Summary

Tripsina Digest protocollo per analizzare la vascolarizzazione della retina di un modello murino

Published: June 13, 2013
doi:

Summary

Tripsina digest è uno dei metodi più comunemente utilizzati per analizzare vascolarizzazione retinica. Questo manoscritto descrive il metodo in dettaglio, comprese le alterazioni fondamentali per ottimizzare la tecnica e rimuovere il tessuto non vascolare preservando l'architettura generale dei vasi.

Abstract

Tripsina digest è il metodo gold standard per analizzare la retina vascolare 1-5. Permette la visualizzazione di tutta la rete di vasi complessi tridimensionali sanguigni e capillari retinici creando una bidimensionale TV a monte dei canali vascolari interconnessi dopo digestione dei componenti non vascolari della retina. Questo permette di studiare le varie alterazioni patologiche vascolari, come microaneurismi, degenerazione capillare e abnorme endoteliali ai rapporti di periciti. Tuttavia, il metodo è tecnicamente impegnativo, soprattutto nei topi, che sono diventati il modello animale più ampiamente disponibile per studiare la retina a causa della facilità di manipolazioni genetiche 6,7. Nell'occhio topo, è particolarmente difficile da rimuovere completamente i componenti non vascolari mantenendo l'architettura complessiva dei vasi sanguigni della retina. Ad oggi, vi è una carenza di letteratura che descrive la tecnica tripsina digest in dettaglio in il mouse. Questo manoscritto fornisce una metodologia dettagliata passo-passo della tripsina digest nel topo retina, fornendo anche suggerimenti sulla risoluzione dei passaggi difficili.

Introduction

Visualizzare la vascolarizzazione della retina è un approccio estremamente importante per sezionare i meccanismi delle varie malattie oculari come la retinopatia diabetica. Essa permette di valutare le prime anomalie vascolari, tra cui microaneurismi, degenerazione dei capillari, e perdita pericyte 8,9. Ad oggi, sono state sviluppate diverse tecniche per analizzare la vascolarizzazione della retina. Perfusione di vari coloranti è stato utilizzato per evidenziare i vasi, ma tutti hanno condiviso limitazioni simili. Iniezione evidenzia raramente l'intero sistema vascolare della retina a meno dato ad alta pressione, che rischia di rompersi e danneggiare le navi 1. Immunostaining dell'endotelio vascolare con fluoroforo marcato G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 coniugato; I21413, Invitrogen; diluizione 1:100) e monta piatti della retina può evidenziare l'architettura complessiva dei vasi, ma senza la visualizzazione dettagliata di capillari, membrane basali e periciti . È stato osservato dallaFriedenwald che le navi possono essere evidenziate dalla colorazione piatta-monti della retina con acido periodico di Schiff (PAS) o ematossilina ed eosina (H & E) colorazione 10. Tuttavia, la colorazione era non-specifico ai vasi ed evidenziato il tessuto non vascolare pure, rendendo difficile distinguere i vasi. Nel 1960, Cogan e Kuwabara sviluppato la tecnica tripsina digest che ha reso più facile visualizzare la vascolarizzazione della retina da digerire componenti non vascolari della retina 1. Da quel momento, la tripsina digest è diventato il metodo gold standard nell'analisi della vascolarizzazione della retina 2-5. Tuttavia, è importante notare che altre tecniche alternative per isolare il sistema vascolare sono stati descritti. L'uso di lisi osmotica è stato usato per isolare il sistema vascolare e consentire studi biochimici del tessuto 11,12, ma la procedura non è stata utilizzata come metodo primario per studio anatomico. Il metodo di stampa dei tessuti è statautilizzato per isolare ampi segmenti microcircolo e permette la capacità di studiare l'architettura elettrotoniche del sistema vascolare 13. In teoria, questa tecnica potrebbe essere utilizzata anche per studiare i cambiamenti anatomici, come la qualità dei vasi è elevata. Tuttavia, è solo in grado di isolare segmenti della intera rete vascolare. Sebbene questi metodi non possono sostituire tripsina digest, è importante notare che essi hanno diversi vantaggi e le carenze e sono complementari a questo riguardo.

Il metodo digest tripsina è tecnicamente impegnativo e difficile da eseguire in modo coerente 6,7. Inoltre, è stato notato che la tripsina digest è particolarmente difficile in un modello di topo, in particolare quando la si vuole preservare l'architettura complessiva vascolare della retina 6,7. Sfide includono (1) sopra-digestione della retina che causa la perdita sia del sistema vascolare così come il tessuto non vascolare, (2) sotto-digestione, richiedendodissezione estesa meccanico che porterebbe al danneggiamento del letto recipiente, (3) scarsa separazione del tessuto non vascolare dalla vascolatura conseguente colorazione aspecifica. Diversi manoscritti hanno evidenziato queste sfide, ma nessuno ha fornito un protocollo dettagliato e coerente per superarli 14,15. Questo manoscritto introdurrà una metodologia step-by-step dettaglio la tecnica per eseguire la tripsina digest su topo e ratto retine con consigli specifici su come gestire i passaggi particolarmente difficili. Una panoramica schematica è mostrata in Figura 1.

Protocol

1. Preparazione della retina Enucleare l'occhio mouse. Con una sola mano, aprire le palpebre in modo che l'occhio è visibile. Con l'altra mano, utilizzando una pinza curva (curva rivolta verso l'alto), applicare una pressione su aspetti superiore e inferiore dell'orbita fino sporge globo. Chiudere delicatamente forcipe nel lato posteriore dell'occhio e sollevare in un movimento continuo di enucleare l'occhio. Fissare gli occhi con il 10% formalina tamponata neutra per al…

Representative Results

Il prodotto finale di una procedura di successo è una TV a monte di tutta la rete del mouse vascolarizzazione della retina, con l'architettura mantenuto, colorate sia con PAS / ematossilina o H & E, come mostrato nelle figure 2-4. Chiara differenziazione delle cellule endoteliali e periciti può essere visto come mostrato in Figura 3. Nella retina, i nuclei delle cellule endoteliali sono ovali o allungata e si trova interamente all'interno della parete del vaso. Nuclei peri…

Discussion

Tripsina digest è un metodo standard per valutare la vascolarizzazione della retina. Purtroppo è tecnicamente impegnativo e può causare elevato tasso di perdita di campione, se non eseguite correttamente. Inoltre, la procedura è particolarmente difficile nei topi, che può limitare l'applicazione di questa tecnica nei comunemente utilizzati modelli animali genetici di malattie oculari. Questo documento fornisce una guida su come eseguire la procedura efficace e coerente con gli occhi del mouse.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Società per la Prevenzione della Cecità (JCC, AAF), i fondi non vincolati al Dipartimento di Oftalmologia di ricerca per prevenire la cecità (RPB), NY e RPB Medical Student Fellowship di Grant (CCM).

Materials

      REAGENTS
10% neutral buffered formalin Fischer Scientific SF100-4  
Trypsin (1:250) Amresco 0458-50G Make 3% trypsin in 0.1 M Tris
TRIZMA base Sigma T1503-1KG Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C)
TRIZMA Sigma T3253-500G
Steritop sterile vacuum bottle Millipore SCGPS05RE Create filtered water
      EQUIPMENT
Dissecting microscope     Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)
Straight scissors Fine Science Tools 15024-10 Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm
Straight Forceps (Inox) Dumont #5 11252-20 Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm
Curved Forcepts (Dumostar) Dumont #7 11297-10 Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator Precision Scientific BDG59442 Shaker optional
24-well dish Falcon 353047  
Microscope Slides VWR 82027-132  

References

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Cite This Article
Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model. J. Vis. Exp. (76), e50489, doi:10.3791/50489 (2013).

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