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Neuroscience

胰蛋白酶精华协议分析视网膜血管小鼠模型

doi: 10.3791/50489 Published: June 13, 2013

Summary

胰蛋白酶的消化是一个最常用的方法来分析视网膜血管。这份手稿中详细介绍的方法,包括关键的改动,优化技术,并删除无血管组织,同时保持整体架构的船只。

Abstract

胰蛋白酶消化的金标准方法来分析视网膜血管1-5。它允许对整个网络的可视化的复杂的三维视网膜血管和通过创建一个二维的平面安装的血管通道互连消化后的非血管成分的视网膜毛细血管。这使得一个研究各​​种病理血管的变化,如微血管瘤,毛细血管变性,内皮细胞异常周细胞比率。然而,该方法在技术上具有挑战性的,特别是在老鼠,这已成为最广泛使用的动物模型来研究视网膜因为遗传操作便于6,7。在小鼠眼,这是特别困难的,以完全除去非血管的组件,同时保持视网膜血管的整体结构。到今天为止,我有一个文学缺乏详细描述胰蛋白酶消化技术n的鼠标。这份手稿提供了详细的一步一步的方法在小鼠视网膜中的胰蛋白酶消化,同时也提供了如何解决困难的步骤。

Introduction

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可视化的视网膜血管解剖各种眼科疾病,如糖尿病性视网膜病变的机制,是一个非常重要的方法。它允许一个评估最早的血管异常,包括微血管瘤,毛细血管变性,和周细胞损失8,9。到今天为止,已经有几个技术分析视网膜血管。已用于各种染料灌注突出的船只,但是都共享了类似的限制。注射很少强调除非整个视网膜血管在高压下,破裂的风险和损坏的船只1。血管内皮细胞的免疫染色荧光标记ĝ凝集素B4(共轭的Alexa Fluor 594; I21413; Invitrogen公司; 1:100稀释)和视网膜平面坐骑可以突出整体建筑的船只,但没有详细的可视化毛细血管基底膜和周。有人指出由Friedenwald的船只可以突出碘酸-希夫(PAS)或苏木精伊红(H&E)染色10平坐骑染色的视网膜。然而,染色呈非特异性的船只,以及突出的无血管组织,使其难以区分的船只。在20世纪60年代,科根和桑原开发的胰蛋白酶消化技术,使得它更容易显现视网膜血管消化的非血管成分的视网膜1。自那时以来,胰蛋白酶消化已成为金标法分析血管视网膜2-5。然而,重要的是要注意到,已经描述了其他替代技术的隔离的血管。渗透裂解的使用已被用于隔离的血管,并允许生化研究的组织11,12,但没有被使用作为一个主要的解剖学研究方法的程序。组织印刷方法一直用来隔离微血管和大段,允许学习能力的脉管13日电紧张的架构。从理论上讲,这种技术也可以用来研究解剖变​​化,作为船舶的质量是高的。但是,它是仅能够分离出整个血管网络段。虽然这些方法不能代替胰蛋白酶消化,重要的是要注意,它们具有不同的优点和缺点,在这方面是互补的。

胰蛋白酶消化法在技术上具有挑战性,并很难执行一致6,7。此外,人们已经注意到,胰蛋白酶消化的小鼠模型上是特别困难的,尤其是当一个人渴望保护视网膜6,7整体的血管结构。挑战包括:(1)在消化的视网膜,造成损失的脉管系统,以及无血管组织,(2)在消化,需要广泛的机械清扫继而可能导致损伤血管床,(3)分离度不佳导致非特异性染色血管的无血管组织。几个手稿都强调这些挑战,但都没有提供详细和一致的协议来克服他们14,15。这份手稿将引进一步一步的方法,详细介绍了具体处理特别困难的步骤提示进行胰蛋白酶消化小鼠和大鼠视网膜技术。 图1中所示的示意性概述。

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Protocol

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1。视网膜准备

  1. Enucleate老鼠的眼睛。用一只手,打开眼睑,使眼可见。用另一只手,用弯钳(弯朝上),适用于上方和下方的压力方面的轨道直到截止突出。轻轻关闭钳在连续运动enucleate眼睛眼睛后方面解除。
  2. 修复眼用10%中性福尔马林缓冲液中至少24小时。
  3. 将眼PBS溶液在小培养皿。
  4. 在显微镜下仔细解剖视网膜,照顾,以避免引起大的眼泪。清扫剪刀在角膜上切。然后,一边拿着截面积直钳,用剪刀剪沿边取出角膜的角膜和巩膜。使用细的曲线和直线镊子,小心剥离巩膜和脉络膜相差的对视神经视网膜。这一步需要耐心快速释放的视网膜,可导致流泪。取下镜头和任何多余的虹膜和视网膜16的碎片。

2。水冲洗

  1. 在24孔盘和盖水(约500微升,与至少一个45微米的过滤器过滤)将视网膜。
  2. 每30分钟1小时换一次水,至少4-5次。
  3. 发布在水中过夜,在室温下轻轻摇动。

注意: 洗涤步骤是非常重要的,因为它们有助于从血管神经视网膜层分离。

3。胰蛋白酶文摘

  1. 除去水,并培育的视网膜,在3%的胰蛋白酶(1:250 Difco公司)在0.1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH为7.8)的溶液中在37℃下温和无摇晃。胰蛋白酶消化完毕,当组织开始解体的迹象(约1.5小时)。
    注意: 避免快速晃动因为这可能会损坏血管。
  2. 小心地用移液器出胰蛋白酶到一个单独的使用显微镜避免接触视网膜。这多余的胰蛋白酶后,可用于操纵船舶时,在显微镜下,在第4.3步。

4。分离血管

  1. 过滤后的水加入到视网膜。然后,尝试将与钳内界膜剥离,如有必要,用剪刀。摇匀,用温和搅拌5分钟。小心,移液管的水,在显微镜下,以避免损坏视网膜。
  2. 重复水洗(各5分钟),以帮助网络的船只从附着的视网膜组织。时,很少有没有剩余碎片在水中洗净后,水冲洗完成。
  3. 在解剖显微镜下小心的操作,现在需要到进一步释放船只的网络。下面是一些有用的技术,它可用于在序列或尾学生职业建构基于技术的偏好,以达到期望的结果:
    1. 用200μl移液器,小心吸取水和上下相邻的船只,吹水在血管,引起温柔的搅拌。
    2. 使用200μL吸管,吸液管的胰蛋白酶和帮助大衣墙壁吸管。然后,小心吸取整个血管网和一次有助于打破无血管组织。
      注意: 上面的视神经血管网络的边缘而不是中心的移液管尖,也能防止血管粘到顶端。
    3. 用细镊子轻轻提起血管离开了水的,撞出非血管成分。
    4. 如果上述步骤不起作用,加胰蛋白酶对视网膜,帮助分解组织,并在37°C孵育几分钟。然后,消除胰蛋白酶和重复步骤4.1-4.3。

<>注意一定要会接触到的所有工具,胰蛋白酶(如移液器吸头,镊子)船舶涂层。这将有助于避免血管粘连设备。

5。可视化的血管

  1. 将一个干净的玻片上一滴水。用200μl吸管或镊子,转移消化的船只入水。确保血管平面式展现水的表面张力,有助于开展现在透明的血管网络,如果组织不展开,添加额外的水,轻轻摇晃滑动,以方便展开。
  2. 非常缓慢吹打或使用纸巾去除多余的水分。
  3. 允许的幻灯片完全晾干。
  4. 通过相应的协议与PAS /苏木或H&E染色的染色幻灯片。
    注意:PAS /苏木是有用的吞吐量血管壁和细胞的细胞核,H&E染色是很有用的d执行示范以及红细胞。
  5. 脱水和装入(安装介质Permount)。

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Representative Results

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一个成功的程序的最终产物是一台安装了整个网络的小鼠视网膜血管,维持的体系结构,与PAS /苏木素或H&E染色, 图2-4中所示。 如图3所示,可以看出,内皮细胞和周细胞的明显分化。在视网膜,内皮细胞的细胞核中是椭圆形或细长的,并完全位于血管壁内的。周细胞的细胞核小,呈球形,密集的染色,一般有一个突起的位置沿毛细血管壁。

胰蛋白酶消化是一种常见的血管病变在糖尿病动物模型的过程来分析。病理血管病变,如微血管周细胞的鬼(周细胞损失的证据),无细胞毛细血管和毛细血管变性已被描述的db / db小鼠在看到毛细血管变性,模型型图4显示了一个例子。 II型糖尿病。虽然该程序是优化的小鼠的视网膜,类似的结果也被获得,如在图5中示出在大鼠视网膜。重要的是要注意,大鼠视网膜大得多,和一个12孔板被使用,而不是一个24孔板。大鼠视网膜的血管网络也比鼠标相对不那么脆弱。

这是极为关键的无血管组织尽可能多地去除。任何残留物会导致非特异性染色,导致较差的血管可视化。 图6表示不成功的去除,例如,在步骤4中,整个无血管组织。同样,它也是重要的是有视网膜上展开安装时,以改进可视化的血管图7表示不成功,在步骤5.1中的血管的台座开展。

如图1“FO:内容宽度=”5.75in“FO:SRC =”/ files/ftp_upload/50489/50489fig1highres.jpg“SRC =”/ files/ftp_upload/50489/50489fig1.jpg“/>
图1。示意图的胰蛋白酶精华协议:(1) 视网膜上下游隔离眼视网膜(2) 水洗 :洗,过滤后的水过夜;(3)的胰蛋白酶精华:孵育3%胰蛋白酶在37°C为1-1.5小时; (4) 分离血管:分离通过一系列水洗涤和解剖显微镜下进行血管;(5)移动脉管滑动并让干燥;(6) 可视化的脉管系统:染色幻灯片PAS或H&E,脱水和安装。 点击这里查看大图

图2
图2。控制DB /米小鼠胰蛋白酶消化(H&E,20倍)。这个数字是视网膜血管网络显示正常血管结构的概述。

图3
图3。控制分贝/米小鼠胰蛋白酶消化(H&E,600X)。这是一个放大的视图在图2中示出正常的血管结构的视网膜。 (白色箭头)内皮细胞和周细胞(黑色箭头)突出显示。

图4
图4。糖尿病的db / db小鼠胰蛋白酶消化(H&E,500X),52周,开始发展db / db小鼠血管病变,如毛细血管变性(白色箭头)。

图5
图5。正常大鼠视网膜胰蛋白酶消化,(PAS,20倍的[α],100倍并[b])。一个正常的大鼠血管网络的概述和放大图像。

图6
图6。控制C57/BL6小鼠胰蛋白酶消化,无血管组织完好(H&E,20倍[],100X [B])。去除不良的无血管组织,有非特异性染色损害的船舶可视化。

图7
图7。控制分贝/米小鼠胰蛋白酶消化,不良的安装(H&E染色,20倍)。如果视网膜不能充分展开,有不足之处的血管网络的可视化。

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Discussion

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胰蛋白酶的消化是一个标准的方法,以评估视网膜的血管。不幸的是,它在技术上具有挑战性,如果没有正确执行,并可能导致在标本亏损率很高。此外,在小鼠体内的过程是特别困难的,可以限制这一技术的应用在常用眼疾基因动物模型。本文提供了关于如何执行程序的有效和一致的小鼠眼睛的指导。

在协议中,有几个关键步骤。首先,它是至关重要的,视网膜仔细解剖出,以避免任何大的眼泪,以确保血管网完好无损。其次,过滤后的水洗涤视网膜中过夜是很重要的,因为它有助于血管,这有利于更容易分离胰蛋白酶消化后视盘层分开。一个修改型式中,可以加快这一进程。将放置在视网膜中的1%的三吨X-100在过滤后的水混合1-2小时。然后,胰蛋白酶消化可以当天进行一系列的水后,清洗去除仓鼠十

重要的是,在视网膜组织中的胰蛋白酶消化过程中不断进行监测,以避免无意的血管组织溶解。根据我们的经验,约1-1.5小时足以完成消化,神经组织,同时保持血管完好。年轻小鼠需要的时间就越少。轻轻摇动可以在胰蛋白酶消化,以帮助促进从剩余组织的血管分离,但不是必需的。重要的是要避免的,因为这会导致撕裂船舶强烈搅拌。

最需要关注的关键步骤涉及胰酶消化后分离的血管。进行水洗时,它是重要的,以避免移液脉管。移液器脉管系统只应作为分离的血管的壁后已被被涂覆,用胰蛋白酶的方法的使用。所有的操作需要做解剖显微镜下仔细船只网络可以很容易损坏。在步骤4中描述的不同的技术可以成功地用于在各种各样的组合。最终,这将是由个别的实验者,以找到最适合他们的方法。重要的是,所有的工具,将接触到血管涂用胰蛋白酶。工具间歇性和经常浸在手术过程中的胰蛋白酶,可以防止粘连血管和潜在的破坏。

的程序的功效也依赖于背景的小鼠模型。有些鼠标背景是不利于维护整个血管网。例如,FVB背景为磷酸二酯酶-6突变是纯合的,使他们容易产生重tinal变性17。从我们的经验,我们发现,他们的视网膜血管是本质上更脆弱,我们无法维护整个血管网。因此,重要的是,背景予以考虑尝试这种技术之前。

最终,这个程序的主要限制是一个人的解剖技能。重要的是要注意,即使个别人知道的技术,它可能需要多次尝试才开始获得一致的结果。因此,我们建议有兴趣的实验室的工作人员进行一些实践解剖,以获得信心和最好的和最稳定的方法到达之前执行的程序在他们的实验组织。重要的是要注意的是,一旦掌握,胰蛋白酶消化是一个有价值的技术,可用于评估血管病变( 图4)。胰蛋白酶消化,也可以成功执行cessfully保存视网膜固定液已经在几年1。

总之,胰蛋白酶消化仍然是一个非常有用的方法来分析视网膜血管Cogan的桑原在20世纪60年代以来的描述。它允许整个血管网络的详细可视化,较免疫荧光/ H&E / PAS染色切片,平面安装和染料注射。虽然在技术上是困难的,这个手稿中详细描述了该过程,以便它可以被成功执行。因此,我们希望调查新手的方法将有足够的指导,允许在他们的实验模型的视网膜血管的成功和持续的分析。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争经济利益。

Acknowledgments

部分支持这项工作是由NIH RO1 EY019951(AAF),伊利诺伊州防盲协会(JCC,AAF),无限制的资金从研究到眼科部防盲(RPB),纽约和RPB医学学生团契格兰特(JCC)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
10% neutral buffered formalin Fischer Scientific SF100-4
Trypsin (1:250) Amresco 0458-50G Make 3% trypsin in 0.1 M Tris
TRIZMA base Sigma T1503-1KG Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C)
TRIZMA Sigma T3253-500G
Steritop sterile vacuum bottle Millipore SCGPS05RE Create filtered water
EQUIPMENT
Dissecting microscope Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)
Straight scissors Fine Science Tools 15024-10 Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm
Straight Forceps (Inox) Dumont #5 11252-20 Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm
Curved Forcepts (Dumostar) Dumont #7 11297-10 Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator Precision Scientific BDG59442 Shaker optional
24-well dish Falcon 353047
Microscope Slides VWR 82027-132

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References

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Cite this Article

Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model. J. Vis. Exp. (76), e50489, doi:10.3791/50489 (2013).More

Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model. J. Vis. Exp. (76), e50489, doi:10.3791/50489 (2013).

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