Summary
אנו מציגים פרוטוקול פשוט להשיג סרטי הקרינה מיקרוסקופיה של תאי שמרים גדלו, וחבילת תוכנה מבוססת GUI כדי לחלץ את נתוני זמן סדרת תא בודד. הניתוח כולל שושלת אוטומטית והקצאת זמן החלוקה משולבת עם בדיקה חזותית ואוצרות ידני של נתונים מסומנים.
Abstract
מיקרוסקופיה זמן לשגות הקרינה הפכה לכלי רב עוצמה בחקר תהליכים ביולוגיים רבים ברמת התא בודד. בפרט, סרטים המתארים את התלות הזמנית של ביטוי גנים לספק תובנות לגבי הדינמיקה של הרגולציה שלה, עם זאת, ישנם אתגרים טכניים רבים לקבלת וניתוח של סרטי הקרינה של תאים בודדים. אנו מתארים כאן פרוטוקול פשוט באמצעות מכשיר microfluidic תרבות זמין מסחרי כדי להפיק נתונים כאלה, וממשק מבוסס MATLAB, משתמש גרפי (GUI) מבוססת חבילת תוכנה לכמת את תמונות הקרינה. מגזרי התוכנה ותאי מסלולים, מאפשרים למשתמש לאצור חזותי טעויות בנתונים, ומקצים באופן אוטומטי שושלת וזמני החלוקה. GUI נוסף מנתח את סדרת הזמן לייצר כל עקבות סלולריים, כמו גם נגזרות בפעם הראשונה והשנייה שלהם. בעוד התוכנה תוכננה עבור ס cerevisiae, מודולריות והרבגוניות שלו צריכה לאפשר לו לאo לשמש כפלטפורמה ללימוד סוגי תאים אחרים עם כמה שינויים.
Introduction
ניתוח תא בודד של ביטוי גנים שקדם את ההבנה של היבטים רבים של ויסות הגנים שלנו. תמונות סטטיות של ביטוי ניאון כתב באמצעות cytometry זרימה או מיקרוסקופיה לספק מידע שימושי על חלוקת ביטוי תא בודד, אבל חסרה את ההיסטוריה והאבולוציה של נתוני סדרת זמן הנדרשים כדי להודיע ישירות דינמיקת ביטוי גנים. מיקרוסקופיה זמן לשגות הקרינה מציגה אמצעים כדי להשיג את שני מדידות תא בודדות ואת ההיסטוריה שלהם. ניסיוני בטכניקות ואנליטיות שונות פותחו כדי להשיג ולכמת סרטים של ביטוי ניאון כתב, ובכך הקניית תובנות תכונות ויסות הגנים (ראה 1 לביקורת), כגון תא אל תא וריאציה 2,3, היווצרות חיידקי persister 4, שעתוק ייזום והתארכות 5, תעתיק מתפוצץ 6,7, תלות מחזור תא 8,9, ותורשתיות 10. עם זאת, obtסדרת זמן הקרינה aining איכות תא בודד כרוכה באתגרים טכניים משמעותיים בculturing monolayer של תאים בסביבה לשליטה וכימות בתפוקה גבוהה של הקרינה בסרטים שנרכשו. כאן, אנו מתארים הליך להשיג ולנתח את סרטי הקרינה של ס ' cerevisiae ללא ניסיון הנדרש בייצור מכשיר תרבית תאים או בפיתוח תוכנה (איור 1).
ראשית, אנו פירוט פרוטוקול דוגמה ליצירת סרטי סדרת זמן הקרינה לשמרי ניצנים הביעו אחד או יותר כתבי ניאון. למרות שכבר נבנו תאי microfluidic תרבות מותאמים אישית והועסקו בעבר בהצלחה 11-13, אנו משתמשים במכשיר microfluidic זמין מסחרי מCellAsic (הייוורד, קליפורניה). מערכת תאי הגבולות לצמיחה monolayer ומאפשר שליטה מתמדת של סביבת זלוף. פרוטוקול מיקרוסקופיה אנו מציגים הוא אמצעי פשוט להשיג fluorescסרטי ence של שמרי ניצנים, אלא כל פרוטוקול ניסויי שונה (מכשיר תרבות מותאם אישית תנאי מדיה חלופיים, וכו '). מניבים נתונים סרט הקרינה דומים של תאי שמרים בודדים עשויים להיות תחליף.
בשלב הבא, אנו מתארים את הניתוח של הסרטים באמצעות ממשק משתמש גרפי (GUI) מבוססת חבילת תוכנה בMATLAB (MathWorks, Natick, MA), המכונה GUI עבור ניתוח מהיר של סדרות עתיות הקרינה (שתלים), כדי לחלץ נתונים זמן סדרה לתאים בודדים. יש שתלי תכונות דומות לתוכנת 14 צדדי, הקוד פתוח חבילה נייד-ID בפילוח ומעקב אחר תאים וחילוץ בעוצמת הקרינה ומידע גיאומטרי. עם זאת, שתלים מספק תכונות חשובות נוספות. ראשית, היא מציעה עריכה אינטראקטיבית קלה של פילוח ותוצאות מעקב כדי לוודא דיוק הנתונים, ולא רק gating הסטטיסטי של עקבות אזור outlier לאחר ניתוח. יתר על כן, הוא מרחיב את הניתוח לautomaticallשושלת המיועדת y ונקודות מחזור תא עניין של שמרי ניצנים. קביעה כאשר האם והבת מתחלקות ליצירת שני אזורים סלולריים עצמאיים היא חיונית לקביעת תא כולו (אם לרבות כל ניצן מחובר) מדידות לאורך כל מחזור 8 התאים. החבילה מורכבת משלושה מודולים כדי לבצע משימות אלה. האזורים הסלולריים הקטעים הראשונים המבוססים על הניגוד בין תמונות שדה בהירות ממוקדות ולא ממוקדות, ומאפשר למשתמש להגדיר ולבחון את פרמטרים חזותי פילוח. המסילה השנייה (. באמצעות בלייר והיישום של Dufresne MATLAB של אל שגרת קרוקר et IDL, זמינה בכתובת: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/) ומודדת אזורים סלולריים דרך זמן; מקצה אוטומטית שושלות, ומאפשרת בדיקה ויזואלית ותיקון שגיאות. GUI זומם פשוט כלול לנכסי תא בודד השאילתה. המודול השלישי מייחס ניצן הופעה והחלוקה TIMES, ומוציא כפלט את כל נתוני תא סדרת הזמן, כמו גם נגזרים בפעם הראשונה והשנייה שלהם (כפי שנדון ב9). מודול ניתוח פלטי את הנתונים כקובץ טקסט מופרדי רווחים למחקר שלאחר מכן בתוכנה הסטטיסטית של בחירה. לפיכך, החבילה מאפשרת למשתמש לחלץ נתוני סדרת זמן באיכות גבוהות באמצעות ממשק גרפי. יש לנו להשתמש בשיטה זו כדי להעריך שיעורי שעתוק בזמן אמת בתאי שמרי ניצנים בודדים כפונקציה של מחזור התא 9. בעוד שמודולים שעברו אופטימיזציה עבור שמרי ניצנים, הפרמטרים או, במידת צורך, הקוד זמין באופן חופשי יכול להיות מותאם לאורגניזמים אחרים וסוגי תמונות. פילוח, מעקב, ושושלת אלגוריתמי הקצאה עשויים להיות ספציפיים לסוגי הדמיה הוקצתה ואורגניזם בשאלה. את האלגוריתמים הקיימים יכולים להיות מוחלפים, אבל עדיין שומרים על ממשק GUI המאפשר מעקב שגיאות שתמיד occu בדיקה ותיקון של פילוח חזותי ידידותית למשתמש וR עם כל אלגוריתם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. השג סרטים מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאי שמרים יחיד הגוברים בלשכת Microfluidic
- לחסן 1 תקשורת SC מ"ל (תקשורת מוגדרת סינטטי עם גלוקוז 2% ומשלים של חומצות אמינו מלא) עם תאים מצלחת גדלה טרי, דגירה תרבות הלילה ~ 16 שעות על תוף גלגלת ב 30 ° C. הכן את התרבות כזו שOD 600nm הסופי הוא ~ 0.1 לצמיחת יומן בשלב מוקדם.
- לדלל את תרבות המתנע לפי צורך וצמיחה המחודש של 1 מ"ל במבחנה טרי 6-8 שעות נוספות לOD 600nm = 0.1. זה מספק תאים גדלים במצב יציב תזונתי עשיר בצפיפות מתאימה לטעינה למכשיר microfluidic. (לחלופין, החלף את צעדי 1.1-1.2 עם ההליך הדרושים כדי להכין את התאים כפי שנדרש לצורך הניסוי.)
- הכן צלחת תרבות microfluidic Y04C מCellAsic: להסיר את פתרון הספנות; לשטוף את הבארות עם מים סטריליים, ובאמצעות זרימת מערכת זלוף ONIXמים באמצעות בארות 1-6 ב6 PSI ל5 דקות כדי לשטוף את הערוצים. לאחר מכן, זרימה מהטעינה גם 8 ב6 PSI ל10 שניות (יש לו את ערוץ טעינת ספיקות גבוהות הרבה יותר וצריך להיות סמוק בנפרד).
- הסר את כל מים מהבארות ולהחליף עם SC 250 μl בכניסת בארות 1-6 ו -50 μl מהתרבות מהשלב 1.2 בתא הטעינה גם 8. (לחלופין, למקם את המדיה הרצויה בבארות כניסת 1-6 לניסויים הדורשים מיתוג בין תנאים שונים.)
- לאטום סעפת ONIX לצלחת, ולהתחיל תחול אפיקים וחדר תרבות בזורם מכניסת בארות 1-6 ב6 PSI למשך 2 דקות ואחריו לפחות 5 דקות ב6 PSI מרק המפרצון גם מחזיק כלי התקשורת מוצאת ל ניסוי. זרימה זו ללא הרף עד שלב 1.7.
- הכן מיקרוסקופ לצורך הניסוי. אנו משתמשים במיקרוסקופ Zeiss Axio Observer.Z1 widefield עם מצלמה EMCCD אשד השנייה בעל תאורה אחורית (Photometrics, טוסון, אריזונה) וקשת מתכת הליד 200 לומןמנורה (לפני מדעי, רוקלנד, MA) לעירור הקרינה נחלש עד 10% כדי למנוע photobleaching. כדי למזער את זמן המעבר הנדרש לרכישה בערוצים מרובים ניאון, אנחנו זוג קוביית מסנן יחידה, משולש bandpass dichroic למסנני עירור / פליטה המתאימים לCFP, YFP, וRFP (Chroma הטכנולוגיה קורפ, מפוח פולס, VT; סט 89,006) להגדיר בגלגלי מסנן חיצוניים, מיתוג מהיר (מוצרי Ludl אלקטרוניים, Novato, קליפורניה).
- מניחים כמה טיפות של נוזל על טבילה האובייקטיבית (אם יש צורך, אנחנו משתמשים בשמן דסק"ש Zeiss תכנית-Apochromat 63X/1.40), ולעגן את מכשיר microfluidic מאובטח בשלב של מיקרוסקופ ההפוכה. הבטחת הצלחת אינה עוברת בכלל בשלב לאורך הניסוי משפרת את מעקב תא במהלך ניתוח הנתונים. אנחנו פשוט מדביקים את הצלחת להר הבמה כדי למנוע התזוזה שלה.
- להתמקד בשליש השמאלי של חדר התרבות הראשון (שבו הגובה הוא התא הקטן ביותר) באמצעות אחת מהחיובי המוטבעסמני tion. כבה את הזרימה ממפרצון התקשורת טובה, וזרימה מתא הטעינה גם 8 ב6 PSI בפרצי 5 שניות. הזז את הבמה כדי להסתכל סביב חדר התרבות לתאים. הגדל את זמן טעינה ולחץ זרימה עד צפיפות תאים רצויה מושגת, אך להימנע מעומס יתר וסותם את המחסום השמאלי ביותר שבו תקשורת טריות נכנסה לחדר.
- מתחיל לזרום ממפרצון התקשורת המכיל גם את כלי התקשורת מתחילה ב 6 PSI.
- בMetaMorph (התקנים מולקולריים, Sunnyvale, CA) או אוטומציה מיקרוסקופית אחרת ותוכנת שליטה, ההתקנה רכישה רב ממדית לקחת מספר רב של תמונות בעמדות בשלב מרובות לאורך זמן. הגדר את מספר ומרווח הזמן בין נקודות זמן. בחר מספר תפקידי הבמה עם ~ 10 תאים כל אחד (יהיה יותר לגדוש במהירות). אנחנו בדרך כלל להשתמש בעד 16 עמדות 5 דקות במרווחים ותמונה, שבה כל דורשים ~ 11 שניות לרכישה בכל נקודת זמן.
- התקנת הרכישה, כך שעל כל עמדה בכל שלב ה נקודת זמןתהיה תכנית דואר: להתמקד בתחום הבהיר האור המועבר (BF) תמונה באמצעות של MetaMorph מובנה בשיטת פוקוס אוטומטי (יישום פוקוס אוטומטי כיומן אישית בכתב בתחילת כל עמדת במה מספקת שליטה רבה יותר על דיוק פוקוס); לרכוש BF תמונה ב1 מיקרומטר למישור המוקד (FP); לרכוש BF מחוץ לפוקוס (BFOOF) תמונה במיקרומטר -4 לFP (שימוש אישית בכתב עת לשנות את המיקוד בין תמונות כנדרש), ולרכוש אחד בגווני אפור תמונה לכל כתב ניאון בFP באמצעות הגדרות מותאמות לרכישה מהירה עם photobleaching מינימאלי.
- במידת צורך, להשיג תמונות רקע תיקון והצללה לכל כתב ניאון בשטח של חדר התרבות ללא תאים.
- הכן תכנית הזרימה לניסוי בתוכנת בקרת ONIX. במקביל תחל בתכנית רכישת MetaMorph וזרימת תכנית בתוכנות שליטת ONIX.
- בסופו של הניסוי, לתקן האו"םאפילו רקע והצללה בתמונות הניאון (במידת צורך), ולחלופין לשלב את קבצי tif. לכל ערוץ תמונה בכל עמדה בשלב לתוך קובץ סרט stk. (למשל ליצור BF, BFOOF, CFP, YFP וסרטי RFP לעמדה 1 ).
2. פורמט וקטע הנתונים למעקב באמצעות GUI FormatData בMATLAB (איור 2)
- הפעל את קובץ FormatData.m בMATLAB כדי לפתוח את ממשק קלט נתונים. בחלק העליון, ציין או לגלוש אל התיקייה המכילה את קבצי תמונה כדי להגדיר את ספריית הנתונים, ולאחר מכן להשתמש בממשק הגרפי כדי לציין את סוגי הנתונים וקבצי תמונה שנרשמו בניסוי.
- בצד ימין, בחר בכפתור הרדיו שליד "זמן לשגות" כדי לציין איזה סוג הניתוח לבצע. "זמן לשגות" יתייחס אל הסדרה את התמונה כסדרת זמן (למשל סרט של תאים הגדלים בתא microfluidic). "סטטי" יתייחס לכל סדרת תמונה כסדרה של תמונות שנלקחו מאוכלוסייה (לדוגמה: מספר תמונות שצולמו באונטערשיידעמדות שונות שממפים על מדגם שקופית אחת). בגרסה שתלי זו, ניתן לעבד נתוני זמן לשגות למספר רב של עמדות, אלא כקובץ נפרד לכל עמדה (ראה שלב 2.14).
- סמנו את התיבה לרישום תמונה כדי לתקן תנועות לא מדויקות בשלב על ידי העברת כל תמונה בסרטים כדי למזער את תנועת תא נראית לעין בתוך המסגרת. אנו ממליצים בחום זה כמו שזה משפר באופן משמעותי מעקב (הפחתת אוצרות מסלול ידנית מאוחר יותר), אבל נוסיף, ערכי הפיקסלים "רעש לבן" אקראיים כדי למלא בו תמונות כבר עברו בגבול. זה יכול להיות גם נבחר לאחר צפייה בתמונות BF מפולחות בשלב 2.7 או בכל נקודה עד שלב 2.13.
- סמנו את התיבה "ברייט פילד" בפנל "נתונים ערוצים". לחץ על "בחר" לימני כדי לטעון את תמונות BF. ל*. TIF קבצים, בחר את כל תמונות BF המתאימות לסרט אחד על ידי החזקת מקש Shift לחוץ בעת בחירה, ולאחר מכן לחץ על "פתח". עבור קבצי STK *., פשוט בחר את ערימת BF של עניין. אם התמונות הן הצלחההכיר באופן מלא, את שמות הקבצים יוצגו בתפריט הקופץ בצד ימין בפנל "נתונים המוכרים". *. לקבצים TIF, כדי להיות בטוח את שמות הקבצים מופיעים בבסדר הנכון (לשמור קבצים עם שמות רציפים במהלך רכישה - BF_t001, וכו ').
- בדקו את "השדה הבהיר (מחוץ לפוקוס)" התיבה ולהשתמש בלחצן "בחר" כמו בשלב 2.4 לטעון את קבצי BFOOF, אשר יהיה רשום בקופץ לצד ימין. (BFOOF מתקבל כBF מיקרומטר -4 ביחס ל FP ב63x מגזרים כן.)
- סמנו את התיבה "תא המסכה". בפנל "מסכת המקור", בחר בכפתור הרדיו שליד "BF המגזר". לחץ על כפתור "הפרמטרים" כדי לפתוח את GUI הפילוח. (לחלופין, בחר בסרט מסיכה מראש מפולח על ידי בחירה בלחצן האפשרויות שליד כפתור "בחר מסכת הקובץ", לחיצה על האפשרות השנייה, ובחירה בסרט כמו בשלב 2.4. במקרה זה, סרט BFOOF אין צורך, ו יכול לדלג על שלב 2.8).
- הגדר את הפרמטרים פילוח השונים (תיאורים של כל ניתן להציגאד על ידי לחיצה על "תיאורי פרמטר"), ולבדוק את איכות הפילוח על ידי לחיצה על "מבחן" (איור 3). בהצלחה אזורים מפולחים יהיו ירוקים עם גבולות אדומים. הקפד להשתמש במחוון כדי לבדוק את נקודות זמן רבות בסרט. כאשר הפילוח הוא משביעת רצון, בחר "בוצע" כדי להחזיר את הפרמטרים לפילוח GUI FormatData.
- סמנו את התיבה "צבע תמונות". הזן את שם הצבע לתמונת ניאון הערוץ הראשון בתיבת עריכת הטקסט, ולאחר מכן לחץ על "הוסף ובחר" כדי לטעון את קבצי צבע כמו בשלב 2.4. השם של הצבע יתווסף לתיבת הרשימה בצד השמאל, ואת שמות הקבצים יתווספו לשולחן בצד ימין. אם זו טעות הוא עשה בטעינת קבצי הצבע, בחר את השם של הצבע בתיבת הרשימה בצד השמאל ולחץ על "צבע הסר" כדי להסיר את הקבצים. חזור על פעולה עבור כל אחד מערוצי צבע.
- אם מסכות אזור משנה נוספות המבוססות על אחד מצבעי הניאון (למשל כותרתו fluorescently גרעין → nuclאוזן מסיכת אזור) הן רצויה, סמן את התיבה "צבע המסכה". אם לא, דלג לשלב 2.12. בפנל "מקור מסכת הצבע", הזן את שם מסיכת אזור משנה בתיבת עריכת הטקסט. לבחור צבע מתפריט הקופץ בפנל "צבע מסיכת המקור" (דורש את הצבע שלנוסף בשלב 6) ולדחוף "פרמטרים" כדי לפתוח סף בדיקת GUI.
- לחץ על הכפתור "Auto-הסף" כדי לקבוע באופן אוטומטי את סף שימוש בשיטה של Otsu 15, ואת התמונה תדגיש את האזורים שהשתמרו מעל הסף (איור 4). הסף יכול להיות מותאם באופן ידני באמצעות תיבת העריכה. השתמש בפס הגלילה כדי לאשר את הסף מתאים לכל הנקודות הזמן. כשמרוצה, לדחוף "סיום" כדי לחזור לסף GUI FormatData.
- לדחוף "הוסף ומגזר" כדי ליצור את המסיכה תת האזור באמצעות מודול הסף מוחל על תמונות הצבע שנבחרו. שם מסיכת הצבע והמקור יוצגו בטבלה משמאל, עם r הרלוונטישמות קבצי ecognized המופיעים בטבלה בצד ימין. (לחלופין, לחץ על "הוסף ובחר באפשרות" לטעון קבצי מסכה תת אזור שהוכן מראש.)
- בתחתית, ציין או לגלוש לתיקייה הרצויה כדי לשמש כספריית השמירה.
- לחץ "נתוני פורמט" כדי לקרוא את קבצי התמונה (באמצעות קוד tiffread2.m שפותח על ידי פרנסואה Nedelec, זמינים בכתובת: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298), מעבד את הנתונים, וליצור * קובץ. מחצלת בתיקייה שצוינה. קובץ זה ישמש כקלט לGUI ProcessTimeSeries.
- חזור על שלב 2.4-2.13 לסט של סרטים לכל תפקיד במה.
3. תאי מסלול ושושלות לאורך זמן עם ProcessTimeSeries GUI, ומזהה סגן כומר ולתפקידי Lineage (איור 5)
- הפעל את קובץ ProcessTimeSeries.m בMATLAB כדי לפתוח את GUI המעקב. להגדיר את הפרמטרים הבאים לאחר הפתיחהGUI:
- "גובה קאמרי" ("קובץ I / O" פנל, שמאלי עליון) - זה מציין את הגובה של החדר שבו התאים לכודים. הוא משמש כאילוץ בקירוב נפח תא כמבוסס על הציר הראשי ומשניות של אזור התא כמו ב8 אליפסואיד 3D.
- "מיקרומטר / פיקסל" ("קובץ I / O" פנל) - מקדם ההמרה לכייל פיקסל למרחק מיקרומטר בתמונות ששטח ונפח חתך ניתן לחשב במיקרומטר ו2 מיקרומטר 3, בהתאמה.
- "מסנני פנל" (להלן "קובץ I / O" פנל) - מינימום שנקבע ופרמטרים לסינון מרביים אזורי זבל במסכה: "שטח" - שטח האזור בפיקסלים; "ECC" - הגורם האקסצנטרית, עגול יותר כ→ 0 , "מדע בדיוני" - גורם צורה, עגול יותר כמו 1 →.
- לחץ על "עומס" בתמונות "קובץ קלט / פלט" פנל, ובחר את קובץ הנתונים *. מחצלת תפוקת ריבית על ידי GUI FormatData. מסיכת האזור (וכל מסכות אזור משנה) מוחלת על כל ערוץ צבע, ומספר המדידות שונות נעשים (טבלת 1). קובץ הנתונים ואז ניצלו. (אם טעינת קובץ לתוך ProcessTimeSeries ממפגש קודם, זה ישאל אם הניתוח יש להפעיל מחדש מההתחלה זהירות:.. זו תמחק את כל אוצרות מסלול כבר הושלמו ותטפל בנתונים כאילו היו טריים מGUI FormatData אם ההפעלה מחדש בטעות, פגע Ctrl + C במהירות בחלון פקודת MATLAB כדי למנוע * אצר בעבר הקובץ. מחצלת מפני החלפה.)
- בשלב הבא, לעקוב אחר התאים. בפנל "תאי מסלול" (בסמוך ללוח "המסננים"), להגדיר את הפרמטרים הבאים:
- "עקירת מקס" - המרחק המרבי בפיקסלים תא יכול לנוע בין תמונות סמוכות לפני להיות מתויג כתא אחר. עקירה גבוהה יותר פירושו האלגוריתם יכול להסביר תאים נעים יותר, אבל זה גם מגביר את המורכבות של התאמת אזורים סלולריים בהמונים. אנחנו מתחילים בגיל 12 ולהקטין אם מתרחשת שגיאה במעקב (ראה שלב 30.4).
- "זמן מזערי" - מספר המזערי של מופעים לזכר תא כדי להיחשב סדרת נתונים חוקית. אנו משתמשים ב1 כדי למנוע הסרת כל עקבות של ממש, אבל זה יכול להיות מוגבר אם תוצאות בפילוח עקבות אזור קצרות מועד, מזויפות.
- "זיכרון פריים" - מספר מרבי של מסגרות רצופות אזור תא יכול להיעלם ולתת את אותו זיהוי כשהוא חוזר. אם זה נעלם לזמן רב יותר מאשר "זכרון מסגרת", זה יינתן תעודה חדשה עם חזרה. אנו משתמשים ב2 כדי לאפשר לאזורים שאסור להחמיץ בפילוח ל2 מסגרות לפני ההחזרה.
- לחץ על "תאי מסלול" כדי לעקוב אחר אזורים מפריים אחד למשנהו באמצעות centroids האזור (בלייר ויישום Dufresne MATLAB של קרוקר, גריר, ושגרת IDL שבועות, זמין בכתובת: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/) , כדי להקצות שושלות לניצנים חדשים מופיעים, וכדי לשמור את הנתונים. שושלות מוקצות באופן אוטומטי על ידי דקותimizing מרחקים בין ניצנים המשוערת ואמהות פוטנציאליות בכל מסגרת. (אם שגיאה מופיעה בחלון פקודת MATLAB בשל "קומבינטוריקה הקשה", להקטין "עקירת מקס" ולחזור על מעקב.) פרמטרים שינוי בחלונות קופצים, כנחוץ לנתונים שלך.
- לאצור אזורים גרועים מפולחים וטעויות בזיהוי או מטלות שושלת באמצעות הכלים גרפיים השונים או מקשי קיצור (שמוצג בחלון קופץ על ידי לחיצה על הכפתור מעל פנל "מידע תא הנבחר").
- מחוון, "תמונה קודמת", "התמונה הבאה" (Ctrl + שמאל / ימין) - להשתמש כדי להציג ולעבור בין מסגרות בסדרה את התמונה.
- "# תמונה" - מציג את מספר המסגרת של התמונה הנוכחית בצירים השמאליים וימניים. מעבר למסגרת שנקבעה על ידי הקלדת המספר שלה בצד הימין "התמונה #" תיבת עריכה.
- "מסגרת דלתא" - מראה את ההבדל במספר מסגרת בין צירי ימין ושמאל (Δ = ימין - שמאל).
- "הסתר טקסט" (Ctrl + T) - עובר בין הצגת תעודות הזהות בתאהצירים הנכונים או לא.
- "תוויות הסתר" (Ctrl + L) - עובר בין הצגת תעודות הזהות של התא בצירי השמאל או לא.
- תפריט "מסכה" קופץ - לבחור בין הצגה לא מסכה, המסכה הסלולרית, או כל משתמש שהוגדר תת מסיכות לתצוגה בלוח השמאלי.
- תפריט קופץ "כיסוי" (Ctrl 1-9) - לבחור להציג BF ושכבות צבע במסגרת השמאלית. הצג BF הוא היחיד שמחליף את שכבת BF או לבטל בשני הצירים. לעבור בין תצוגה או לא על ידי בחירת שם השכבה בתפריט שוב ("*" מציין שכבה מוצגת). Ctrl +1 מחליף BF כיסוי, עם החלפת 2-9 את שכבות הצבע במטרה.
- "צבעי סט" - להשתמש בו כדי לקבוע צבע לתצוגת שכבה. חלון קופץ יהיה השאילתה שערוץ הקרינה להגדיר, ולאחר מכן את לוח הצבעים יופיעו להגדרת משתמש.
- "שינוי אזורים ומסלולים" לוח - אלה שולט השפעת שינויים על מסכת אזור התא ומידע עקבות:
- "מסלולים עדכן" (Ctrl + U) - שימוש מחדשלהקצות מזהים סלולריים. אם אין תאים שנבחרו בצירים הנכונים, GUI ינחה לתא מזהה לשנות. כאשר מזהה משתנה X ל-Y, כל המופעים העתידיים של X ישתנו ל-Y, וכל מופעים עתידיים של Y הנוכחי, יועברו לX. (לעתים תא אחד יהיה לעבור קדימה ואחורה בין 2 תעודות, שוב ושוב. זה בשל המעקב מנסה להכיל את תעודות זהות מרובות באזור oversegmented ולא טעות בזיהוי פונקצית העדכון.) ניתן לבחור תאים מרובים ותעודות הזהות שלהם השתנו בו זמנית, אך הקפידו לתת לכל מזהה ייחודי. כדי להקצות אזור לזהות שאינו קיימות בקובץ הנוכחי, הזן "0" ואחד יופק. השתמש ב-Ctrl + W כדי להחליף את תעודות זהות של שני תאים מודגשים.
- "מחק את השירים נבחרים" (Ctrl + D) - להשתמש בו כדי למחוק את התאים שנבחרו או אזורי תאים מרובים במסגרת הצירים הימנית הנוכחית. (אם אין תאים שנבחרו, ינחה את תעודת זהות.) כדי למחוק לצמיתות את כל המופעים של עקבות מזהה, סמן את התיבה לצד דהכפתור רצועות שנבחר lete (טקסט ישתנה כדי "למחוק את כל"). זה שימושי עבור להיפטר אזורי זבל מתמשכים, אבל קודם לבדוק מסגרות עתידיות לוודא זיהוי אינו עובר לתא תקף או באזור ניצן.
- "אזורי מיזוג" (Ctrl + או M) - מחליק ומשלבים אזורים סלולריים. לחץ על תא או תאים בצירים הנכונים כדי לבחור (באזור יהפוך לאדום אם נבחר). מיזוג באזור אחד ייסגר מורפולוגית למלא סדקים או נתחים חסרים קטנים באמצעות אלמנט בצורת דיסק. מיזוג שני או יותר אזורים סמוכים ישלב אותם לאזור אחד ולתת לי מזהה הנמוך ביותר לאזור החדש. זה שימושי לאזורים מעל מפולחים (לעתים קרובות כאשר יש לי התאים vacuoles גדול).
- "צייר האזור" - להשתמש בעכבר כדי לצייר באזור הצירים הנכונים שבו רצויים ולחץ פעמיים כדי לסיים. לספק מזהה ייחודי לא נמצא בערכת נתונים (בין 1 ל 65535). ביטול על ידי לחיצה על Delete במקלדת.
- "מעקב אחר שושלת יוחסין" פנל - לאחר מעקב,הקצאות שושלת נוצרות באופן אוטומטי. כאשר אזורי זהות חדשים מופיעים, מזהה התא החדש מופיע בצבע ורוד וקו אדום נמשך לאזור האמא. אזורים חדשים גדולים מכדי להיות ניצנים או רחוקה מדי מאמהות פוטנציאליות מופיעים בירוק ומוקצים לאם תעודת זהות של "נאן" ("לא מספר", ראה טבלה 2). האזורים הקיימים בנקודת הזמן הראשונה שיש לי אם תעודת זהות של "0". כדי לפתור משימות בודדות, הזן את אמו ומזהי ניצן בתחומי עריכת הטקסט ולחץ על "תקן". כדי למחוק אמא של תא, הזן "0" בתור האמא שלו. שיטה מהירה יותר היא לבחור שני אזורים בתמונה הימנית ולחץ על Ctrl + F. זה יהיה באופן אוטומטי להקצות אזור המבוגר כאם ואזור החדש יותר כמו הבת, תוך מחיקה כל מטלות קיימות בעבר לאם בתו התא. זהירות: לחיצה על "חישוב שושלות" בכל עת תהיה לחשב מחדש את כל מטלות שושלת, כולל אלה שהמשתמש אצרה בעבר.
- פנל "מידע תא הנבחר" - "קבל אניNFO "יציג כמה מדידות של האזורים הנבחרים בצירים הנכונים." מידות ... "מאפשר למשתמש לקבוע אילו מדידות מוצגים (כמו גם להגדיר את רשימת ברירת המחדל לפעולות אחרות כגון" נתוני יצוא "). ניתן להשתמש בו כדי לקבוע את תעודות ושושלות (למשל, אם התא X יש ניצן בזמן t, סביר להניח שאין לה ניצן אחר בזמן t + 5 דקות) נכונות.
- "שמור שינויים" (Ctrl + S) - עדכוני קבצים * המחצלת כדי לשקף שינויי משתמש.. משתמש לעתים קרובות (אין לבטל את הפונקציה)!
- "צור מגרשים" - פותח את GUI GeneratePlots. נהג להתוות מידע משתנה נבחר וחישובים פשוטים לאזורי תא בודד המסומנים בצירים של GUI ProcessTimeSeries, הממוצע שלהם, או ממוצע של כל האזורים בכל מסגרת הנכונים במהירות. זה GUI יכול לחשב נגזרים ראשון מחוספס, אך הקפד לציין את מרווח הזמן הנכון בפינה השמאלית העליונה. חלקות יכולה להיות פלט נתון לשמירה על ידי לחיצה על "צור איור".
- לאצור כראוי נתונים: למזג כל אזורי oversegmented; למחוק את כל אזורים לא לכידת התא כולו; להיות בטוח יחסי אמא ניצן מוקצים כראוי (קו אדום מופיע ביניהם בזמן הופעת ניצן, כאשר מזהה הניצן הוא ורוד, ראה טבלת 2), ולחסל את כל תעודות זהות ירוקות על ידי קביעת הזהות, הקצאת אזור אמא, לא אמא של הקצאה ("0"), או מחיקה של האזור. נתוני ניצן יתווספו לזה של האם במהלך הניתוח הסופי ולכן לא למזג אזור ניצן לאמא שלה (זה יוביל להערכת נפח לא מדויקת).
- ראייה לבדוק נתונים עבור כל מסגרת עד למועד האחרון של עניין, אבל זה לא נדרש הזמן של הסדרה כולה, אם לא באמצעות מסגרות המאוחרות יותר.
- הקפד לשמור את השינויים.
- חזור על שלבי 3.1-3.7 לקובץ *. מחצלת לכל תפקיד במה.
4. יצוא נתונים לניתוח
- פשוט לייצא למדידות אזור גלם עבור כל תא דרך טיםדואר, לדחוף "נתוני יצוא". את המדידות של עניין ניתן לבחור בממשק שנפתח, והם יהיו פלט במופרדי רווחים *. קובץ txt עם שמות משתנים כמו כותרות של עמודות.
- כדי לנתח את סדרת הזמן עבור תאים שלמים לאורך זמן, לחשב מידע מחזור התא, ולקחת את הנגזרים, לדחוף "ניתוח סדרת זמן". יפתח חלון המאפשר בחירה של המדידות של עניין וקלט של פרמטרים ניתוח (איור 6).
- הזן את נקודת הזמן האחרונה שאצרה בGUI (כל המסגרות הבאות תהיה להתעלם ממנה). פרמטרי הקצאת ההחלקה ומחזור תא ברירת המחדל המתאים לההפלואידים וזנים דיפלואידים צלמו ב 5 דקות במרווחים, אך אלה ייתכן שיהיו צורך להיות מגוונים לתוצאות הטובות ביותר. (בדקו שערכי הפרמטרים מתאימים באופן ידני על ידי קביעת זמן נביטה וחטיבה לערכת נתוני בדיקה והשוואה לביצועים של האלגוריתם האוטומטי.)
- כאשר כל הפרמטרים מוגדרים, לדחוף "נתח" ל:
- חסרונותtruct מערכים לכל מדידת גלם ולחסר רקע (כפי שנמדד בעוצמה הממוצעת של האזור שאינו התא של הפריים הראשון בכל סרט ניאון, או יכול להיות מוגדר לחשבון לautofluorescence הממוצע לפיקסל תא).
- Fit שגם מחליק למידות שנבחרו למדידה למנוע רעש בתדר גבוה (כפי שנדון ב9).
- באופן אוטומטי לקבוע הופעת ניצן וזמני חלוקת תא לכל תא המבוסס על שינויים בשיפוע של סדרת הזמן כאמור בנפח 9. מדידות הניצן לאחר מכן תתווסף למדידות של האמא בין הופעתה והחלוקה כל מחזור לסדרה כל זמן תא רציף. התקדמות מחזור התא מנורמלת גם תחושב החל 0-2 מחטיבה לחטיבה.
- Fit שגם החלקה לקחת -1 יציב ו2 nd נגזרים של מדידות שנבחרו. (לצורך הנגזרים מוגדרים היטב, הסדרות עתיותנעשים רציף על פני החלוקה על ידי העברת נתונים עבור מחזור התא הבא כדי לפגוש את נקודת הסיום למחזור הקודם.)
- תפוקת גלם וסדרה מוחלקת זמן לכל האזורים, וכל תא מוחלקת, רציפה, וסדרת זמן מובחנת כמערך לכל מדידה. המרכיב הראשון הוא מדד לצבע רקע חיסור, שאר השורה הראשונה מחזיק תעודות סלולריים, שאר הטור הראשון הוא מספר המסגרת, ואת האלמנטים שנותרו להחזיק את סדרת הזמן עבור כל תא בודד בעמודה עם כל שורה מקביל למסגרת בעמודה הראשונה. מערך דומה של מידע שושלת סדרת זמן התקדמות מחזור התא וגם יהיה פלט. המערך "LineageArray" מכיל טבלה עם כל שורה מייצגת את מערכת יחסים אמא וניצן הראשון דרך העמודות חמישי הם האם מזהה, הניצן מזהה, מסגרת של אזור הניצן הראשון, מסגרת ניצנים מוערכת, ומסגרת החלוקה המשוערת. הנתונים מיוצאים לקובץ *. מחצלת (קובץ נתוני MATLAB).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניסוי בוצע בהצלחה וניתח יניבו סדרת זמן מתמשכת בעיקר לתאים שלמים יחידים עם הופעת ניצן שהוקצה מציאותי ופעמי חטיבה. כדוגמה, ביצענו פרוטוקול לעיל עם זן שמרי הפלואידים להביע עותק משולב של חלבון פלואורסצנטי Cerulean (CFP) מונע על ידי האמרגן המכונן ADH1 כדי לבחון כיצד צמיחה וביטוי העולמי עשויות להשתנות לאורך זמן בתאים בודדים (לוח 4, Y47 ). רצנו ניתוח סדרת הזמן לקבל תא כולו (איור 7 א) מדידות לאורך זמן, ותלות במחזור התא עולה לנפח וגם ביטוי כפי שנמצא ב9. לאחר היווצרות ניצן, ההיקף הכולל המשולב (אמא של ניצן +) מגדיל יותר מהר מאשר לפני הופעת ניצן (בקנה אחד עם 8,16) תוך ריכוז חלבון, או עוצמת ממוצע, מקטינה מעט (7 ב 7C ואיורים). העלייה באינטגרציה משולבתחלבון טד (ריכוז X נפח במקרה זה) גם מאיץ אחרי ניצנים (איור 7 ד). השוואה לאזור האמא לבד (איור 7 ב & D), תוצאות אלה ממחישות את החשיבות של שילוב כראוי תרומות ניצן לכל תא המדידה ולהדגיש את הצורך בהיווצרות ניצן נכון ומשימות בזמן החלוקה. כפי שכבר דווח 9, אנחנו יכולים להשתמש בסדרת הזמן המובחנת לחישוב יחסי mRNA רמה מיידי M (t) ושיעור שעתוק (t), ששניהם יגדלו גם אחרי ניצנים (איור 7E ו7F):
היכולת ליצור נגזרות זמן יציבות של סדרות זמן מדידה גם יתרונות מחקרים קינטיים. אנו משתמשים בזן שמרים להביע גורם הנצפה, דמיוני שעתוק עם פעילות שעתוק להחלפה (לוח 4, Y962). גורם השעתוק הראשי של מסלול רעב פוספט, Pho4p, נשלט באמצעות לוקליזציה Nucleo-cytoplasmic בתגובה לconcentratio פוספט תאי n 18. אנחנו החלפנו את ה-DNA של תחום מחייב Pho4p עם tetR, אשר נקשר אופרון ט (TETO), והתמזגנו גורם השעתוק החדש C-סופני לחלבון פלואורסצנטי צהוב כדי ליצור Pho4-tetR-YFP 9. על ידי מעבר לרמת פוספט בתקשורת זלוף, אז אנחנו יכולים לעבור ביטוי של CFP משולב מונע על ידי אמרגן סינטטי מורכב מ7 אתרי קישור לTETOND האמרגן מינימאלי CYC1 (7xtetOpr-CFP). ניתוח סדרת זמן מראה כאשר גורם השעתוק הוא מקומי לגרעין (באמצעות שילוב של RFP וNhp2p החלבון הגרעיני כדי ליצור submask מבוססת RFP גרעיני כמו בשלב 2.9-10), וכאשר גן היעד מתחיל ומפסיק שעתוק (איור 8). על ידי ניתוח הסדרה הנגזרת לאורך זמן, ניתן להסיק הפעלה וכיבוי זמנים של אמרגן היעד בכל תא בודד גם כאשר הריכוז של כתב הניאון היציב הוא גבוה. טבלת מס '1. מינוח משתנה מדידה בProcessTimeSeries GUI. טבלת 2. קוד צבע מזהה סלולרי למעמד הקצאת שושלת. לוח 3. שתלי להגיש תיאורים. לוח 4. זני שמרים, המשמשים במחקר זה. 
כאשר P (t) הוא החלבון הכולל בזמן t וγ M הוא שיעור השפלה mRNA 0.04 דקות -1 
איור 1. סכמטי של פרוטוקול. הפרוטוקול מתאר את השלבים ל1) תרבות microfluidic, 2) הקרינה, מיקרוסקופיה זמן לשגות, 3) ניתוח נתונים, ו 
איור 2. FormatData GUI. הממשק משמש ליבוא, עיצוב ונתוני תמונת מגזר לחישובים מאוחרים ובדיקה חזותית. מספרים מציינים את פרוטוקול צעד המקביל לכל רכיב. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. 
איור 3. SegTest GUI. הממשק משמש לבדיקת מקטע תא הפרמטרים ation וחזותיים לאשר את דיוק פילוח כמו בשלב 2.7. 
איור 4. ColorThreshTest GUI. הממשק משמש לבדיקת סף העצמה הדרושה כדי ליצור מסכת subcellular מערוץ הקרינה שנבחר כמו בשלב 2.10. 
איור 5. ProcessTimeSeries GUI. הממשק משמש למדידה, לעקוב, מבחינה ויזואלית לבדוק, ולערוך אזורים סלולריים והקצאות של שושלת. מספרים מציינים את פרוטוקול צעד המקביל לכל רכיב.target = "_blank"> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. 
איור 6. AnalysisParams GUI. הממשק משמש להזנת פרמטרים הנדרשים לניתוח סדרת הזמן כמו בשלבים 4.3 ו -4.4. 
איור 7. סדרה מתחיל מתא בודד זמן של שמרי הפלואידים להביע ADH1 PR-CFP בתרבות microfluidic במשך כמה דורות. () שדה מואר (בשורה העליונה) וCFP (בשורה תחתונה) micrographs מוצגים בנקודות הזמן המצוינות לתא לאורך כל הניסוי . לתא האם המפולח (הכחול outliנה) וניצניה (מתווה ירוקה), התא כולו הרציף מתואר באדום. אמא של גולמית ונפח ניצן (ב) ו (ג) סדרת זמן ריכוז חלבון הוחלקו כדי להסיר רעש מדידה, ו( ד ') משולבת CFP הקרינה הייתה מחושבת כמכפלה של נפח וריכוז. התא כולו זכר (אדום) הוארך חלוקת העבר כדי לשמור על סכום מצטבר שהוא קל להתאים להחלקה שגם גזירה על פני חטיבות (B ו-D). (ה) ברמת ה-mRNA והיחסית (F) שיעור שעתוק מיידי מחושבות באמצעות משוואות (1-2) ואת ההתאמה שגם ב( ד '). 
איור 8. תגובת קצב שעתוק לאמרגן Nucleo-cytoplasmicהלוך של היתוך Pho4-YFP בתאי שמרים בודדים. () micrographs מארבעת ערוצי הרכש המצוינים מוצגים לתא עם Pho4-tetR YFP-התמזגו להחלפה transactivator ש( ב ') localizes לגרעין RFP-הניכר בתגובה לפוספט והנמוך (ג) ביטוי כוננים של כתב 7xtetOpr-CFP. (ד ') את השינויים בשער מוסק שעתוק עם לוקליזציה בממוצע (קו שחור) והן ברמת התא הבודד (קווים אדומים ומגנט, שבו אדום מייצג את רציף אזור התא שתואר באדום ב). ירידות חדות בביטוי CFP B בקנה אחד עם חלוקת תא, כאשר כמה חלבון הוא הפסיד לבת של התא. שם מדידה תיאור זמן מספר מסגרת תמונה אזור סה"כ Of פיקסלים המרכיבים את האזור נפח (4/3) πabc, שם = ½ אורך ציר מרכזי של אזור, B = ½ אורך ציר המשני, וג = b או "½ גובה קאמרי" (לפי קטן יותר) (X) _ (Y) אומר מתכוון עוצמת פיקסל למסיכת האזור (Y) בצבע ערוץ (X) (X) חציון _ (Y) עוצמת חציון פיקסל למסיכת האזור (Y) בצבע ערוץ (X) (X) _ (Y) STD סטיית התקן של עוצמות פיקסל למסיכת האזור (Y) בצבע ערוץ (X) (X) _ IQR (Y) טווח רבעונים של עוצמות פיקסל למסיכת האזור (Y) בצבע הערוץ (X), 75 ה אחוזון - 25 ערך האחוזון ה (X) _ T20pct (Y) מתכוון לעצמת 20% העליון של עוצמות פיקסל למסיכת אזור (Y) בצבע הערוץ (X). להשתמשפול בהשוואה למדידה הבאה כדי לקבוע לוקליזציה subcellular ללא submask. (X) _ B80pct (Y) מתכוון לעצמת 80% התחתונים של עוצמות פיקסל למסיכת אזור (Y) בצבע הערוץ (X). שימושי בהשוואה למדידה הקודמת כדי לקבוע לוקליזציה subcellular ללא submask. (X) _ M50pct (Y) מתכוון לעצמת 50% אמצע עוצמות פיקסל למסיכת האזור (Y) בצבע ערוץ (X) (X) _cellint משולבת צבע הקרינה של ערוץ (X) (כלומר עוצמת פיקסל X נפח) לתא כולו (אמו וכל ניצן מחובר) (Z) Raw תפוקת גלם זמן סדרת נתונים על ידי "ניתוח סדרת זמן" למשתנה (Z) (Z) חלק פלט שגם החליק-גלם זמן סדרת נתונים על ידי "ניתוח סדרת זמן" למשתנה (Z) (ת) כל הפריטים התא כולו (מ 'פלט אחר + מצורף ניצן (Z) Rawsmooth) זמן סדרת נתונים על ידי "ניתוח סדרת זמן" למשתנה (Z) (Z) המשך נתוני סדרת זמן תא שלמים עשו מתמשכים בחטיבות ("ריצה כוללת") פלט על ידי "ניתוח סדרת זמן" למשתנה (Z) (Z) WhSmooth שגם-מוחלק (Z) פלט תא כל זמן סדרת נתונים על ידי "ניתוח סדרת זמן" למשתנה (Z) (Z) DDT בפעם הראשונה, שגם נגזרת של-מוחלק (Z) פלט תא כל זמן סדרת הנתונים על ידי "ניתוח סדרת זמן" למשתנה (Z) (Z) d2dt2 בפעם שנייה, שגם נגזרת של-מוחלק (Z) פלט תא כל זמן סדרת הנתונים על ידי "ניתוח סדרת זמן" למשתנה (Z) צבע מזהה סלולרי מצב שושלת צהוב אם הוקצתה ורוד ניצן חדש (קו אדום נמשך לאמו שהוקצתה) ירוק אין אמא שהוקצתה שם קובץ תיאור FormatData.m נתוני הקלט GUI שסרטים בפורמטים תמונות וקטעי BF לעיבוד על ידי ProcessTimeSeries.m FormatData.fig פריסת חלון GUI FormatData BFsegment.m מודול פילוח BF, עם extractregions2.m וsegmentregions.m SegTest.m פילוח איכות בדיקות GUI SegTest.fig פריסת חלון SegTest GUI extractregions2.m המרכיב הראשון של מודול פילוח BF לזהות אזורים segmentregions.m מרכיב שני של מודול פילוח BF לאזורי תא נפרדים ונקיים color2submask.m מודול פילוח submask הקרינה מבוסס ColorThreshTest.m בדיקות מסכת סף הקרינה מבוססת GUI ColorThreshTest.fig פריסת חלון ColorThreshTest GUI tiffread2.m תמציות הנתונים *. קבצי TIF או *. STK לשימוש בMATLAB imalign.m רישום תמונה באמצעות מתאם צלב 2D ProcessTimeSeries.m עיבוד נתונים ממשק העוקב אחר אזורים, מקצה שושלות, ומאפשר תיקון ויזואלי של טעויות. כמו כן מספק יכולת זוממת GUI מבוססת ופלטי נתוני סדרת זמן כל התא ProcessTimeSeries.fig פריסת חלון GUI ProcessTimeSeries cleanMask.m מבטל אזורי מסכה המבוססים על פרמטרים בProcessTimeSeries GUI track.m עוקב אחר אזורים סלולריים המבוססים על centroids האזור OptimizeLineages.m מודול משימת השושלת קובע את יחסים של אמא של ניצן אופטימליים המבוססים על מרחק פיזי ואירועי ניצני עבר ובעתיד getClosestObjects.m מוצא תאים שכנים עבור כל מספר סלולרי חדש (ניצן) SelectVariables.m מדידת מבחר GUI לבחירת משתנים של עניין SelectVariables.fig פריסת חלון GUI SelectVariables GeneratePlots.m שרטוט GUI עבור נתונים בחלון ProcessTimeSeries GeneratePlots.fig פריסת חלון GUI GeneratePlots AnalyzeCellSeries.m מודול ניתוח סדרת הזמן קובע זמן חלוקת תא ותא מדידות פלטי שלמים כמתואר בטקסט assignDivisionsInf2.m מקצה ניצן לנבוט וזמני חלוקת תא AnalysisParams.m קלט ניתוח סדרת זמן תא פרמטר AnalysisParams.fig פריסת חלון GUI AnalysisParams זן מזהה גנוטיפ (מבוסס W303) עיון Y47 MAT LEU2 :: ADH1pr-CFP-hisG :: URA3 :: kanR :: hisG 19 Y962 MAT ADE + NHP2 :: RFP-NAT spl2Δ :: LEU2 pho4 :: TRP1 pho84Δ:: Klura3 phm4 :: HIS3MX6 leu2Δ :: TEF1m7pr-PHO4ΔP2-tetR-cYFP URA3 :: 7xtetOpr-CFP 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול לעיל מתאר שיטה פשוטה לקבל ולנתח את נתוני סדרת זמן הקרינה עם ניסיון מוגבל במיקרופלואידיקה או בפיתוח תוכנה. זה מאפשר לאדם להשיג סרטי הקרינה זמן לשגות של תאי שמרים בודדים; לחלץ גודל תא רלוונטי ומדידות ביטוי; מעקב כומר ומטלות שושלת, ולנתח את ההתנהגות של תאים שלמים לאורך זמן באמצעות מכשיר microfluidic תרבות זמין מסחרי ומשתמש גרפי תכליתי ממשק (GUI). בעוד ניסיוני, פילוח, ומעקב אחר צעדים כבר פנו בדרכים שונות בעבר 11,13,14, ההליך הנ"ל נועד להפוך את הטכניקות הללו לנגישים יותר לקבוצת משנה רחבה יותר של קהילת הביולוגיה. בעוד ההליך הנ"ל הוא מותאם למכשיר microfluidic תרבות מסוים, הכולל ניתוח יכול להיות מותאם למכשירים דומים כמו טכנולוגיות תרבות microfluidic המדף-להיות זול יותר ויותר להתאמה אישית. Fundamentally, הפילוח ומדידת אלגוריתמי אזור אנו מעסיקים דומים לשיטות קיימות 13,14, אבל התוכנה שתלי מוסיפה את היכולת לאצור חזותי אזור ומעקב משימות שושלת ולהקצות שלבי מחזור תא בצורה מדויקת. שתי תכונות אלו הן קריטיות לחישוב מדויק בזמן הנגזרים של סדרת נתונים.
ישנם מספר צעדים בפרוטוקול אשר להשפיע באופן משמעותי את האיכות של נתוני סדרת הנתונים. בתחילה עומס יתר חדר התרבות עם תאים יקטן זלוף בתא (בולט במיוחד בניסויים קינטיים בי קאמרי זמן הרענון הוא חשוב), ויתר יתרחש מוקדם יותר במהלך זמן הניסוי. זה יכול להיות הכי טוב להימנע על ידי התחלה עם לחץ העמסת תא תחתון לזמנים קצרים יותר ולהגדיל אחד או שניהם בהדרגה עד שצפיפות תאים מתאימה מושגת. בחירת מיקום במה להדמיה היא consid קשורה והחשובה באותה מידהeration. ידיעת זמן ההכפלה של המתח, התכנית כמה תאים יהיה בתמונה המסגרת לאורך זמן ולצפות כיצד תשפיע על צפיפות דיפוזיה תקשורת. עשרה תאים פזורים יגדלו לעשרה microcolonies, אבל עשרה תאים מקובצים יחד בתחילה יגדלו לתוך מושבה אחת, גדולה (יש לנו לב מגבלות תזונתיות בדיפוזיה 6 PSI למרכז מושבה, כאשר הוא גדול מ ~ 14 תאים בקוטר) . מאמץ נוסף בשלבי פרוטוקול הזרם גם מקל על אוצרות נתונים ידני מאוחר יותר, ומשפר את סדרת זמן הפלט. להבטיח את הצלחת מותקנת היטב בבמה ולהשתמש באפשרות רישום התמונה בGUI FormatData כדי לשפר את הדיוק בהרבה במעקב אחר תאים בודדים באופן אוטומטי בזמן. לבזבז זמן בבחירת פרמטרי הפילוח הטוב ביותר האפשריים גם כדי להפחית את מספר הטעויות הדורשות תשומת לב. תוכנת המעקב עובדת הכי טובה עם oversegmentation הקל של אזורים סלולריים ולא בגלל undersegmentation remergingתא מפוצל הוא משימה פשוטה יותר מציור קווים לחלק את האזורים, עם זאת, oversegmentation המוגבר מגדיל שגיאות במטלות שושלת בשל נוכחותם של אזורי שווא, חדשים. יתר על כן, כדי להיות בטוח שכל מערכות יחסים של אמא של הניצן מוקצים כראוי כך שמדידות לתא כולו תהיה מדויקות. אם ניצן הוא החמיץ ידי הפילוח או גדל מחוץ לגבולות התמונה, לשקול סיום סדרת הנתונים של האמא כדי למנוע תוצאות מזויפות. זה נעשה בקלות על ידי שינוי אזור אמא למזהה ייחודית (להזין את המזהה של "0") במסגרת השגויה, ושימוש באפשרות "מחק הכל" התכונה כדי להסיר כל המופעים העתידיים של הזהות החדשה. תשומת לב לשלבים הבאים יגדיל משמעותי את הדיוק של נתוני זמן סדרת הגלם.
כדי לבסס את הפרשנות חוקית של פלט נתונים על ידי לחיצה על "ניתוח סדרת זמן", אנו ממליצים כמה חקירות נוספות. ודא הופעת ניצן ופעמי חילוק מדויק נקבע על בסיס משתמש inpuפרמטרים t. באופן ידני להקליט פעמים ניצנים וחטיבה לסט סרט מבחן ולהשוות את התוצאות לאלגוריתם. להעריך חזותי cytokinesis הזמן משלים בין אם ובת, לחפש גבולם צר ולהכהות. (הערה:. מתח בדיקה עם עזרי גרעין fluorescently שמסומנים בתצפית ידנית של זמן חלוקת שיטה נוסף תהיה fluorescently שיסמן את קרום הפלזמה ולחפש את הפער בין תאים אם ובתה לסגירה.). כמו כן, לבדוק האם הקרינה הכוללת לתא טוב יותר, מחושבת כממוצע עוצמת האזור כפול הנפח (כאשר אור שנתפס מקורו חתך דק של התא), או כקרינה משולבת על האזור (כאשר אור שנתפס מקורו כל התא). אם פרופיל הקרינה על פני תא תואם את העקומה של חצי אליפסה שתוארה על ידי הצירים הראשיים ומשניות של האזור 7, אור נלכד מקורו בכל התא, וסך הקרינה should יחושב כ( כלומר העצמה) X (אזור). במקרה שלנו ב63X עם עומק השדה הרבה פחות מגובה התא, פרופיל הקרינה הוא שטוח יחסית וקרינה כוללת מחושבת כ( העצמה ממוצעת) X (נפח). שיקול נוסף הוא photobleaching של fluorophore. תוכנה אינה רואה photobleaching בניתוח, ולכן פלט סדרת זמן הקרינה מייצג רק את הכתב הנצפה. תהליכי photobleaching תלויים במידה רבה על הגדרות הרכישה ומרווח זמן המשמש להשגת תמונות הקרינה, אופי fluorophore ופרמטרים ניסוי ספציפי שונים אחרים. Photobleaching גם לא יכול להיות מתואר היטב על ידי ביטוי פשוט, מסדר ראשון שיעור, המונע אלגוריתם כללי לטיפול בה. לפיכך, אנו לא מדברים על photobleaching בפלט סדרת הזמן, אבל השיטה אנליטית ניתן להשתמש כדי למדוד את הקינטיקה של תהליך זה כדי לסייע לפרשנותו של המשתמש. לבסוף, בחר smoothiהפרמטרים ng מתאימים לסדרת הזמן נצפתה. באופן אידיאלי, את splines ההחלקה יבטל רעש מדידה בתדירות גבוהה, תוך שמירה על תכונות אמיתיות בנתונים. הפרמטרים הדרושים כדי להשיג את זה תלוי במאפיינים של סדרת זמן המסוימת ועשויים להשתנות בין ניסויים.
התוכנה נועדה להיות גמיש לניתוח של נתונים שונים מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות. כל מספר של ערוצי צבע יכול להיות כלול וכל עשוי לשמש ליצירת מסיכה תת אזור. בעוד האלגוריתמים לעבוד גם עבור סרטים של תאי שמרי ניצנים, רבים של הפונקציות צריכים לחול על סרטים של אורגניזמים אחרים גם כן. מדידת אזור (למעט נפח), מעקב, ואוצרות לסמוך רק על מסכת התא וכך הם ישימים. הפילוח, הקצאת שושלת, נחישות חלוקת תא, ומודולים ניתוח סדרת זמן יכולים להיות שונה באופן עצמאי כדי להתאים לצרכימים ספציפיים. בנוסף, במקום להשתמש se הכלולמודול gmentation, סרט מסיכה מראש מפולח יכול להיות קלט, וניתן להחליף תמונות עם ניגודיות הפרעות שלב בניגוד או ההפרש לשדה בהיר. GUIs לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר ובעיקר לאצור מזהה ומטלות שושלת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לאמילי ג'קסון, יהושע זיידמן, וניקולס רן להערות על התוכנה. עבודה זו מומנה על ידי GM95733 (לNM), 103,316 BBBE וקרנות הזנק (MIT לNM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Y04C Yeast Perfusion Plate | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Microfluidic Perfusion Platform | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Cascade II EMCCD camera | Photometrics | ||
| Lumen 200 metal-halide arc lamp | PRIOR Scientific | ||
| Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set | Chroma Technology Corp | set #89006 | Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato) |
| MAC 5000 controller and filter wheels | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | 64-bit version handles large data files better than 32-bit |
References
- Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J.
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).
- Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332 (6028), 472-474 (2011).
- Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J.
- Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. , Submitted (2013).
- Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5 (9), e239 (2007).
- Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024 (2005).
- Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).
- Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3 (1), e1468 (2008).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).
- Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).
- To, T. -L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).
- O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271 (5246), 209-212 (1996).
- Raser, J. M., O'Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).
