나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T
Summary
순진 CD4 콕 사키 아데노 바이러스 수용체의 유전자 발현과 T 세포에 아데노 바이러스 유전자 전달은 규제 T 세포 분화의 분자 분석을 가능하게<em> 체외에서</em>.
Abstract
규제 T 세포 (Tregs의)는 자체뿐만 아니라 특정 외국 항원에 대한 면역 내성을 제공하기 위해 필수적입니다. Tregs의는 TGFβ와 IL-2의 존재 TCR과 공동 자극 체외 순진 CD4 T 세포에서 생성 할 수 있습니다. 이 미래의 치료를위한 엄청난 잠재력을지지하지만, 분자 신호 전달 경로 제어 차별은 대부분 알 수 있다고.
기본 T 세포는 자궁외 유전자 발현을 조작하지만, 일반적인 방법은 일차 항원 인식 이전에 T 세포의 가장 중요한 순진 상태를 대상으로 실패 할 수 있습니다. 여기, 우리는 Treg 분화를 유도하기 전에 체외에서 순진 CD4 T 세포의 이소성 유전자를 표현하는 프로토콜을 제공합니다. 그것은 복제 결핍 아데노 바이러스 전달을 적용하고 그 생성 및 생산을 설명합니다. 아데노 바이러스는 대량 삽입 (최대 7 KB) 걸릴 수 있습니다 및 높은 과도 overexp을 달성하기 위해 발기인을 장착 할 수 있습니다T 세포 ression. 그들은 형질 전환 콕 사키 아데노 바이러스 수용체 (CAR)을 표현하면 효과적으로 순진 마우스 T 세포를 transduces. 중요한 것은 감염 후 T 세포가 순진 유지 (CD44 낮은 CD62L 높은)과 휴식 (CD25 – CD69 -)과는 Tregs의에 감염되지 않은 세포와 유사한 활성화하고 차별화 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 처음부터 CD4의 T 세포 분화의 조작을 할 수 있습니다. 그것은 초기 TCR 자극의 초기 신호 이벤트가 결국 차별화를 Treg으로 이어질 세포 변화를 유도 할 때 자궁외 유전자 발현이 이미 보장합니다.
Introduction
Tregs의 면역 관용을 유지하고 지나친 면역 반응을 저해하는 중요합니다. Tregs의는 방관자 T 세포의 활성화를 억제합니다. 따라서, Tregs의의 제거가 활성화 된 T 세포 1에 의해 구동 치명적인자가 면역과 자기 파괴에 이르게한다. Tregs의는 CD4 단일 긍정적 인 전구체의 부정적인 선택시 흉선에서 개발하지만, 그들은 또한 차선의 공동 자극 1,2 낮은 복용량 항원의 자극에 따라 순진 CD4 T 세포에서 주변에 구별 할 수 있습니다. 주변 Tregs의이 용기 나 폐에 내성을 제공 연루되어있다 반면 흉선 Tregs의는 자기 항원에 대한 조직의자가 면역을 억제하는 것 같습니다. 이러한 유도 Tregs의이 유력 음식과 공기, 공생 세균 및 알레르기 3,4에서 환경 항원을 포함하여 점막 외국 항원을 인식 한 후 T 세포의 활성화를 방지합니다. 또한, Tregs의 태아 펩티드에 산모의 허용 오차 5를 구축하고 사전에 중요하다환기 이식편 대 숙주 질환 6. 동시에, Tregs의도 7,8 종양 세포의 면역 감시를 감쇠에 의해 원치 않는 효과를 중재. Tregs의의 특징 기능은 하위 – 지정하는 전사 인자 Foxp3의 필요와 기능 9,10 Treg 부여하기에 충분 포크 헤드 도메인을 포함하는 전사 인자의 표현이다. Foxp3의 발현을 유도 할 수있는 몇 가지 신호 전달 경로가 알려져있다. 하지만, 제어, 규제, 또는 트리거 T 세포 수용체에 대한 응답으로 차별화를 Treg 조절하는 분자 프로세스는 덜 잘 이해하고 있습니다.
Tregs의 매우 효율적으로 TGFβ와 IL-2 (11)의 존재 반대로 CD3와 anti-CD28 항체 순진 CD4 T 세포의 자극을 통해 체외에서 유도 할 수 있습니다. 새로운 Tregs의 생체, Treg 분화를 촉진 분자의 조작에 기능적으로 미래 therapi에 대한 엄청난 잠재력을 품는다ES 예를 들어, 천식 치료, 크론 병, 및 이식 11,12. 반대로, Treg 차별화를 차단하는 분자의 치료 변조 종양 환자의 복합 치료의 향후 접근 방법의 이점을 제공 할 수 있습니다.
체외 분화 분석에서 T 세포 부분 집합의 분화와 관련된 분자 변화에 대한 설명은 쓸모있다. 순간, 검색 또는 제어 T 세포 분화가 자궁외 유전자 발현의 가장 일반적인 방법은 순진 T 세포에서 실패한다는 사실에 의해 방해되는 유전자 제품의 화면으로 실험하려고합니다. 예를 들어, 일렉트로와 레트로 바이러스 전달이 활성화 된 T 세포에만 효과가 있습니다. 초기의 기대, 휴식 세포에서 일반적으로 효과적입니다 렌티 바이러스 전달, 대조적으로 사이토 카인 13만큼 순진 T 세포의 사전 활성화가 필요합니다. 또한, 일렉트로 동안의 cDNA 또는 발현의 전송자체가 T 세포 활성화의 기능을 부여하고 심지어 칼슘 2 + 신호를 동원 할 수 세포막의 탈분극을 포함 하고 NFAT 단백질 (미발표 관찰과 REF. 14) 활성화합니다. 40 시간 – 마찬가지로, 레트로 바이러스 전달을 위해, 순진 T 세포는 18 활성화해야합니다. 이 시간 동안, 세포 분열의 과정에서 핵 막 고장이 발생하고 레트로 바이러스 벡터 15의 후속 게놈 통합 할 수 있습니다. 이러한 방법은 따라서 헬퍼 T 세포 분화의 결정적인 단계이다 항원과 초기 T 세포 발생의 초기 분자 규제를 해결 할 수 없습니다.
아데노 바이러스 전달은 인간의 콕 사키 아데노 바이러스 수용체 (CAR)을 표현하는 인간의 세포 유형의 숫자에 과도 자궁외 유전자 발현을 부여하는 것으로 알려져있다. 그것은 세포 활성화 또는 세포주기의 진행에 대한 요구 사항없이 진행됩니다. C의 표면 발현AR 효율적인 바이러스 부착 및 국제화를 위해 필수적이며, T 세포 특이 적 프로모터에 따라 절단 된 버전 CARΔ1의 유전자 발현 아데노 바이러스 감염 16에 감염 마우스 흉선 세포 및 T 세포를 렌더링하는 발견되었다. 중요한 유전자는 흉선 세포 발달을 변경하지 않거나 순진 CD4의 체외 분화 서로 다른 하위 집합으로 셀 (데이터 표시되지; 심판 17.) 마. T 세포의 아데노 바이러스 – 매개 형질는 이전에 접근 19,20 발현 17,18에 사용되며 노크 다운되었다. 형질 전환 된 T 세포는 시판 DO11.10 TG에서 정제 될 수있다 CARΔ1 TG (코닉, 주식 회사와 REF 17.). 중요한 것은, 아데노 바이러스 전달이 활성화 명백한 증거를 유도하지 않고 순진 T 세포에 대한 관심의 유전자의 고 발현 할 수 있습니다. T 세포는 순진 유지 (CD44 낮은 CD62L 높은)과 휴식 (CD25 – CD69 -) 후 infecti에 비에 감염된 세포와 유사한 Treg으로 활성화하고 차별화 할 수 있습니다.
재조합 아데노 바이러스 생산은 아데노 바이러스 플라스미드 (그림 1) HEK293A 세포의 형질 전환 한 후 얻을 수 있습니다. 이 플라스미드는 일반적으로 복제 무능한 재조합 아데노 바이러스 21을 렌더링 삭제 E1 및 E3 유전자와 인간 유형 5 아데노 바이러스 게놈을 포함합니다. 그들은 전단 아데노 바이러스 (22)의 안정적 통합을 통해 불후의 한으로 HEK293A 세포가 복제 결핍을 보완. 아데노 바이러스 벡터가 큰 (~ 40 KB) 결과적으로 잘 기존의 제한 효소 중재 복제에 적합하지 않습니다 때문에, 우리는 게이트웨이 시스템을 채택했다. 관심의 유전자는 처음에 쉽게 람다 재조합 반응 (LR) 23를 통해 아데노 바이러스를 대상 벡터에 전송 될 수있는 작은 입력 벡터로 복제됩니다. 우리는 pCAGAdDu 벡터를 생성원핵 ccdB 선택 마커 24 측면을 노릴 LR 사이트를 포함하는 발현 카세트 CAG 프로모터 (닭 액틴 프로모터 및 CMV 증강)을 결합하여. 이 발현 카세트 소 성장 호르몬 폴리 (A) 신호를 포함하는 시퀀스 융합 진핵 세포 감염 마커 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 coexpression 수 있도록 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES) 요소가 융합되어 있습니다. 프로토 타입 CMV 프로모터가 매우 활성화에 의존하고 순진 T 세포의 유전자 발현 그러므로 불리한 것으로 발견 된 이후 우리는 CAG CIS 규제 시퀀스를 선택했다.
여기, 우리는 체외 Treg의 분화 효율을위한 프로토콜 및 활성화 (그림 2)하지 않고 순진 CD4 T 세포를 형질 도입하는 방법을 제공합니다. 방법은 자궁외 유전자 발현을 활성화하거나 순진 상태에서 위의 CD4에게 T 세포 분화를 노크. 그것은 overexpresse의 효과를 테스트 할 수 있습니다T 세포 부분 집합의 약속까지 초기 TCR 자극에 따라 초기 신호 이벤트 기간 동안 관심의 D 유전자. 우리의 검증 실험은 Th2 사이토 같은 살전 다른 T 세포 집합, Th9, Th17의, TH22, 또는 TFH 세포의 분화와 비슷한 아데노 바이러스 응용 프로그램을 구축하는 기초를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
바이러스 생성 및 적정
최적의 형질 결과, 선형화 된 벡터의 질과 양이 가장 중요 나타납니다. 감염이 빠르게 번 효율적인 바이러스 생산이 발생 진행할 것이기 때문에 우리는 문화의 초기 전면에 자라 난의 기본 해물 생산에 부정적인 영향을 관찰하지 않았다. 그러나 HEK293A 세포에 의해 바이러스 생산 효율을 감소 긴 삽입에 의해 영향을받을 수 있습니다. 일부 오픈 읽기 프레?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 고정 프로토콜의 제공에 pCAGAdDU 벡터와 올리버 고르 카 구축을위한 Lirui 뒤 감사드립니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | 11791020 |
| PacI | New England Biolabs | R057S |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N |
| HEK293A Cell Line | Invitrogen | R705-07 |
| A549 | ATCC | CCL-185 |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 |
| 14 cm tissue culture dish | Nunc | 168381 |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Invitrogen | 15630-056 |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 |
| MEM Essential vitamin mixture (100x) | Lonza | 13-607C |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation | Invitrogen | 114-56D |
| Recombinant Human TGF-beta 1 | R&D Systems | 240B |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 |
| Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 |
| Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
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