Trypsin fordøjelse er en af de mest almindeligt anvendte metoder til at analysere retinal vaskulatur. Dette håndskrift beskrives metoden i detaljer, herunder centrale ændringer for at optimere teknikken og fjerne ikke-vaskulære væv og samtidig bevare den overordnede arkitektur af skibene.
Trypsin digest er guld standard metode til at analysere den retinale kar 1-5. Den tillader visualisering af hele netværket af komplekse tredimensionale retinale blodkar og kapillærer ved at skabe en todimensional flade-mount sammenkoblede vaskulære kanaler efter fordøjelse af ikke-vaskulære komponenter af nethinden. Dette gør det muligt at undersøge forskellige patologiske vaskulære ændringer, såsom mikroaneurismer, kapillær degeneration og abnorm endotel til pericyt forhold. Men den metode er teknisk udfordrende, især i mus, som er blevet den mest udbredte dyremodel til at studere nethinden på grund af den lette genetiske manipulationer 6,7. Hos mus øje, er det særligt vanskeligt helt at fjerne ikke-vaskulære komponenter, samtidig med at den samlede opbygning af retinale blodkar. Til dato er der en mangel på litteratur, der beskriver trypsin digest teknikken i detaljer in musen. Dette håndskrift giver en detaljeret trin-for-trin metode af trypsin digest i muse nethinden, og samtidig give tips om fejlfinding vanskelige skridt.
Visualisere vaskulaturen af nethinden er en ekstremt vigtig at dissekere de mekanismer af forskellige øjensygdomme, såsom diabetisk retinopati. Det tillader en at vurdere de tidligste vaskulære abnormiteter, herunder mikroaneurismer, kapillær degeneration og pericyt tab 8,9. Til dato har der været flere teknikker udviklet til at analysere den retinale vaskulatur. Perfusion af forskellige farvestoffer er blevet brugt til at fremhæve de skibe, men alle har delt lignende begrænsninger. Injektion sjældent fremhæver hele retinal vaskulatur medmindre gives på et højt pres, hvilket risikerer brud og beskadige fartøjer 1.. Immunofarvning af vaskulær endotel med fluoroforen-mærket G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 konjugeret, I21413, Invitrogen, 1:100 fortynding) og nethinde flade mounts kan fremhæve den overordnede arkitektur af skibene, men uden nærmere visualisering af kapillærer, kælderen membraner og pericytter . Det blev bemærket afFriedenwald at fartøjer kan fremhæves ved farvning flat-mounts af nethinden med periodisk syre-Schiff (PAS), eller hematoxylin og eosin (H & E) farvning 10.. Men farvning var ikke-specifik for skibene og fremhævede den ikke-vaskulære væv samt, hvilket gør det vanskeligt at skelne skibene. I 1960'erne udviklede Cogan og Kuwabara trypsin fordøje teknik, der gjorde det nemmere at visualisere den retinale kar ved at fordøje nonvascular komponenter af nethinden 1.. Siden dengang er trypsin fordøje blevet den gyldne standard metode til at analysere kar i nethinden 2-5. Men det er vigtigt at bemærke, at andre alternative teknikker til at isolere vaskulaturen er blevet beskrevet. Anvendelsen af osmotiske lysis er blevet anvendt til at isolere vaskulaturen og tillade biokemiske undersøgelser af væv 11,12, men proceduren er ikke blevet anvendt som en primær metode til anatomisk undersøgelse. Vævet print-metoden har væretanvendt til at isolere store segmenter af mikrovaskulaturen og giver mulighed for at studere electrotonic arkitektur karrene 13.. I teorien kunne denne teknik også anvendes til at studere anatomiske ændringer, da kvaliteten af de fartøjer, er høj. Men det er kun i stand til at isolere segmenter af hele vaskulatur netværket. Selv om disse metoder ikke kan erstatte trypsin fordøjelse, er det vigtigt at bemærke, at de har forskellige fordele og ulemper og er komplementære i denne henseende.
Trypsin Digest metode er teknisk udfordrende og er vanskelig at udføre konsekvent 6,7. Desuden er det blevet bemærket, at trypsin fordøjelse er særlig svært på en musemodel, især hvis man ønsker at bevare den samlede vaskulære arkitektur af nethinden 6,7. Udfordringer omfatter (1) over-fordøjelse af nethinden, der forårsager tab af både kar såvel som ikke-vaskulært væv, (2) under-fordøjelse, kræveromfattende mekanisk dissektion, som kunne føre til en beskadigelse af fartøjet seng, (3) dårlig adskillelse af den ikke-vaskulære væv fra vaskulaturen fører til ikke-specifik farvning. Adskillige håndskrifter har fremhævet disse udfordringer, men ingen har givet et detaljeret og konsekvent protokol at overvinde dem 14,15. Dette håndskrift vil indføre en trin-for-trin metode beskriver teknikken til at udføre trypsin fordøje på mus og rotter nethinder med specifikke tips om håndtering af de særligt vanskelige skridt. En skematisk oversigt er vist i figur 1..
Trypsin fordøjelse er en standardmetode til vurdering vaskulaturen af nethinden. Desværre er det teknisk udfordrende og kan resultere i høj prøve tab, hvis ikke udført korrekt. Desuden procedure er særlig vanskelig i mus, hvilket kan begrænse anvendelsen af denne teknik i de almindeligt anvendte genetiske dyremodeller for øjensygdomme. Dette papir giver vejledning om, hvordan du udfører proceduren effektivt og konsekvent i mus øjne.
Der er flere kritiske trin i protokol…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Society for forebyggelse af blindhed (JCC, AAF), frie midler til Department of Ophthalmology fra forskning til at forebygge blindhed (RPB), NY og RPB Medical Student Fellowship Grant (JCC).
REAGENTS | |||
10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
EQUIPMENT | |||
Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
24-well dish | Falcon | 353047 | |
Microscope Slides | VWR | 82027-132 |