Adenoviral genoverføring inn naive CD4 T-celler med transgene uttrykk for Coxsackie adenovirus reseptoren gjør den molekylære analyser av regulatoriske T-celle differensiering<em> In vitro</em>.
Regulatoriske T-celler (Tregs) er viktige for å gi immuntoleranse til selv så vel som til visse fremmede antigener. Tregs kan genereres fra naive CD4 T-celler in vitro med TCR-og ko-stimulering i nærvær av TGFβ og IL-2. Dette bærer et enormt potensial for fremtidige terapier, men molekylene og signalveier som styrer differensiering er i stor grad ukjent.
Primær T-celler kan manipuleres gjennom svangerskap utenfor genekspresjon, men vanlige metoder ikke klarer å målrette den viktigste naiv tilstand av T-celle før primære antigen anerkjennelse. Her gir vi en protokoll for å uttrykke ektopisk gener for naive CD4 T-celler in vitro før indusere Treg differensiering. Det gjelder transduksjon med replikering-mangelfull adenovirus og forklarer sin generasjon og produksjon. Den adenovirus kan ta opp store innsatser (opptil 7 kb), og kan utstyres med arrangører for å oppnå høy og forbigående overexpression i T-celler. Det transduces effektivt naive mus T-celler hvis de uttrykker en transgen Coxsackie adenovirus reseptor (CAR). Viktigere, etter smitte T-cellene er fortsatt naiv (CD44 lav, CD62L høy) og hvile (CD25 -, CD69 -) og kan aktiveres og differensiert i Tregs lik ikke-infiserte celler. Dermed kan denne metoden manipulering av CD4 T-celle differensiering fra begynnelsen. Det sikrer at ektopisk genuttrykk er allerede på plass når tidlige signalering hendelsene i den første TCR stimulering induserer celleforandringer som til slutt fører til Treg differensiering.
Tregs er avgjørende for å opprettholde immunforsvaret toleranse og til å dempe skyter immunreaksjoner. Tregs undertrykke tilskuer T celle aktivering. Følgelig fører ablasjon av Tregs til dødelig autoimmunitet og selvødeleggelse drevet av aktiverte T-celler en. Tregs utvikles i thymus ved negativ seleksjon av CD4 positive enkelt-forløpere, men de kan også skille i periferien fra naive CD4 T-celler ved lav-dose antigen stimulering med suboptimal ko-stimulering 1,2. Thymisk Tregs synes å undertrykke vev autoimmunitet mot selv-antigener, mens perifer Tregs har vært innblandet i å gi toleranse i tarmen eller lunge. Disse induserte Tregs potente hindre T celle aktivering etter anerkjennelse av utenlandske antigener i slimhinnene, herunder miljømessige antigener fra mat og luft, commensal bakterier og allergener 3,4. I tillegg Tregs er avgjørende for å etablere mors toleranse for fosterets peptider 5 og å prelufthull graft-versus-host sykdom 6.. På samme tid, Tregs også mediere uønskede effekter ved å dempe immun overvåking av tumorceller 7,8. Kjennetegnet av Tregs er uttrykk for den delen-angivelse transkripsjonsfaktor foxp3, en gaffel-head domenenavn som inneholder transkripsjonsfaktor som er nødvendig og tilstrekkelig for å konferere Treg funksjon 9,10. Noen signalveier som kan indusere foxp3 uttrykk er kjent. Imidlertid er de molekylære prosesser som kontroll, regulere eller modulere Treg differensiering i respons til T-celle-reseptor utløsende mindre godt forstått.
Tregs kan meget effektivt kan bli indusert in vitro gjennom stimulering av naive CD4 T-celler med anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer i nærvær av TGFβ og IL-2 11. Som den nye Tregs er funksjonelle in vivo, manipulering av molekyler som fremmer Treg differensiering bærer et enormt potensial for fremtidig therapies, for eksempel, ved behandling av astma, Crohns sykdom, og transplantasjon 11,12. Motsatt kan terapeutisk modulering av molekyler til å blokkere Treg differensiering gi nytte i fremtidige tilnærminger av kombinert behandling av slike pasienter.
In vitro differensiering assay har vært medvirkende til beskrivelsen av molekylære endringer som er forbundet med T-celle undersett differensiering. I øyeblikket, eksperimentelle forsøk på å søke eller skjerm for genprodukter som styrer T-celle differensiering er hemmet av det faktum at de vanligste metodene for ektopisk genuttrykk mislykkes i naive T-celler. For eksempel elektroporering og retroviral transduksjon er bare effektive i aktiverte T-celler. I motsetning til opprinnelige forventninger, lentiviral transduksjon, som vanligvis effektiv i hvilende celler, krever pre-aktivering av naive T-celler av cytokiner 13. Videre overføring av cDNA eller mRNA under elektroporeringinnebærer depolarisering av cellemembranen, som selv confers trekk ved T-celleaktivering, og kan til og med mobilisere Ca 2 + signalering og aktivere NFAT proteiner (upublisert observasjon og ref.. 14). Tilsvarende for retroviral transduksjon, naive T-celler har til å bli aktivert for 18 – 40 timer. I løpet av denne tid, forekommer nedbrytning av den nukleære membranen i løpet av celledeling og gjør det mulig for den etterfølgende genomisk integrering av den retrovirale vektoren 15.. Disse metoder er derfor ikke i stand til å ta opp den molekylære tidlig innledende regulering av T-celle møte med antigen, som er den avgjørende fase av hjelper T celle-differensiering.
Adenoviral transduksjon er kjent for å gi forbigående ektopisk genekspresjon i en rekke humane celletyper som uttrykker human adenovirus Coxsackie-reseptor (CAR). Den fortsetter uten krav til celle aktivering eller celle-syklus progresjon. Overflaten uttrykk for CAR er en forutsetning for effektiv virus tilknytning og internalisering, og transgene ekspresjon av den avkortede versjon CARΔ1 under en T-celle-spesifikk promotor ble funnet å gjengi mus thymocytter og T-celler som er mottakelige for infeksjon adenoviral 16.. Viktigere, ikke transgene ikke endre thymocyte utvikling eller in vitro differensiering av naive CD4 T-celler i ulike undergrupper (data ikke vist, ref. 17.). Adenovirus-mediert transduksjon av T-celler ble tidligere brukt for overexpression 17,18 og knock-down tilnærming 19,20. De transgene T-celler kan bli renset fra kommersielt tilgjengelig DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. og ref. 17..). Viktigste er at adenoviral transduction høyt uttrykk av et gen av interesse for naive T-celler uten å indusere tydelige tegn på aktivering. T-cellene er fortsatt naiv (CD44 lav, CD62L høy) og hvile (CD25 -, CD69 -) etter infectipå og kan aktiveres og differensiert i Treg lik ikke-infiserte celler.
Produksjon av rekombinante adenovirus kan oppnås etter transfeksjon av celler med HEK293A adenovirale plasmider (Figur 1). Disse plasmider inneholder vanligvis den menneskelige type 5 adenovirus genom med E1 og E3 gener slettede å gjengi rekombinant adenovirus replikering-inkompetente 21. HEK293A celler utfylle replikering mangel som de har blitt udødeliggjort gjennom stabil integrering av skåret adenovirus 22. Siden adenovirus vektorer er store (~ 40 kb), og dermed ikke godt egnet for tradisjonell begrensning enzym-mediert kloning, brukte vi den Gateway-systemet. Genet av interesse blir først klonet inn i en mindre adgang vektor, hvorfra det lett kan overføres til det adenovirale vektor destinasjon via lambda rekombinasjon reaksjon (LR) 23. Vi konstruerte pCAGAdDu vektorved å kombinere CAG promoter (kylling aktin promoter og CMV forsterker) med et uttrykk kassett som inneholder LR nettsider flankerer prokaryote ccdB seleksjonsmarkør 24. Denne ekspresjonskassett er sammensmeltet til en intern ribosom inngang stedet (IRES) element som tillater coexpression av den eukaryote infeksjon markør forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP), som er kondensert til en sekvens inneholdende det bovine veksthormon poly (A)-signal. Vi valgte CAG cis-regulatoriske sekvenser, ettersom prototypic CMV-promotor ble funnet å være svært aktiveringen-avhengige og derfor ugunstig for genekspresjon i naive T-celler.
Her gir vi en protokoll for effektiv in vitro differensiering Treg og en fremgangsmåte for å transduce naive CD4 T-celler uten aktivering (figur 2). Metoden gjør det mulig ektopisk genekspresjon eller slå ned foregående CD4 T-celle differensiering på naive tilstand. Den lar teste effekten av en overexpressed gen av interesse i løpet av tidlig signalering hendelser ved første TCR stimulering til T-celle undergruppe engasjement. Våre validering eksperimenter også gi grunnlag for å etablere lignende adenovirus programmet i differensiering av andre T celle undergrupper som Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, eller TFH celler.
Virus Generation og Titrering
For optimal transfeksjon resultater, kvaliteten og mengden av lineær vektor vises viktigst. Vi observerte ikke negative effekter på primære lysate produksjon fra en innledende overvekst av kulturen siden infeksjonen vil raskt gå en gang effektiv virus produksjon skjer. Imidlertid kan virusproduksjon ved HEK293A celler bli påvirket av lange innstikk som reduserer effektiviteten. Noen åpne leserammene ble faktisk funnet å forstyrre virus produksjon. Disse vira…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Lirui Du for byggingen av pCAGAdDU vektor og Oliver Gorka for levering av fiksering protokollen.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 |
Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | 11791020 |
PacI | New England Biolabs | R057S |
jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N |
HEK293A Cell Line | Invitrogen | R705-07 |
A549 | ATCC | CCL-185 |
6-well plates | BD Falcon | 353046 |
14 cm tissue culture dish | Nunc | 168381 |
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 |
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 |
DMEM | Invitrogen | 41966-052 |
FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 |
PenStrep | Invitrogen | 15140-122 |
RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F |
NaPyruvate | Lonza | BE13-115E |
NEAA 100x | Lonza | BE13-114E |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030 |
HEPES Buffer Solution (1 M) | Invitrogen | 15630-056 |
β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 |
MEM Essential vitamin mixture (100x) | Lonza | 13-607C |
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation | Invitrogen | 114-56D |
Recombinant Human TGF-beta 1 | R&D Systems | 240B |
Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | |
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 |
Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 |
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 |
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 |
LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |