Legen diese Röhre durch das erste Loch erstreckt, bis sie ungefähr die Hälfte der Länge des Röhrchens. Falls erforderlich, verwenden Sie Teflonband um eine bequeme Passform zu erhalten.
    4. Legen Sie die zweite Glasröhre auch mit dem Ende durch Verrechnung abgedeckt, bis sie bündig mit der Innenkante des Gummistopfens ist.
    5. Die Durchstechflaschen horizontal auf einem weißen Stück Papier, um den Kontrast mit den Fliegen unter schlechten Lichtverhältnissen rot maximieren.
    6. Mix entsprechenden Fraktionen des Luftstroms durch sprudelte Alkohol und der Luftstrom durch das Wasser geleitet. Überwachung der Luftdruck kontinuierlich und Anpassungen vornehmen, wie notwendig, um die gewünschte Durchmischung der Luftströme zu erhalten.
      Hinweis: Die Dauerlaufvon mehreren Fly Bar-Tests parallel oder auch nur einen einzigen Test in einem kleinen Raum kann zu einer deutlichen Anhäufung von Alkoholdampf führen. Um kontinuierliche Freisetzung von Alkoholdampf, die möglicherweise die Forscher in einem geschlossenen Raum beeinflussen zu vermeiden, muss ein geeignetes System, um an Ort und Stelle, die während des Experiments erzeugt Alkoholdampf ausreichend entfernt genommen werden. Um Alkoholdämpfe zu entfernen, schließen Sie ein 12.6-Zoll-Rohrstück auf den zweiten Glasrohr aus jedem Fläschchen vorsteht, bündeln sie und leiten zu einer trichterVakuumSystem. Forscher sollten auch dafür sorgen, dass die experimentelle Testraum ausreichend belüftet wird.

2. Vorbereitung der Versuchstiere

Begründung und Übersicht: Die richtige Kultur und Gehäuse der Fliegen wird Variabilität in den Daten zu reduzieren. Dies wird durch die Standardisierung und die Minimierung der Belastung durch den Fliegen erlebt erreicht. Aus diesem Grund ist keine Anästhesie (CO 2 oder Alternativen) verwendet During der folgenden Schritte des Protokolls. Außerdem sollte Fliegen Alter über Experimente und Zeitpunkte abgestimmt, um die Variabilität zu minimieren, wie dies bei anderen Verhaltensanalysen einschließlich Lern-und Gedächtnisexperimente 17 sein.

Verschiedene Licht: Dunkelheit kann verwendet werden, um die Funktion der circadianen Uhr in der Verhaltensreaktion auf Ethanol zu sondieren. Um festzustellen, ob ein Tagesrhythmus existiert, können Experimente unter einer definierten LD Zyklus durchgeführt werden, um die Leistung zu bestimmten Zeiten Zeitgeber (ZT) zu messen. ZT 0 steht für Dämmerung und wird als die Zeit der Lichter auf unter LD-Zyklen definiert, während ZT 12 ist die Zeit Lichter werden mit einem 12:12 h LD Zyklus eingeschaltet. Unter konstanten Bedingungen, die zirkadianen Zeit (CT) misst die Zeit für das Tier in der Abwesenheit von Umweltsignale, dh Freilaufzeit und wird auf die vorherige LD Mitnahmezyklus zusammen. In Wildtyp Drosophila, CT spiegelt die früheren ZT für die ersten paar Tages in konstanten Bedingungen wie der Freilaufzeit und circadianen Rhythmen sind ~ 24 Stunden. Zur Messung der circadiane Modulation und Beseitigung akuter Licht Auswirkungen auf Verhalten, sind die Fliegen zum Licht mitgerissen: Dunkel-Zyklen und dann konstant Dunkelheit (DD) vor den Experimenten übertragen. Circadian Experimente werden am zweiten Tag der DD durchgeführt, um die Leistung zu bestimmten Zeiten des zirkadianen (CT) zu messen.

In Drosophila führen Dauerlicht (LL) Bedingungen der circadianen Dysfunktion mit angefeuchteten oder abgeschafft molekularen Schwingungen der Kernzirkadianen Gene und die Störung der Verhaltenszirkadianen Rhythmen wie Herzrhythmusstörungen und der Bewegungsaktivität 18-21 arrhythmische Kurzzeitgedächtnis 17 belegt. Das Protokoll ist für zirkadianen Studien optimiert und kann für andere Experimente vereinfacht werden. Kleine rote Lichter in 12 Zoll aus Rohren verwendet; zirkadianen Alle Experimente werden mit dim rotes Licht (Umgebungsoverhead-rotes Licht <1 Lux auf Tischplatte durchgeführt~ 1 lux Licht).

  1. Rück die Fliegen bei 25 ° C unter 0.12 Stunden Licht: dunkelMitnahmeBedingungen (LD).
  2. Sammeln frisch geschlüpften Fliegen am Ende des Tages-Lichtperiode am Tag 1 und speichern Sie sie für 24 Stunden unter LD Bedingungen halten Fläschchen mit einer kleinen Menge von High-Agar-Konzentration Lebensmitteln darauf Klebrigkeit zu minimieren. Hinweis: Um sicherzustellen, gesund, normal entwickelt Fliegen erhoben werden, nur Fliegen in den ersten Tagen nach dem Schlüpfen beginnt gesammelt in einer Kulturflasche.
  3. Sammeln Chargen von ca. 30 (25-35) fliegt unter Verwendung eines Gebläses am Tag 2 gegen Ende der Lichtperiode, und Transfer zum Frischhalte Fläschchen.
  4. Verwenden Sie eine starke Lichtquelle, um Fliegen zum anderen Ende des Fläschchens zu lenken. Innerhalb dieses Bereichs ist die genaue Anzahl der Fliegen in jeder Ampulle nicht kritisch, Verhaltensbeobachtungen sind in Prozentgesamtanzahl von Fliegen am Ende jedes Experiments gezählt berichtet.
  5. Pflegen Fliegen unter DD Bedingungen bei 25 ° C for zwei Tage.
  6. Am Tag des Experiments, legen alle Fliegen in verschiedenen Bedingungen oder anderen als der experimentelle Verhalten Raum in den Raum für mindestens 1 Stunde vor dem Experiment Inkubatoren gebracht. Akklimatisierung reduziert Variabilität durch Änderungen der Temperatur oder Luftfeuchtigkeit.
  7. Beobachtungen machen zu sechs Zeitpunkten am Tag (CT 1, 5, 9, 13, 17 und 21), um für die circadiane Modulation des Verhaltens zu prüfen.
  8. Vergleichen Sie mehrere Zeitpunkte in einem einzigen Satz von Verhaltensexperimenten, um die Robustheit des experimentellen Design zu erhöhen und die Variabilität zu minimieren auf einen einzigen Versuch. So kann beispielsweise Beobachtungen von CT 1 und CT-13 gleichzeitig erhalten werden, wenn zwei Inkubatoren mit gegen Hell-Dunkel-Zeitpläne werden zur Mitnahme verwendet.
    Hinweis: Das obige Verfahren beschreibt die Herstellung von Versuchstieren für Assays in zirkadianen Bedingung konstanter Dunkelheit durchgeführt. Verschiedene Licht: Dunkelheit kann die Funktion der Uhr zu sondierender Verhaltensreaktionen auf Alkohol. Um festzustellen, ob ein Tagesrhythmus besteht die Experimente unter einem LD-Zyklus zu bestimmten Zeiten Zeitgeber (ZT) durchgeführt, um die Leistung zu messen. Zusätzlich kann das Protokoll mit Fliegen unter konstanten Lichtbedingungen für Experimente Testzirkadianen Funktionsstörung erhöht werden. Für alternative Protokolle, die Fliegen im Lichtverhältnissen untergebracht testen, sollten Verhaltenstests noch unter dunklen Bedingungen durchgeführt werden. Fliegen sollte in den dunklen 1 h vor dem Experiment überführt werden, um Verhaltensvariabilität aufgrund der akuten Wirkungen von Licht auf das Verhalten zu minimieren.

3. Verhaltensbeobachtungen

Begründung und Übersicht: Der folgende Alkoholverwaltung Protokoll wird für Beobachtungen unter schwachem Rotlicht Zustand optimiert. Die beiden Verhaltensmaßnahmen LORR und Sedierung repräsentieren zwei verschiedene Punkte des Fliegen Rausch. LORR stellt einen späten Punkt der Trunkenheit Einbeziehung der Verlust of Motor-und Haltungskontrolle, während Sedierung Maßnahmen eine sehr späte Endpunkt der Rausch. Genotyp oder zirkadiane Modulation kann diese beiden Maßnahmen unterschiedlich auswirken; damit man sich wünschen kann, um sowohl zu untersuchen. Kurz gesagt, werden entfernt in der Fläschchen geladen wird, werden die Anzahl der Fliegen Anzeige LORR oder Sedierung alle 5 min während der Alkoholdampf-Exposition, und die Gesamtzahl der entfernt am Ende des Experiments gezählt hat.

  1. Vor Beginn des Experiments, führen Sie die Luft durch das System (Luft durch Wasser-und Alkoholflaschen sprudelte) für mindestens 10 min und nutzen diese Zeit, um die Luftströme zu kalibrieren.
  2. Trennen Sie den Schnellspanner um den Luftstrom zu stoppen. Laden Sie die Fliegen in den Fläschchen, und schließen Sie den Luftstrom und starten Sie die Timer. Hinweis: Wenn nicht mehr reagiert Fliegen oder tote Fliegen in den Halte Fläschchen verließ, könnte dies ein Hinweis auf Stress-Bedingungen sein. Im Allgemeinen können diese Bedingungen durch das Gehäuse weniger Fliegen in den Halte Fläschchen oder Verringerung der Nahrungs Klebrigkeit mit einem leichten gelindert werdenlich höher Agar-Konzentration während der Zubereitung von Speisen. Für eine optimale Verhaltens-Analysen und minimaler Variabilität zwischen den Experimenten sollten gesunde Fliegen vor den Experimenten sein.
  3. Für die genaue Zeitmessung, verwenden Sie einen Timer, den Überblick über die Gesamtzeit der Exposition Alkohol halten und eine zweite Zählung-Timer zurück, um die 5-Minuten-Intervallen zu markieren.
  4. Legen Sie ein weißes Blatt Papier unter den Fläschchen, um den Kontrast besonders unter schlechten Lichtverhältnissen zu erhöhen rot und fliegen Sichtbarkeit.
  5. Überprüfen Sie regelmäßig den Luftstrom während eines Experiments zu konstanten Niveau zu halten. Im allgemeinen Luftströme einmal stabilisiert, stabil bleiben sie während der Dauer des Experiments.
  6. Zählen Sie die Anzahl der Fliegen, die ihre Aufrichtungsreflexes einmal alle 5 Minuten für eine 1 Stunde Zeit verloren zu haben. Als die Alkoholempfindlichkeit variiert zwischen Genotypen und genetischen Hintergründen, kann es wünschenswert sein, häufiger Abschätzungen durchzuführen oder um den Versuch für eine längere Zeitdauer durchzuführen.
  7. Heben Sie die Fläschchen slightly von der Oberfläche, und lenken das Licht von einem Rotlicht-Taschenlampe in Richtung der Papier hinter dem Fläschchen. Halten Sie die Hand-rot-Taschenlampen in einem Abstand von mindestens 12 cm zu den experimentellen Fläschchen Lichtverhältnisse nicht mehr als 1 Lux für alle Experimente unter schwachem Rotlicht Bedingungen aufrecht zu erhalten.
  8. Messen Sie mit einem Lichtspiegel Lichtmesser, um Standards für alle Experimente zu etablieren.
  9. Bestimmen Sie die Anzahl der Fliegen, die ihre Aufrichtungsreflexes, indem eine Firma Hahn in das Fläschchen verloren haben und zählen, wie viele Fliegen nicht, sich innerhalb von ca. 4 Sekunden rechts. Fliegen, die LORR anzeigen kann immer noch ihre Beine und Flügel zu bewegen, aber kann sich nicht aufrecht zu drehen.
  10. Am Ende der Sitzung, zählen Sie die Anzahl der Fliegen in jeder Flasche.
    Hinweis: Gelegentlich kann eine Fliege zwischen dem Anschlag und der Seite, wenn das Laden in den Versuchsflaschen fliegt gefangen werden. Wie dies in der Dunkelheit durchgeführt, kann es nicht ohne weiteres bemerkt, so ist es notwendig, die Gesamt taub zu zählenER entfernt am Ende des Experiments Prozente korrekt zu berechnen.

Darüber hinaus kann dieses Verfahren auch zur Sedierung von Fliegen, die eine andere Verhaltens Endpunkt darstellt messen. Während Fliegen sediert haben ihr Recht verloren Reflex, Sedierung erfordert eine größere Alkohol-Exposition. Verhaltens kann Sedierung durch das völlige Fehlen von Motorscheinaktivität mit Fliegen verbleibenden regungslos in dem Fläschchen folgenden aa Firma Hahn in das Fläschchen charakterisiert werden. Für Sedierung, zählen die Anzahl der Fliegen, die kein Bein unbewegt mit winken nach Lieferung der Firma Hahn der Flasche bleiben. Zusätzlich kann die Ampulle aufgerollt werden und her, um zu bestimmen, ob einzelne Fliegen noch ihre erregenden Reflex erhalten.

4. Datenanalyse

  1. Bestimmung der prozentualen LORR zu jedem Zeitpunkt auf der Basis der Gesamtzahl der in jedem Fläschchen entfernt beurteilt.
  2. Schätz Unterschiede zwischen circadianen Zeitpunkten oder Stämme von Berechng 50% LORR für jede Probe, die in den linearen Teil der sigmoiden Kurve fällt (siehe Fig. 2).
  3. Alternative Statistiken:
    1. Wenn Vergleiche zwischen Genotypen sind geplant, ist es wünschenswert, den gesamten Zeitverlauf analysiert mit wiederholten Messungen ANOVAand um den Bereich der Zeitpunkte, dass die Unterschiede signifikant mit Post-hoc-Tests (Fig. 3) zu bestimmen. Für diese Tests, bevorzugen wir einen Wert von 0,001 zu verwenden. Diese Unterschiede können an den einzelnen Belichtungszeiten sowie bewertet werden als Unterschiede zwischen den Genotypen in der Steigung der Kurve.
    2. Unterschiede in der Empfindlichkeit kann für bestimmte Zeiten von Alkohol Belichtung für eine bestimmte Reaktion wie Sedierung aus dem linearen Teil der Kurve (Fig. 4) bestimmt werden.
    3. Unterschiede zwischen Stämmen oder zirkadiane Zeitpunkte können mit Standard-F-Statistiken und Post-hoc-Tests geschätzt werden.

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Representative Results

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Die Modulation der zirkadianen Alkohol-Empfindlichkeit mit dem 50% LORR als Markierung.

Ein repräsentatives Beispiel zeigt circadiane Modulation in Alkohol Empfindlichkeit während des Tages ist in Abbildung 2 dargestellt. LORR wurde an sechs Zeitpunkten während der 2. Tag der DD in Canton-S gemessen und die 50% LORR wurde für jeden Zeitpunkt bestimmt. Analyse zeigte einen signifikanten Effekt der Tageszeit (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p <0,001, N = 6-10 pro Zeitpunkt). Die Fisher-LSD-Test zeigte signifikante Unterschiede zwischen CT1 vs CT5, CT5 vs CT13, CT17 vs CT5, CT5 vs CT 21, CT9 vs CT13, CT17 vs CT9 und CT9 vs CT 21. Dieses Ergebnis ist konsistent Mit unseren bisher veröffentlichten Ergebnisse 1.

Unterschiede zwischen Wildtyp-und Mutanten-Fliegen.

Das zweite Beispiel verwendet Zeitreihen, um Unterschiede in der LORR und Sedierung zwischen Wildtyp Canton-S Fliegen und fli zeigenes trägt einen Loss-of-function Mutation weiß (w 1118) in dem gleichen genetischen Hintergrund (Abbildung 3). Die w 1118 Mutation ist von besonderem Interesse für die Forscher transgene Drosophila-Linien werden oft mit diesen Fliegen und viele Mutantenlinien für circadiane Uhr-Gene auch die Mutation w 1118 erstellt. Die Ergebnisse sind als eine Zeitreihe (3) mit je 5 min während der gesamten Belichtungszeit gezeigten Daten dargestellt. Die Beobachtungen werden auf 60 min begrenzt, um die Auswirkungen der schnellen Toleranzaufbau 22-24 vermeiden. Die w 1118 Mutanten zeigen deutlich reduziert LORR Empfindlichkeit in Reaktion auf Ethanoldampf als dies Canton-S (ANOVA zwischen Subjekten F 1,10 = 57.12, p <0,001, N = 6). Bedeutung Unterschiede (a = 0,001) wurden in diesem Experiment von min 20 min 60 durch (3A gefunden w 1118 und Canton-S wurden auch in der Rate der Sedierung gefunden (ANOVA zwischen Subjekten F 1,10 = 137,301, p <0,001, N = 6). In der Sedierung Assay wurden signifikante Unterschiede (a = 0,001) in 50 Minuten, 55 gefunden, und 60 (Fig. 3B). Neben der fehlenden Abschirmung Pigmente in den Augen, die w 1118 Mutanten wurden auch Serotonin, Dopamin und Histamin 25,26 verringert. Diese Veränderungen in der biogenen Amin Spiegel kann für die veränderte Sensitivität zu Ethanol in den w 1118 Mutanten 27,28 ausmachen. Daher steuert das Niveau der weißen Ausdruck in den Genotypen getestet kann die Voraussetzung für genaue Beurteilung der Ethanol-Empfindlichkeit sein.

Die Modulation der zirkadianen Sedierung.

Im dritten Beispiel messen wir der Anteil der Canton-S fliegt behäbigd nach einer festgelegten Zeitspanne, um zu bestimmen, ob es eine circadiane Wirkung des Alkohols auf Sedierung (Abbildung 4). Wir verglichen den Anteil der Fliegen sediert bei 40 min (30% Alkoholdampf) bei CT 5 und 17, und die Ergebnisse zeigen, dass es deutlich weniger sediert Fliegen während des Tages im Vergleich zu Alkohol-Exposition während der Nacht (ANOVA: F = 1,20 6,21, p = 0,022, N = 10 (CT5) & 12 (CT17)). Die Fliegen erreichte nicht die 50%-Marke Sedierung in der Stunde, da die Beobachtungen wurden unter unseren Standard LORR Bedingungen, um einen direkten Vergleich möglich zu machen. Beobachtungen über die Stunden sind problematisch aufgrund des Aufbaus der schnellen Toleranz 22-24. In diesem Experiment wurden weniger als 25% der Fliegen entweder zirkadianen Zeitpunkt 40 min sediert, die anzeigt, dass es einen Unterschied in der Vorderkante Sedierung Empfindlichkeit zwischen diesen Gruppen. Das Sammeln von Daten zu diesem frühen Zeitpunkt in Sedierung ist eine nützliche INDICATIonen dass Unterschiede bestehen jedoch die Fähigkeit, die Wirkung der Behandlung auf die Form der Verteilung in Sedierung Antworten zu bestimmen, ist begrenzt. Zu bestimmen, ob es einen Unterschied in der gesamten Verteilung Sedierung, sollte eine höhere Ethanolkonzentration verwendet werden, um eine schnellere Geschwindigkeit der Sedierung gewährleisten.

Figur 1
Abbildung 1. Paddelstange zu Alkohol Empfindlichkeit und Sedierung in der Fruchtfliegen zu messen.

Figur 2
.. 2 repräsentatives Beispiel zeigt signifikante zirkadianen Modulationsempfindlichkeit in Alkohol während des Tages (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p <0,001, N = 6-10 pro Zeitpunkt; signifikante Unterschiede zwischen CT5 vs CT1, CT13, CT17, CT21 und CT13 und CT9 vs, CT17, CT21 &).

Fig. 3
Abbildung 3. Auswirkungen von Alkohol auf die Verhaltensreaktionen signifikant unterschiedlich zwischen Wildtyp-Canton-S Fliegen und die Loss-of-function weiß 1118 mutierten Fliegen. A) Canton-S Fliegen zeigen deutlich erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Alkohol als durch LORR gemessen sind im Vergleich zu fliegt mit der gleichen genetischen Hintergrund trägt die weiße Mutation (ANOVA zwischen Subjekten F 1,10 = 57.12, p <0,001, N = 6). B) Canton-S Fliegen sind anfälliger für Alkohol Sedierung als w 1118 Mutanten (ANOVA zwischen Subjekten F 1,10 = 137,301, p <0,001, n = 6). *p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

Fig. 4
. Abbildung 4. Repräsentative Daten vergleicht den Prozentsatz der Kanton-S fliegt bei 40 min zwischen 5 und CT-CT 17 sediert Wildtyp-Fliegen zeigen deutlich größere Steigerungen im ersten Sedierung bei CT 17 im Vergleich zu CT 5 (ANOVA:. F 1,20 = 6,21, p = 0,022, N = 10 (CT5) & 12 (CT17)).

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Discussion

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Die Kosten für Alkoholmissbrauch und Alkoholismus für die Gesellschaft ist enorm, sowohl in Bezug auf die menschliche und wirtschaftliche Kosten 29 30,31. Drosophila als Modell bietet eine schnelle und vielseitiges System, um schnell prüfen, die Verhaltensreaktionen von einer großen Zahl von Individuen und als solche wurde ausführlich sowohl für Alkohol 5,7,32-34 und circadianen Forschung 35-37 verwendet.

Hier haben wir beschrieben, ein einfaches Protokoll für die kontrollierte Verabreichung von Alkoholdampf zu erwachsenen Fliegen unter zirkadianen Bedingungen.

Entfernt unter standardisierten Bedingungen kultiviert werden, um Alkoholdampf für 1 Stunde, während der die Anzahl der Fliegen, die ihre Aufrichtungsreflexes verloren haben, werden alle 5 min erzielt ausgesetzt. Die hier beschriebene Protokoll wird für die zirkadiane Experimente aufgrund der zusätzlichen Anforderungen für die Mitnahme-und Wohnungs unter konstanten Bedingungen optimiert. Verschiedene Schritte können Vereinfachung seined für generische Studien durch die Beseitigung der Schritte, die für die zirkadiane Experimente wie Lagerung im Dunkeln für mindestens einen Tag oder tun, die Experimente unter schlechten Lichtverhältnissen sind rot. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um große Anzahl von Fliegen in einer kontrollierten Art und Weise in unterschiedlichen Alkoholkonzentrationen für nachfolgende biochemische oder molekulare Analysen freizulegen. Für die Übereinstimmung mit anderen Drosophila Verhaltensexperimente wie Lernen und Gedächtnis Beobachtungen, Messung der Verhaltensreaktionen bei schwachem Rotlicht Bedingungen können auch für Nicht-circadianen Experimente wünschen übrig.

Variation zwischen unabhängigen Wiederholungen des Experiments können kleine Unterschiede zwischen Mutanten oder transgenen Linien oder zwischen circadianen Zeitpunkte zu verschleiern. Es wird daher um Testproben aus mehreren Stämmen oder zirkadiane Zeitpunkten gleichzeitig (siehe unsere Beispiele) empfohlen, so dass "Replik" kann als Zufallsvariable zur Beseitigung hinzugefügt werdenWirkung der Variation zwischen den Replikaten.

Empfindlichkeit gegenüber Alkohol variiert zwischen Stämmen. Alkoholprozent (der Prozentsatz der Luftblasenbildung durch Alkohol) müssen entsprechend angepasst werden. Wie in Abbildung 3 zu sehen ist, fliegt die weiße Mutation tragen sind weniger anfällig für die Auswirkungen von Alkohol-Exposition als Wildtyp-Canton-S fliegt. Für die Analyse der Leitungen, die die Mutation weiß, kann es wünschenswert sein, den Prozentsatz von Alkohol zu denen die Fliegen ausgesetzt werden, zu erhöhen, um so die Verhaltenstest in der gleichen Zeitspanne von anderen Versuchen mehr als Alkoholexposition durch in schneller Toleranz führen Entwicklung. Bei extrem sensitive Mutanten und für Experimente, in denen es notwendig ist, den Alkoholgehalt verwendet werden, wie für Fliegen, die eine Mutation in dem Gen gelb beobachtet zu verringern, kann der Luftstrom erhöht werden, um den Alkohol gesättigten Luftstrom genau zu kalibrieren. Kleine, erhöht oder Dezemberreases (± 10%) an der Gesamtluftstrom (praktikable Luftbereich von 900-1100 ml / min für 4 Beobachtungs Fläschchen) scheinen nicht zu negativ auf die Fliegen.

Beobachtungen über 1 Stunde sollte, weil das Potenzial der schnellen Toleranzaufbau in den Fliegen 22-24, die Alkohol-Empfindlichkeit betrifft vermieden werden, wenn möglich. Stattdessen ist der Prozentsatz Alkohol für jeden Stamm, der in einer ca. 50% igen LORR führt von 30-40 min. Wenn Vergleich von mehreren unabhängigen Stämme erforderlich ist, wählen Sie einen einheitlichen Prozentsatz von Alkohol, die für alle Stämme funktioniert.

Dieses Protokoll ist stark abhängig von Verhaltensbeobachtungen, also die strikte Einhaltung von einem standardisierten Protokoll ist wichtig, Drift in Verhaltensbeobachtungen im Laufe der Zeit zu vermeiden. Wenn möglich, sollten Verhaltensbeobachtungen durchgeführt werden, so dass der Betrachter ist blind für die Genotyp-oder Zeitpunkt getestet. Um mögliche Befangenheit auf der Grundlage dieser und unbekannte Faktoren zu erfassen,empfiehlt es sich, die Daten über einen Zeitverlauf zu untersuchen und zu überprüfen, ob Beobachtungen bleiben in dem gleichen Bereich in der gesamten Versuchsreihe.

Die Paddelstange Set-up bietet einige Vorteile gegenüber anderen Methoden der Alkoholverwaltung für Fliegen, insbesondere für Bachelor-Forscher oder zirkadiane Studien zu den negativen Auswirkungen von Ethanol. Ein anderes Gerät, um die Wirkung von Alkohol auf die Motorsteuerung in den Fliegen zu messen, ist die inebriometer kann eine vertikale Spalte, in der Ethanoldampf wird durch steigende Schikanen und den Verlust der Haltungskontrolle oder die Empfindlichkeit der Fliege zirkuliert durch die Bestimmung der Zeit, die gemessen werden auf den Grund der Spalte 38,39 fallen. Die inebriometer stellt eine automatisierte Auslesen von Verlust-und Haltungskontrolle ist wertvoll für Alkoholforschung in Drosophila 9,22,39,40 bewiesen, aber diese Verhaltens Paradigma erfordert relativ teure Geräte, Platz für das Gerät, und Zeit, um zu kalibrierenBedingungen und optimieren. So kann die inebriometer nicht gut geeignet für viele grundständigen Lehre Labors mit begrenztem Budget oder Raum, oder für Forscher Durchführung zirkadianen Assays. Ein weiteres Verfahren zur Abgabe von Alkohol entfernt und Mess Sedierung beinhaltet das Anordnen einer kleinen Menge an flüssigem Alkohol auf einem absorbierenden Material entweder am oberen oder am unteren Rand eines Fläschchens und so den Alkohol mit der Zeit 41,42 verdampfen. Als Konzentration des Alkoholdampfes mit der Zeit zunimmt, kann Verhaltensreaktionen bewertet. Während dieses Liefermethode ist einfach zu Set-up, die Menge des Alkoholdampf, zu dem die Fliegen ausgesetzt sind, variiert mit der Zeit und Bedingungen. Für experimentelle Fragen, in denen Unterschiede in der Anfangsgeschwindigkeiten Empfindlichkeit oder Sedierung, wie circadiane Modulation beurteilen, ist es wünschenswert, ein konstantes Niveau von den Fliegen Alkoholdampf geliefert haben. Zusätzlich kann die Belichtung einer Vielzahl von entfernt auf eine konstante Menge an Alkohol exposure, wie mit dem Paddelstange durchgeführt wird, ist für die genaue Leistung der nachgeschalteten zellulären oder biochemischen Assays wünschenswert. Eine weitere Methode der Bereitstellung von Alkohol, um Fliegen gemeinsam in frühen Drosophila Alkoholforschung beteiligt Mischen des Alkohols in das Essen, wie es zubereitet wurde. Diese Methode ist sehr einfach und erfordert wenig Aufbau, es wird für chronische Exposition Alkohol über Tage am besten geeignet, wenn die Konzentration von Alkohol mit der Zeit ändert.

Weitere anspruchsvolle, automatisierte Verfahren sind auch für die Beurteilung der Bewegungsantworten von Fliegen zu Alkohol-Exposition, einschließlich Video-Aktivität Aufnahme und Bildanalyse-Software 7,43 erhältlich. Diese sind besonders leistungsfähig für die Beurteilung der positiven, hyper-aktivierende Wirkung von Ethanol. Allerdings können diese automatisierten Verfahren für Bachelor-Forschungsprojekten oder Lehrlabors zu teuer sein und kann nicht optimal für die Analyse einer großen Anzahl von Fliegen unter zirkadianen Bedingungen ausgelegt werdengen (z. B. Video-Capture unter dunklen Bedingungen erfordert ausgewogene und diffuse Infrarotbeleuchtung und infrarotempfindlichen Kameras). Wir glauben, dass die Paddelstange bietet eine einfache Set-up, kosteneffiziente Methode für Alkohol-Liefersystem und die Bewertung der Verhaltensreaktionen auf Alkohol, die gut geeignet, um eine Vielzahl von Bedingungen und Labor Designs ist.

PROTOKOLL ÄNDERUNGEN:

Die oben beschriebenen Protokoll wird bei der Prüfung der Wirkung von Alkohol-Exposition auf die Loss-of-Righting-Reflex in einem zirkadianen Kontext ausgerichtet. Jedoch kann das Protokoll leicht modifiziert werden, um andere Arten von Alkohol Experimenten unterzubringen.

Die Untersuchung der Reaktion auf Alkohol unter 12 h-12 h Hell-Dunkel (LD, Zeitgeber-Zeit) Bedingungen: Pflegen Fliegen unter 12 Std.: 12-Stunden-LD-Zyklus, bis das Experiment. Übertragen Sie die Fliegen auf die dunkle etwa 1 Stunde vor dem Versuch während der Lichtphase (ZT 1, 5 durchgeführtUnd 9) des Tages. Dadurch wird sichergestellt, dass die akute Wirkung von Licht ist nicht zu verwechseln die Ergebnisse.

Die Untersuchung der Reaktion auf Alkohol unter konstanten Lichtbedingungen: Die Kultivierung Fliegen unter konstanten Lichtbedingungen führt zur Unterbrechung ihrer circadianen Uhr und 18-21 arrhythmische Reaktionen auf Alkohol-Exposition ein. Entfernt kann auf die dunkle etwa 1 Stunde vor dem Experiment überführt werden, so dass die Fliegen werden unter den gleichen Bedingungen wie Fliegen im LD-oder DD Bedingungen gehalten getestet.

Sedierung: Fliegen, die sediert sind, können von LORR getrennt werden, da fliegt Fliegen bleiben regungslos auf dem Boden des Fläschchens, während LORR fliegt immer noch ihre Flügel, Kopf und Beine zu bewegen. Fliegen, die Ausstellung LORR noch mit subtilen Bewegungen zu reagieren, wenn das Fläschchen ist gestört. Sedierung von Fliegen wird durch die Zählung der Anzahl von Fliegen verbleibenden regungslos nach einem festen ta bestimmtp in das Fläschchen. Zusätzlich können Walzen des Fläschchens verwendet, um zu bestimmen, ob einzelne Fliegen noch ihre erregenden Reflex beibehalten werden.

Rückgewinnung: Die Verhaltenstest durch Messen Verwertung als zusätzlicher Parameter Alkohol Reaktion verlängert werden. Unterbrechen Sie Alkohol-Exposition und weiter Beobachtungen über die LORR alle 5 min. Weiter den Fluss der befeuchtete Luft durch die Fläschchen in der Rekonvaleszenz.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Die Finanzierung dieser Forschung wurde von einem Programm in Neuroscience Award von der Florida State University College of Medicine und die Unterstützung von der Abteilung für Biowissenschaften an der FSU zur Verfügung gestellt. Zusätzliche Finanzierung wurde durch einen Grant-in-Aid aus der Spirituosenherstellerforschungsfonds zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol 190 proof Various
Aerator Local pet store We use Whisper 60
Silicone tubing 1/8” VWR 408060-0030
120° Y-connector VWR 82017-256
Quick disconnects VWR 46600-048
Plastic tube clamps Bell-art products 132250000 Either this or next
Miniature air regulator McMaster-Carr 8727K11 Either this or previous
Miniature air regulator mounting bracket McMaster-Carr 9891K66
Gilmont size 12 flow meter VWR 29895-242
Tool clips McMaster-Carr 1722A43 To hold flow meters
Vial VWR 89092-722
Rubber stopper with two holes VWR 59585-186 Fits in vials
5 mm Pyrex glass tubes Trikinetics PGT5x65 Fits best in previous stopper
Teflon tape Hardware store To achieve snug fit in stoppers if necessary
Rubber stopper with two holes VWR 59582-122 Fits our bottles
Disposable glass pipets VWR 53283-768 Cut to length and bend by heating
Very fine nylon netting VWR Various
15 watt bulbs Hardware store Overhead red light
Photographic red safe light filters Overhead red light
Mini flashlights with red filters Mag-light

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Paddelstange: Verwaltung Alkohol zu Flies
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van der Linde, K., Fumagalli, E., Roman, G., Lyons, L. C. The FlyBar: Administering Alcohol to Flies. J. Vis. Exp. (87), e50442, doi:10.3791/50442 (2014).More

van der Linde, K., Fumagalli, E., Roman, G., Lyons, L. C. The FlyBar: Administering Alcohol to Flies. J. Vis. Exp. (87), e50442, doi:10.3791/50442 (2014).

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