Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Karakterisering van inflammatoire reacties tijdens intranasale kolonisatie met Streptococcus pneumoniae

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/50490
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecule Medicine, McMaster University

Summary

Kolonisatie van de muriene nasopharynx met Streptococcus pneumoniae en de daaropvolgende extractie van aanhangende of gerekruteerde cellen wordt beschreven. Deze techniek omvat het spoelen van de nasopharynx en het opvangen van de vloeistof door de nares en is aanpasbaar voor verschillende uitlezingen, waaronder differentiële celkwantificering en analyse van mRNA-expressie in situ.

Abstract

Nasofaryngeale kolonisatie door Streptococcus pneumoniae is een voorwaarde voor invasie in de longen of bloedbaan1. Dit organisme is in staat om het mucosale oppervlak van de nasopharynx te koloniseren, waar het kan verblijven, zich kan vermenigvuldigen en uiteindelijk gastheerverdediging kan overwinnen om andere weefsels van de gastheer binnen te dringen. Het vaststellen van een infectie in de normaal lagere luchtwegen resulteert in longontsteking. Als alternatief kunnen de bacteriën zich verspreiden in de bloedbaan die bacteriëmie veroorzaakt, wat gepaard gaat met hogesterftecijfers 2, of anders rechtstreeks leiden tot de ontwikkeling van pneumokokken meningitis. Het begrijpen van de kinetiek van en immuunresponsen op nasofaryngeale kolonisatie is een belangrijk aspect van S. pneumoniae-infectiemodellen.

Ons muismodel van intranasale kolonisatie is aangepast aan menselijke modellen3 en is gebruikt door meerdere onderzoeksgroepen in de studie van gastheer-pathogene reacties in de nasopharynx4-7. In het eerste deel van het model gebruiken we een klinisch isolaat van S. pneumoniae om een zelfbeperkende bacteriële kolonisatie vast te stellen die vergelijkbaar is met vervoergebeurtenissen bij menselijke volwassenen. De hierin beschreven procedure omvat de bereiding van een bacterieel entmateriaal, gevolgd door de vaststelling van een kolonisatiegebeurtenis door levering van het entmateriaal via een intranasale toedieningsweg. Ingezeten macrofagen zijn het overheersende celtype in de nasopharynx tijdens de steady state. Meestal zijn er weinig lymfocyten aanwezig in niet-geïnfecteerde muizen8, maar mucosale kolonisatie zal leiden tot laag- tot hoogwaardige ontsteking (afhankelijk van de virulentie van de bacteriële soort en stam) die zal resulteren in een immuunrespons en de daaropvolgende rekrutering van gastheerimmuuncellen. Deze cellen kunnen worden geïsoleerd door een lavage van de tracheale inhoud door de nares, en gecorreleerd met de dichtheid van kolonisatiebacteriën om de kinetiek van de infectie beter te begrijpen.

Protocol

Voordat u begint: alle stappen worden uitgevoerd in een Biohazard Level 2 (BSL2) Biological Safety Cabinet (BSC), tenzij anders vermeld. Zorg ervoor dat u de juiste Biohazard-goedkeuring hebt verkregen voor het gebruik van infectieuze bacteriële pathogenen volgens de institutionele richtlijnen voorafgaand aan de start van de experimenten. Zorg er bovendien voor dat u over alle materialen en reagentia beschikt die nodig zijn om de procedure vooraf uit te voeren. Muizen die in deze experimenten werden gebruikt, omvatten vrouwelijke C57BL/6-muizen van Jackson Laboratories, Charles River of Taconic en waren 10-14 weken oud (hoewel we geen genderafhankelijke significante verschillen hebben gevonden in kinetiek van nasale kolonisatieklaring of infectie). Alle muizen die in deze experimenten werden gebruikt, werden gefokt en onderhouden onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden en waren vrij van veel voorkomende virussen (LCMV, MNV, MPV, reovirus ECTV en andere) bacteriën(bijv. H. pylori)en parasieten(bijv. pinworm, ectoparasieten) door fecale monstertests en frequente anatomische beoordeling van schildwachtmuizen die in hun faciliteitsruimten waren ondergebracht. Bij het uitvoeren van deze experimenten raden we aan om controlemuizen te gebruiken die niet jonger zijn dan 10-12 weken en niet ouder zijn dan 6 maanden. Muizen jonger of ouder dan deze leeftijdscategorie zijn vatbaarder voor langere nasofaryngeale vervoersduur en verhoogde kans op verspreiding van infectie. Muisachtergrond is een andere belangrijke overweging die van invloed kan zijn op de resultaten van een kolonisatie-experiment, omdat verschillende groepen hebben aangetoond dat muizen met verschillende genetische achtergronden verschillende gevoeligheid hebben voor de S. pneumoniae D39 (serotype 2) stam9,10. S. pneumoniae is geen natuurlijk voorkomende muriene ziekteverwekker en het enige natuurlijke reservoir is de menselijke nasopharynx. Overdracht vindt plaats via ademhalingsdruppels en omdat muizen geen respiratoire afscheidingen produceren, kunnen individuele muizen de bacterie niet overbrengen op andere muizen, dus er is geen bezorgdheid over overdracht van muis naar muis11. Voor een visueel overzicht van de procedures die in dit manuscript worden beschreven, verwijzen wij u naar figuur 1.

1. Voorbereiding van S. pneumoniae Cultuur

  1. Ent 5 ml tryptische soja-agar in voor de suspensiegroei van Streptococcus pneumoniae.
  2. Kweek onder statische omstandigheden bij 37 °C in 5% CO2 totdat het bacteriële entmateriaal de groei van de logfase bereikt met een overeenkomstige vloeistofdichtheid van 108 KVE/ml zoals bepaald door een kilometerteller ingesteld op 600 nm. De exacte meting die overeenkomt met deze KVE zal verschillen afhankelijk van de specifieke geselecteerde bacteriestam; voor de meeste stammen van S. pneumoniae komt dit overeen met een OD600 bereik van 0,45-0,55. Meestal zullen S. pneumoniae stammen in vloeibare cultuur groeien tot deze dichtheid binnen 1,5-2,5 uur onder de aanbevolen omstandigheden, zonder subculturing. De cultuur mag niet overgroeien (verder dan een OD-waarde van 0,75), omdat dit het punt vertegenwoordigt waarop de bacteriën niet langer in de groeifase van de logfase zijn en uitgebreide autolyse ondergaan.
  3. Elke muis wordt ingeënt met ongeveer 107 bacteriën. Daarom, voor elke 9 muizen die gekoloniseerd moeten worden, pipetteer 1 ml entmateriaal in een Eppendorf-buis en draai gedurende 1 minuut op 15.000 x g. Een witachtige pellet moet zichtbaar zijn. Verwijder het supernatant, zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort en resuspend de bacteriën in 100 μl fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), waardoor de concentratie wordt verhoogd tot 109 KVE/ml. In dit stadium moeten de bacteriën levensvatbaar blijven, maar zullen ze zich niet gemakkelijk repliceren.
  4. Als u meerdere aliquots gebruikt, combineer dan in één buis om te controleren op kleine variaties in de bacteriële dichtheid tussen de monsters.
  5. Houd bacteriën op ijs tot ze klaar zijn voor inenting, gedurende maximaal 1 uur.
  6. Om een exact bacterieel aantal te verkrijgen, voert u log-wise seriële verdunningsreeksen uit die beginnen met net bacteriële entmateriaal. Verdun serieel 10-voudig en voeg 10 μl steriel PBS toe tot 90 μl.
  7. Plaat uit 3 druppels van 10 μl monsters van verdunningen 10-5 - 10-9, plus een PBS-only contaminatie controle, op afzonderlijk gelabelde secties van tryptic soja agar (TSA) plaat aangevuld met 5% schapenbloed (Figuur 2). Zorg ervoor dat pipettips voor elke stap worden verdunnen van een hogere CFU-concentratie naar een lagere CFU-concentratie om te voorkomen dat overtollige bacteriën worden overgedragen en de variabiliteit van de resultaten toeneemt. Human blood agar (HBA) platen kunnen ook worden gebruikt in plaats van TSA. Aangezien veel stammen van S. pneumoniae resistent zijn tegen neomycine (van 5-20 μg/ml), kan dit antibioticum ook worden toegevoegd aan het agarmedium naar keuze tijdens de plaatvoorbereidingsfase. Dit vergemakkelijkt de opsomming omdat het niet-resistente bacteriën elimineert. De gevoeligheid van antibiotica voor elke stam moet vooraf worden getest om de optimale concentratie antibiotica te bepalen die voor elke bacteriële stam moet worden gebruikt.
  8. Laat 15-30 minuten onbedekt drogen, dek vervolgens platen af en plaats ondersteboven in bacteriële incubator ingesteld op 37 °C en 5% CO2. Groei bacteriële kolonies op plaat voor 24 uur.
  9. Bepaal het aantal kolonievormende eenheden en hun overeenkomstige concentratie. Op basis van de bepaling van de OD600-waarde moet de concentratie binnen het bereik van 1-4 x 109 KVE/ml liggen. S. pneumoniae-kolonies moeten verschijnen als kleine, cirkelvormige kolonies met een geelachtig beige kleur, met een kleine depressie in het midden waardoor ze een donutachtig uiterlijk krijgen (Figuur 3).

2. Murine Intranasale Kolonisatie

  1. Houd muizen vast door ze in een muisremapparaat te plaatsen (een gemodificeerde Falcon-buis van 50 ml met de punt afgesneden om een opening te creëren) en ze met de duim aan de basis van hun lichaam vast te zetten, zodat hun neuzen gewoon uit het taps toelopende uiteinde van het beveiligingsapparaat komen (Figuur 4). Het gebruik van dit apparaat maakt immobilisatie van het hoofd van de muis en segregatie van zijn nares mogelijk op een manier die beweging minimaliseert en pogingen van het dier belemmert om de pipetpunt te mastiekeren, waardoor de entbuis volledig kan worden geleverd. Als alternatief kunnen muizen worden geïmmobiliseerd door schuren in de nek en handmatige terughoudendheid. We raden anesthesie van de dieren niet aan voorafgaand aan intranasale inenting. Het beheer van het entmateriaal aan dieren onder narcose resulteert in een deel van het entmateriaal dat zich naar de longen verspreidt12,13.
  2. Gebruik een P10- of P20-pipet ent elke muis in door 10 μl van de bereide cultuur af te zetten en gelijkmatig over beide nares te verdelen (laat het entmateriaal in de neus druppelen door de inenting geleidelijk te pulseren, waardoor muizen de tijd nemen om in entmateriaal in te ademen). Om volledige levering van het entmateriaal te bereiken, pauzeer de toediening op elk moment dat de muis zijn neus overmatig begint te bewegen. Het hele entmateriaal mag niet in de nares worden geïnjecteerd, omdat de muizen tijdens de uitademing sommige door de neus kunnen verdrijven; omdat de verdreven hoeveelheid echter de neiging heeft minuscuul te zijn en het entmateriaal een extreem hoge hoeveelheid bacteriën bevat, heeft dit geen significante invloed op de koloniserende bacteriële belasting. Bovendien is het oppervlak dat beschikbaar is voor kolonisatie in het nasofaryngeale slijmvlies beperkt en daarom hebben wij en anderen ontdekt dat de aanbevolen dosis van 107 voldoende is om consistente niveaus van bacteriën bij alle muizen te verkrijgen, wat resulteert in minimale variabiliteit in initiële hoeveelheden koloniserende bacteriën14,15 .
  3. Weeg muizen als u gewichtsindicatoren gebruikt als onderdeel van uw eindpuntbewaking. Bewaak muizen elke 12-24 uur op klinische symptomen, waaronder lethargie, ruches en gewichtsverlies. Muizen zullen meestal pas 3-5 dagen na kolonisatie symptomen van ziekte vertonen, en deze zullen worden voorafgegaan door gewichtsverlies, wat gemiddeld ongeveer 5% van het totale lichaamsgewicht per dag kan bedragen. Naarmate de muizen steeds zieker worden, zullen ze gebochelde houdingen aannemen en verminderde activiteit en verminderde reactie op stimulatie vertonen, inclusief behandeling. In dit stadium is ziekte meestal indicatief voor sepsis en/of longontsteking en zal waarschijnlijk terminaal zijn, hoewel muizen dagelijks met 1 ml onderhuidse zoutoplossing kunnen worden behandeld om de resultaten te verbeteren. Overlevende muizen zouden na dag 7 na kolonisatie verbetering moeten vertonen, zoals blijkt uit stabilisatie van het gewicht gevolgd door gewichtstoename, hoewel verschillende stammen van S. pneumoniae sneller ziekte kunnen veroorzaken en kunnen resulteren in progressie van klinische symptomen langs een andere tijdslijn. Zie figuur 5 voor een representatief resultaat van het gewicht dat wordt bijgehouden bij muizen die gekoloniseerd zijn met de P1547-stam.

3. Nasale Lavage Sample Collection

Voor aanvang: bereid gekanuleerde naalden met 1 ml spuiten afgedekt met 26 3/8 G afgeschuinde naalden. Snijd 2,5 cm stukken PE20 polyethyleen buizen met een binnendiameter van 0,38 mm, zodat elk uiteinde een afgeschuinde punt heeft. Schuif met een tang een 2,5 cm lang stuk PE20 polyethyleen slang (binnendiameter 0,38 mm) op de naaldpunt, om te voorkomen dat de buiszijde wordt doorboord. Gekneneerde naalden kunnen tot het nodig is in 70% ethanol worden bewaard.

  1. Euthanaseer experimentele muizen. Aangezien cervicale dislocatie de luchtpijp kan beschadigen, moet deze methode van euthanasie worden vermeden. Onze voorkeursmethode is isofluraan anesthesie gevolgd door exsanguinatie, maar zorg ervoor dat u de institutionele richtlijnen volgt bij het selecteren van de wijze van euthanasie.
  2. Steriliseer met 70% waterige ethanol de superoanteriorbont van het dier, met name de nek, en zorg ervoor dat ethanol geen toegang krijgt tot de nares.
  3. Maak een enkele longitudinale snede langs de middellijn van de nek van het dier en twee horizontale sneden aan beide uiteinden, waardoor een opening ontstaat om de luchtpijp voor te stellen.
  4. Pel de huid voorzichtig naar beide kanten terug en laat het nekweefsel eronder zien.
  5. Luchtpijp moet zichtbaar zijn, omgeven door longitudinale spieren aan weerszijden. Knip deze zorgvuldig door om een duidelijk zicht op de luchtpijp zelf te geven en zorg ervoor dat de omliggende vasculatuur niet wordt doorsnijden.
  6. Als de vasculatuur is doorgesneden en er bloed aanwezig is, laat het bloeden dan stoppen voordat u doorgaat, en reinig het gebied vervolgens meerdere keren door steriel PBS te doseren en steriel gaas te gebruiken om overtollig vocht in het gebied voorzichtig op te nemen.
  7. Zodra de luchtpijp goed is blootgesteld, maakt u een dwarse, semilunar sneed in de luchtpijp ongeveer halverwege (Figuur 6).
  8. Maak 1.000 μl gesteriliseerde PBS in eerder bereide cannulated naald.
  9. Steek de canule in de luchtpijp naar de neus toe, waarbij de afgeschuinde rand naar beneden wordt gericht voor het inbrengen (figuur 7). Zodra de naald op zijn plaats zit, draait u deze 180° en sondet u voorzichtig naar boven totdat u lichtbestendigheid voelt.
  10. Plaats Eppendorf aangewezen voor monsterverzameling net onder de neus van de muis.
  11. Test de juiste plaatsing van de naald door een minimale (~ 20 μl) hoeveelheid PBS-lavagevloeistof te doseren - er moet een druppel vloeistof rond de nares van de muis ontstaan; als dit het geval is, gaat u verder met stap 3.13).
  12. Als test PBS rechtstreeks uit de mond van het dier komt, trek dan de canule naar achteren en herpositioneer door opnieuw voorzichtig naar voren te tasten totdat een zeer lichte weerstand wordt gevoeld - zorg ervoor dat u de canule niet te ver voorbij deze weerstand duwt, omdat u deze langs het neusgehemelte en door naar de mondholte beweegt.
  13. Doseer de inhoud van de naald snel om te helpen verplaatsen en verzamel maximale hoeveelheid cellen - de inhoud moet door de nares van de muis en in de verzamelbuis stromen. Plaats het monster onmiddellijk op ijs.
  14. Herhaal stap 3.8-3.13) met een gekantelde naald met 500 μl RNA-lysisbuffer op dezelfde muis om monsters te verzamelen voor RNA-analyse. Hierdoor kan een lysaatmonster worden verzameld uit de resterende celpopulaties, grotendeels samengesteld uit het nasofaryngeale mucosale epitheel, omdat niet-adherente cellen hadden moeten worden verwijderd na de eerste PBS-lavage. Houd er rekening mee dat de RNA-lysisbuffer het epitheel zal denude en het omliggende weefsel zal vernietigen, dus zorg ervoor dat contact met organen zoals de longen wordt vermeden, als het behoud van deze weefsels gewenst is. Eenmaal verzameld, plaatst u het monster in de RNA-lysisbuffer direct op droog ijs om te bevriezen. Eenmaal in de lysisbuffer kunnen monsters worden opgeslagen volgens de instructies van de fabrikant en zijn ze gedurende enkele maanden stabiel bij -70 °C.

4. Bepaling van bacteriële belasting in de Nasopharynx

  1. Kwantificeer bacteriën door een seriële verdunningsreeks voor elk murien neusspoelingsmonster voor te bereiden. Over het algemeen kan worden verwacht dat de bacteriële belasting tussen 0-104 KVE zal zijn, en daarom drie 10-voudige seriële verdunningen uitvoeren. Voeg 10 μl van het nette neusspoelingsmonster (100 KVE/ml) toe aan de eerste buis tot een concentratie van 10-1 KVE/ml. Vortex grondig.
  2. Verdeel de bacteriologische plaat in kwadranten en labelkwadranten met elk een lid van de verdunningsreeks (100-10-3 KVE/ml). Plaat uit 3 druppels van 10 μl monsters van de 3 verdunningen en het nette monster op tryptische soja agar platen aangevuld met 5% schapenbloed, zoals in figuur 2.
  3. Laat 15-30 minuten onbedekt drogen, dek vervolgens platen af en plaats ondersteboven in bacteriële incubator met optimale omstandigheden voor bacteriegroei (meestal 37 °C en 5% CO2).
  4. Groei bacteriële kolonies op plaat voor 18-24 uur.
  5. Bepaal het aantal koloniserende bacteriën door de kolonies die voor elke verdunning op de plaat zijn gevormd, te gemiddelden (figuur 3). Figuur 8 toont bacteriële dichtheid tijdens verschillende tijdspunten, zoals bepaald door de cultuur van neusspoeling, bij muizen gekoloniseerd met 3 verschillende stammen van S. pneumoniae gedurende maximaal 21 dagen.

5. Voorbereiding van monsters voor flowcytometery

Voor aanvang: Bereid een mix van antilichamen voor. Voor kwantificering van leukocytenpopulaties raden we de volgende mix aan bij de gespecificeerde verdunningen: PE-Ly6G (kloon 1A8, 1 μg/ml), FITC-Ly6C (kloon AL-21,1 μg/ml), eFluor 450-CD45 (kloon 30-F11, 2,67 μg/ml), APC-F4/80 (kloon PM8 0,67 μg/ml), PerCP-Cy5,5-CD11c (kloon N418 RUO, 0,5 μg/ml), PE-Cy7-CD11b (kloon M1/70, 0,33 μg/ml), Alexa Fluor 700-CD3 (kloon 1782, 4 μg/ml), eFluor 605NC-CD4 Houd er rekening mee dat deze mix 2x in concentratie is (zie stap 5.5). Alle antilichamen moeten worden verdund in FACs Wash buffer (0,5% foetale kalfsserum, 2mM EDTA, 0,1% natrium azide in PBS) die ook vooraf moet worden bereid. In een mengsel van isotypegematchte controleantistoffen, idealiter van dezelfde leverancier als de gelabelde antilichamen en in dezelfde concentraties als de specifieke antilichamen, moet worden bereid. De monsters die met de isotypecontroleantistoffen worden behandeld, zullen als negatieve controle fungeren. Eventuele fluorescentie die wordt waargenomen in de monsters die met de isotypecontroleantistoffen worden behandeld, moet als achtergrond worden beschouwd.

  1. Prechill een centrifuge die 1,5 ml Eppendorf-buizen tot 4 °C kan draaien.
  2. Centrifugeer neusspoelingsmonsters bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Pipetteer supernatant voorzichtig uit en reserveer. Opmerking: vanwege de kleine hoeveelheid cellen in de nasopharynx zal de celkorrel niet zichtbaar zijn tenzij er ongewenste rode bloedcelverontreiniging is, die rood zal zijn. Als dit wordt gezien, moet het monster worden weggegooid.
  3. Resuspend monster in 50 μl Fc? RIIb/CD16-2 (2.4G2) antilichaam (dat Fc-receptoren bindt en niet-specifieke antilichaambinding vermindert) in FACs Wash Buffer bij een concentratie van 4 μg/ml.
  4. Incubeer het monster gedurende 30 minuten op ijs.
  5. Voeg 50 μl voorgeprepareerde 2x geconcentreerde fluorescerende antilichaammix toe aan het monster. Zet een representatief monster van elke experimentele groep opzij om als isotypecontrole te fungeren. Voeg de isotype antilichaammix toe aan dit monster in plaats van de vlekmix.
  6. Incubeer monster op ijs gedurende 1 uur.
  7. Centrifugeer monsters bij 2.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Gooi supernatant en resuspend weg in 200 μl PBS.
  8. Herhaal stap 5.7.
  9. Na de tweede wasbeurt opnieuw centrifugeermonsters bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  10. Resuspend in PBS (indien onmiddellijk lopend monster) of 2% paraformaldehyde (bij lopende monsters 1-3 dagen na de kleuring).
  11. Verzamel bij het uitvoeren van flowcytometrie de maximale hoeveelheid gebeurtenissen per monster of totdat het hele monster is aangezogen. Bij niet-geïnfecteerde, gezonde, jonge muizen zal dit slechts 1.000-2.000 totale gebeurtenissen zijn; Tijdens een bacteriële kolonisatiegebeurtenis kan dit aantal meer dan 2 tot 5 keer toenemen, afhankelijk van de ziektestatus bij dieren en factoren zoals leeftijd en genetische achtergrond. Figuur 9 toont representatieve flow cytometrie resultaten verzameld van een 3-laser Becton Dickenson LSRII flow cytometer met behulp van een Forward Scatter van 450 en Side Scatter van 300, hoewel we raden aan om parameters te optimaliseren voor de specifieke flow cytometer die u van plan bent te gebruiken voorafgaand aan het verzamelen van monsters. Opmerking: als een monster zelfs sporen van bloedverontreiniging bevat, zullen de totale verzamelde gebeurtenissen aanzienlijk hoger zijn dan verwacht en moet het monster worden verdisconteerd uit de analyse.

6. Kwantitatieve PCR (qPCR) Analyse van Nasale Lavages

  1. Ontdooicel lyseert vanaf stap 3.14 kamertemperatuur.
  2. Volg het aanbevolen protocol dat bij de gewenste RNA-extractie naar keuze wordt geleverd.
  3. Na voltooiing van de RNA-extractieprocedure zoals geïnstrueerd, kwantificeer u de hoeveelheid RNA met behulp van een spectrofotometer of elektroforesemethode (figuur 10). We verkrijgen routinematig tussen 975 en 3.250 ng totaal RNA per monster met een 260/280 nm verhouding van >1,7 of een RNA integriteitsgetal (RIN) rond, 8,1±0,13.
  4. Transcriber cDNA met behulp van de M-MULV Reverse Transcriptase volgens het protocol van de fabrikant met 1.000 ng RNA (maximaal 13 μl).
  5. Verdun de resulterende cDNA-monsters 8x en aliquot gelijkmatig in 4 afzonderlijke buizen voor langdurige opslag bij -20 of -80 °C.
  6. Om genexpressie door qPCR te meten, bereidt u 25 μl monstersreacties voor in drievoud op ijs of koud blok met: 12,5 μl 2x qPCR mastermix uit qPCR-kit naar keuze, 0,25 μl referentiekleurstof, 2 μl verdund cDNA (stap 7,5), 1 μl gemengde voorwaartse en omgekeerde primers (400 nM-finale), 2 μl verdund cDNA (stap 7,5), 1 μl gemengde voorwaartse en omgekeerde primers (400 nM-finale), 9 Dit protocol is een aanpassing van eerder gepubliceerde methoden16.
  7. Over het algemeen vinden we dat een qPCR-versterking in twee stappen ( 95 °C gedurende 10 minuten gevolgd door maximaal 40 cycli x [95 °C x 15 sec, 60 °C x 1 min]) effectief is (figuur 11a); elk primerpaar moet echter worden geoptimaliseerd. Dissociatiecurven moeten na versterking worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat er geen niet-specifieke versterking optreedt. versterking (figuur 11b)
  8. We voeren routinematig standaardcurves uit voor elk geanalyseerd gen, evenals een standaardkalibrator (afgeleid van long- of milthomogenaat) voor elke geanalyseerde 96-putplaat. Relatieve transcripthoeveelheden worden verkregen door eerst de grenswaarden voor de ruwe cyclusdrempel (Ct) te normaliseren door de referentiekleurstof en de resulterende waarden door de respectieve standaardcurve te transformeren. Deze relatieve hoeveelheden worden vervolgens genormaliseerd naar de standaard kalibrator en een huishoudelijk gen, indien van toepassing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 geeft een overzichtsschema weer met een samenvatting van de belangrijkste stappen van het protocol. De figuren 2-3 geven een visualisatie van de microbiologische methodologie die inherent is aan de hierin beschreven protocollen. Figuur 4 staat voor een juiste positionering van een muis om een intranasale kolonisatie uit te voeren, terwijl figuur 5 typisch veranderingen in gewicht weergeeft van muizen gekoloniseerd met S. pneumoniae stam P1547. Figuren 6-7 vertegenwoordigen specifieke stadia van het neusspoelingsgedeelte van het proces, voor geassisteerde visualisatie van deze twee technieken. De figuren 8-11 bestaan uit representatieve resultaten van analyses die zijn uitgevoerd op monsters die zijn verzameld uit de nasopharynx van een muis na neusspoeling. In het bijzonder is figuur 8 een representatief resultaat van bacteriële belasting in de nasopharynx, zoals bepaald door cultivering van neusspoeling verkregen van muizen gekoloniseerd met S. pneumoniae stam P1121, P1547 of P1542. Figuur 9 vertegenwoordigt celfenotypering van geïsoleerde nasofaryngeale immuuncellen met behulp van flowcytometrische technieken. De figuren 10-11 geven representatieve resultaten weer met betrekking tot de expressionele analyse van nasofaryngeale mRNA via kwantitatieve PCR.

Figure 1
Figuur 1. Stroomdiagram van de intranasale inenting en nasale lavage celisolatieprocedures met behulp van een muismodel. Eerst worden de bacteriën voorbereid op inenting en vervolgens intranasaal aan muriene proefpersonen gegeven. Nadat de gewenste tijd is verstreken, worden muizen geëuthanaseerd via terminale bloeding en worden hun nasofaryngeale cellen geïsoleerd via twee neusspoelingsstappen: een PBS-wasstap gevolgd door een secundaire wasbeurt in RNA-lysisbuffer. De cellen uit de voorlopige PBS-was worden geïsoleerd en geanalyseerd met behulp van flowcytometrietechnieken, terwijl RNA geïsoleerd van het tweede monster kan worden gebruikt om de relatieve overvloed aan moleculen van belang op transcriptieniveau te onderzoeken.

Figure 2
Figuur 2. Om de bacteriële concentratie te bepalen, worden 10 μl druppels in drievoud geplateerd op een plaat verdeeld in secties die een andere seriële verdunning vertegenwoordigen. Deze druppels mogen dan drogen en de platen worden 's nachts geïncubeerd bij 37 °C, 5% CO2.

Figure 3
Figuur 3. Concentratie van Streptoccous pneumoniae geïsoleerd uit de nasopharynx van een representatief dier. Elke afzonderlijke kolonie vertegenwoordigt één kolonievormende eenheid, elke verzameling kolonies vertegenwoordigt één druppel van 10 μl (geplateerd in drievoud) en elk kwadrant op de plaat vertegenwoordigt een afzonderlijke seriële verdunning. De bacteriële concentratie wordt bepaald in CFU/ml door het aantal telbare, volledig gevormde kolonies binnen en vervolgens tussen in aanmerking komende kwadranten te gemiddelden.

Figure 4
Figuur 4. De beweging van elke te inenten muis moet worden geminimaliseerd, met name in de nek, om een goede afgifte van bacterieel entmateriaal mogelijk te maken. Om dit te bereiken, wordt de muis van het onderwerp vastgehouden in een aangepast beperkingsapparaat dat bestaat uit een Falcon-buis van 50 ml met een opening aan het taps toelopende uiteinde. De muis wordt vervolgens zo geplaatst dat zijn neus uit het diafragma komt, waar hij toegankelijk is voor de onderzoeker, waardoor intranasale inenting kan worden uitgevoerd.

Figure 5
Figuur 5. Gewicht van muizen gekoloniseerd met stam P1547 uit minimaal 2 representatieve experimenten die dagelijks worden bijgehouden na de eerste inenting (n=6) om typische gewichtsveranderingen weer te geven die worden verwacht na nasofaryngeale kolonisatie. Gewicht wordt weergegeven als een procentuele verandering van het begingewicht. Let op het verwachte scherpe initiële gewichtsverlies gezien tussen dag 3-5, gevolgd door stabilisatie en geleidelijke toename van het gewicht bij overlevende muizen.

Figure 6
Figuur 6. Bij blootstelling aan de luchtpijp worden flankerende longitudinale spieren zorgvuldig verwijderd voorafgaand aan de luchtpijpincisie op een manier die de omliggende bloedvaten niet ernstig maakt. Een kleine, semilunar incisie wordt dan halverwege de luchtpijp gemaakt met behulp van een fijne chirurgische schaar. Het is belangrijk om de diameter van de luchtpijp slechts gedeeltelijk door te snijden, waardoor deze achterste tijd intact blijft.

Figure 7
Figuur 7. Inbrengen van de geknuleerde naald in de luchtpijpopening naar boven naar de neus. Zodra canule op zijn plaats is, sonde voorzichtig totdat de weerstand is bereikt en spoel vervolgens de inhoud door de nares.

Figure 8
Figuur 8. Een representatieve reeks bacteriële belasting geïsoleerd van de nasopharynx met behulp van de nasale lavage procedure beschreven na kolonisatie van C57BL/6 muizen (driehoeken) met S. pneumoniae stam P1547 (A), P1542 (B) of P1121 (C). Een vergelijkende kolonisatie van BALB/C muizen (cirkels) na P1121 kolonisatie wordt ook weergegeven in (C). Verschillende tijdspunten worden getoond tijdens de kolonisatie, waaronder dag 3, 7, 14 en 21. Over het algemeen wordt een hoge initiële belasting verwacht op dag 3, met weinig afname op dag 7. Klaring wordt meestal geïnitieerd door dag 14, met volledige of bijna volledige klaring die wordt aangetoond door dag 21 na kolonisatie met de meeste stammen. Klik hier om grotere figuur te bekijken.

Figure 9
Figuur 9. Representatief histogram (A) en puntplot (B) van totale cellen geïsoleerd uit muriene neusspoeling zoals geanalyseerd door flowcytometrie. De differentiële expressie van markers op celpopulaties maakt de identificatie van leukocytensubgroepen mogelijk door het gebruik van fluorescerende antilichamen gericht tegen deze eiwitten. Zoals hier wordt getoond, worden leukocytenpopulaties geselecteerd door eerst op singletcellen te gaten met behulp van een Forward Scatter (area) versus Forward Scatter (breedte) gate (A), en vervolgens te verrijken voor CD45+ cellen binnen die subset (B). Deze populatie kan verder worden onderverdeeld in specifieke celtypen door gating voor CD11b en Ly6G dubbel positieve neutrofielen (C). Analyse van de CD11b-populatie kan worden uitgevoerd om F4/80+, CD11b-macrofagen (D) of CD11b-, CD3- en CD4-dubbelpositieve CD4 T-cellen (E) te onthullen. Celpopulaties kunnen worden fenotyped zolang ze er een uitdrukken, of een combinatie van verschillende unieke oppervlaktereceptoren die kunnen worden gebruikt om ze te onderscheiden van andere celtypen. Klik hier om grotere figuur te bekijken.

Figure 10
Figuur 10. Representatief elektroferogram na elektroforese automatische sequencing van een monster geïsoleerd uit muriene neusspoeling. Het resulterende elektroferogram toont de kwantificeringsgegevens en de karakteristieke handtekening van een hoogwaardig totaal RNA-monster afkomstig van het nasofaryngeale gebied. Bij het uitvoeren van analyses van het totale RNA worden de gebieden onder de RNA-pieken voor de twee belangrijkste ribosomale RNA, 18S en 28S, gebruikt om hun overeenkomstige verhouding te berekenen. Significante veranderingen in de ratio's van pieken toe te schrijven aan 18S en 28S zijn doorgaans indicatief voor gedegradeerde RNA. De mate van degradatie kan worden samengevat met RNA-integriteitsnummer (RIN); het RIN voor dit representatieve monster is 8.1. Een voorbeeld van sterk gedegradeerd RNA wordt weergegeven in (B) en (C), en de daaropvolgende RIN is respectievelijk 1,9 en 4,6. Klik hier om grotere figuur te bekijken.

Figure 11
Figuur 11. Versterkingsplot (A) en dissociatiecurve (B) van qPCR-analyse van neuswascellysaten, die een voorbeeld geven van hoe deze twee uitlezingen er meestal uit moeten zien na een efficiënte en correct gedetecteerde versterking van mRNA-producten geïsoleerd van de muriene nasopharynx. Vertegenwoordigd is een standaardcurve voor het huishoudgen 18S. De resultaten weergegeven in (A) tonen het gewenste PCR-product na versterking met primers tegen GAPDH. De lijn vertegenwoordigt de cyclusdrempel (Ct). Het punt waarop de versterkingspercelen die overeenkomen met verschillende monsters deze drempel overschrijden, maakt het mogelijk om over de monsters heen te vergelijken, waarbij lagere waarden die overeenkomen met hogere hoeveelheden RNA van belang daarin zijn opgenomen. Uit het perceel onder (B) blijkt dat de maximale smelttemperatuur van het qPCR-product 85 °C bedraagt en dat er in deze reactie geen vervuilende producten aanwezig zijn, die zouden verschijnen als een extra piek gescheiden van de gewenste productpiek. Klik hier om grotere figuur te bekijken.

Stamnaam Serotype Virulentie Sterfte bij muizen Verwachte kolonisatieduur
P1121 23F Asymptomatisch 0% 21-28 dagen
P1542 4 laag 0-20% 21-28 dagen
P1547 6A midden 20-50% 14-21 dagen
D39 2 hoog 70-100% 14-21 dagen

Tabel 1. Een tabelvormig overzicht van 4 veelgebruikte S. pneumoniae klinische isolaatstammen, hun overeenkomstige serotypenummer, geassocieerde mate van virulentie, verwacht aandeel in invasiviteit binnen een gekoloniseerde subset van muizen en typische duur van een nasofaryngeale kolonisatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In deze studie presenteerden we gedetailleerde methoden voor de intranasale kolonisatie van muizen met behulp van een klinische isolaatstam van Streptococcus pneumoniae en de daaropvolgende isolatie en karakterisering van de immuuncellen die als reactie op de bacteriën worden gerekruteerd voor nasopharynx. We hebben aangetoond hoe een bacterieel entmateriaal kan worden gekweekt in voedingsrijke media en kan worden gebruikt om een kolonisatiegebeurtenis bij muizen vast te stellen, die aanvankelijk beperkt is tot de nasopharynx. We toonden vervolgens aan hoe reagerende immuunceltypen die worden gerekruteerd op nasopharynx kunnen worden geïsoleerd na blootstelling aan de luchtpijp, incisie en een neusspoeling door het gebruik van een gekonfeerde naald. Neusspoelingsmonsters kunnen in PBS worden verzameld om intacte, licht hechtende cellen te isoleren; het RNA van nauwer hechtende cellen en de omringende epitheliale mucosale laag kan worden geïsoleerd door een secundaire was aan te brengen die bestaat uit RNA-lysisbuffer. De eerste van deze monsters kan vervolgens worden gebruikt om de specifieke cellen te fenotypen die in de context van de kolonisatie worden gerekruteerd via flowcytometrietechnieken, terwijl de laatste kan worden toegepast op Q-PCR-analyse, om de effectorfuncties van deze gerekruteerde cellen te bepalen door te kijken naar de transcriptie-expressie van immuunregulatoren van belang. Neusspoelingsmonsters kunnen bovendien worden gebruikt om de kinetiek van de klaring van een bacteriële kolonisatiegebeurtenis te bepalen, waarbij verschillende experimentele groepen worden vergeleken om specifieke onderzoeksvragen te beantwoorden.

Het gebruik van deze methode van intranasale kolonisatie maakt het mogelijk om een kolonisatiegebeurtenis te vestigen die aanvankelijk beperkt is tot de nasopharynx van het dier. Elke daaropvolgende verspreiding van de bacteriën naar het bloed of de organen vindt daarom plaats als secundair aan inbreuken in de immuunafweer gelokaliseerd in het nasofaryngeale slijmvlies. De stapsgewijze progressie die door dit model wordt bereikt, weerspiegelt nauwkeuriger het proces van pneumokokkeninvasie bij mensen, waardoor men de dynamiek tussen de koloniserende bacteriën en het neusslijmvlies van de gastheer kan bestuderen - en misschien beter kan begrijpen verschuivingen in bacteriële pathogeniteit en / of gastheerimmuniteit die de ontwikkeling van de verspreiding van ziekten mogelijk maken. Dit in tegenstelling tot modellen die afzien van de oprichting van een eerste kolonisatiegebeurtenis en ervoor kiezen om invasieve ziekten afzonderlijk te bestuderen door directe levering van het bacteriële entmateriaal aan de longen via intratrachaelinstillatie, aan het bloed via vasculaire injectie of aan het peritoneum via peritoneale injectie.

Het uitvoeren van een PBS-neusspoeling na een kolonisatiegebeurtenis maakt isolatie mogelijk van niet- of licht hechtende cellen die aan de nasopharynx worden gerekruteerd, evenals alle mucosaal geassocieerde bacteriën. Opgemerkt moet echter worden dat deze techniek beperkt is omdat het geen cellen of bacteriën zal vrijgeven die tussen of onder het epitheel zijn gereisd, noch zal het het oogsten van cellen of bacteriën mogelijk maken die zijn gelokaliseerd in het nasaal geassocieerde lymfoïde weefsel (NALT), een lymfoïde orgaan waarvan is gemeld dat het een potentiële infectieplaats is na een pneumokokkenkolonisatie17,18. Als verder onderzoek van de NALT gewenst is, raden wij microdissection en verwijdering van dit weefsel groothandel voor studie na PBS nasale lavage; aangezien deze twee technieken elkaar niet uitsluiten, mogen ze op hetzelfde dier worden uitgevoerd. Vanwege de lytische en destructieve aard van de RNA-oogststap (de secundaire lavage met behulp van RNA-lysisbuffer) moet deze stap echter worden weggelaten als deze van plan is de NALT te oogsten. Hoewel de neusspoeling een minder technisch uitdagende procedure is, voor groepen die een uitgebreidere beoordeling van de bacteriële belasting willen verkrijgen die niet alleen mucosaal geassocieerde bacteriën omvat, maar ook degenen die het nasofaryngeale weefsel zijn binnengedrongen, raden we aan het nasofaryngeale weefsel te oogsten na verwijdering van het bovenste schedelbot van gekoloniseerde muizen en dissectie van het weefsel in de neusconchae, zoals beschreven door anderen19.

De aard van een opgewekte immuunrespons is afhankelijk van de interactie tussen gastheer en ziekteverwekker. Meer dan 90 serotypen van S. pneumoniae zijn tot op heden gekarakteriseerd, allemaal met verschillende niveaus van pathogeniteit en virulentiefactorexpressie, wat resulteert in differentiële prevalentie in de menselijke populatie20-23. Evenzo is bij muizen gemeld dat de omvang van en de kinetiek die gepaard gaat met de immuunrespons die wordt opgewekt als reactie op een nasofaryngeale kolonisatie afhankelijk is van de koloniserende stam zelf24. Selectie van een geschikte stam om te gebruiken voor de oprichting van een nasofaryngeale kolonisatie is dus geen triviale zaak, noch is selectie van de genetische achtergrond van de muis. Figuur 8 geeft voorbeeldgegevens die de kinetiek van de klaring van een nasofaryngeale kolonisatie van 3 verschillende S. pneumoniae stammen na intranasale kolonisatie van vrouwelijke muizen op een C57BL/6 achtergrond weergeven. Tabel 1 geeft een overzicht van de mate van virulentie en de verwachte lengte van de kolonisatietijd (bij gebruik op de C57BL/6-achtergrond) met 4 S. pneumoniae klinische isolaat stammen beschreven in de literatuur en waarvan bekend is dat ze in staat zijn om een nasofaryngeale kolonisatie vast te stellen25: de avirulent P1121 (serotype23F) 26,27 de lage virulentie P1542 (serotype 4) 28 , de mid-virulentie P1547 (serotype6A) 29-31, en de veel gebruikte, goed gebruikte, Als het experimentele doel is om een asymptomatische nasale kolonisatiegebeurtenis strikt te bestuderen zonder bijbehorende bacteriële verspreiding naar andere weefsels, raden we het gebruik van de avirulent P1121-stam aan, die wordt gekenmerkt als een krachtige kolonisator, omdat langere kolonisatiegebeurtenissen (tot 28 dagen vóór waargenomen klaring) een kenmerk van deze stam zijn. Meestal zullen muizen gekoloniseerd met P1121 geen risico lopen op invasieve ziekte en zullen ze geen klinische indicatoren van ziekte vertonen (met uitzondering van tijdelijk gewichtsverlies). De rest van de stammen moet worden gebruikt afhankelijk van de gewenste mate van virulentie en geassocieerde mortaliteit, waarbij virulentie niet de mate van infectie betekent die zich binnen een individuele muis ontwikkelt, maar eerder het aandeel muizen dat klinische tekenen van ziekte vertoont. Er moet ook worden opgemerkt dat de mate van virulentie meestal omgekeerd correleert met de lengte van de kolonisatieduur, met meer virulente stammen die voor een kortere periode koloniseren. Alle 3 de beschreven virulente stammen leiden tot mortaliteit bij muizen als gevolg van, meestal, sepsis, met fulminante pneumonie, of gelijktijdige pneumonie en sepsis die zich ontwikkelen in een subset van muizen. De verschillen in lokalisatie van invasieve bacteriën kunnen stamspecifiek zijn, omdat eerder is gemeld dat bepaalde stammen tropen vertonen voor bepaalde organen37. Bij een klein percentage van de dieren kan spontane meningitis zich ook ontwikkelen na kolonisatie. Bepaling van doodsoorzaak, evenals mate van invasiviteit, kan worden bereikt door het verzamelen van geassocieerde weefsels (longen, milt en / of hersenen) van dieren op het eindpunt. Homogenisatie van deze weefsels en daaropvolgende plating kunnen wijzen op de aanwezigheid van invasieve bacteriën en bijbehorende titers.

Een voorbeeld van een kwantificering van de bacteriële cultuurdichtheid is weergegeven in figuur 3. Als de cultuur te geconcentreerd is, groeien kolonies te dicht om individueel te worden geteld, maar kolonies afgeleid van enkele cellen kunnen worden onderscheiden als een log-wise verdunningsreeks wordt geplateerd. Het plateren van drie technische duplo's per verdunning minimaliseert de variabiliteit. Houd er rekening mee dat bij het kwantificeren van bacteriën die zijn opgehaald uit een nasale kolonisatiegebeurtenis, men coculturele verontreinigingen kan tegenkomen, die andere bacteriële soorten vertegenwoordigen die tegelijkertijd geïsoleerd zijn van de muriene nasopharynx. Als de bacteriële stam van belang bekende antibioticaresistentieën heeft (bijvoorbeeld, veel stammen van S. pneumoniae zijn resistent tegen gentamycine of neomycine tot 5 μg/ml), kan men de incidentie van verontreinigingen minimaliseren door de groeimedia aan te vullen met het antibioticum in een geschikte concentratie, waardoor de groei van verontreinigingen wordt beperkt.

Flowcytometrie kan worden gebruikt om celoppervlakmarkers op neusspoelingsmonsters te analyseren. Voor de analyse van celtypen die in het kader van een infectie worden aangeworven, kan bijvoorbeeld een mix van antilichamen die specifiek zijn voor de brutodifferentiatie van leukocyten, waaronder macrofagen (F4/80+), neutrofielen (CD11b+ en Ly6G+) en T-cellen (CD3+ en CD4+ of CD8+), worden gebruikt zoals eerder gepubliceerd . Bovendien kunnen deze analyses worden gecombineerd met flowcytometrische analyse uitgevoerd op verschillende weefsels of bloed, om immuuncelhandel tijdens een infectie beter te begrijpen. Vanwege het beperkende aantal cellen (meestal nummering in de lage duizenden) dat kan worden geïsoleerd van de nasopharynx, is het identificeren van zeldzame subsets meestal een uitdaging, hoewel onderzoekers die dit willen bereiken, moeten overwegen monsters van meerdere muizen te bundelen om de gewenste celtellingen te bereiken. Omdat een eindig aantal cellen uit dit gebied kan worden geëxtraheerd, raden we u bovendien aan deze gegevens te analyseren met betrekking tot het totale aantal cellen.

Hoewel eiwitexpressieniveaus meestal laag zijn in de nasopharynx die de mogelijkheid beperken om de eiwitproductie te bepalen, is het mogelijk om de productie van gastheermoleculen te analyseren als reactie op de koloniserende bacteriën op RNA-niveau. Om dit te bereiken, kunnen nasale lavages worden uitgevoerd met behulp van RNA-lysisbuffer in plaats van PBS, wat analyse van genexpressie mogelijk maakt. Voor qPCR-versterkingsdetectie is het belangrijk om een overeenkomstige dissociatiecurve(figuur 11)uit te voeren om ervoor te zorgen dat het juiste en gewenste product wordt gedetecteerd. Dit komt door het feit dat de test dubbelstrengs DNA detecteert, inclusief primer dimers, vervuilend DNA en PCR-product van verkeerd geannealeerde primer.

We hopen dat de hier beschreven methoden u zullen aanmoedigen om een intranasaal kolonisatiemodel toe te passen om gastheerreacties op pathogenen te bestuderen die belangrijk zijn in de context van deze onderbelichte regio. Voor bepaalde menselijke pathogenen, zoals S. pneumoniae, fungeert een voorafgaande nasofaryngeale kolonisatiegebeurtenis als een belangrijke voorloper van de daaropvolgende bacteriële verspreiding en de fatale gevolgen die kunnen volgen, inclusief voortplanting in de longen, wat kan leiden tot longontsteking, of anders tot het bloed, en resulterende bacteriëmie en septische shock. Dus door bacteriële kolonisatie in deze regio te bestuderen, kunnen we beter begrijpen hoe we het kunnen beheersen en kunnen voorkomen dat er helemaal meer ernstige pathologie optreedt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

De auteurs willen Dr. Jeffery Weiser van de Universiteit van Pennsylvania bedanken voor zijn geschenk van de klinische stammen van Streptococcus pneumoniae. Dit werk werd gefinancierd door de Canadian Institutes for Health Research. CV werd gefinancierd door een M.G. DeGroote fellowship en een fellowship van de Canadian Thoracic Society. Dit werk werd gefinancierd door de Ontario Lung Association en Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Het werk in het Bowdish laboratorium wordt mede ondersteund door het Michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research en het McMaster Immunology Research Centre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1 ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bogaert, D., de Groot, R., et al. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
  2. Kadioglu, A., Weiser, J. N., et al. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
  3. McCool, T. L., Cate, T. R., et al. The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage. J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).
  4. Nelson, A., Roche, A. M., et al. Capsule enhances pneumococcal colonisation by limiting mucus-mediated clearance. Infect. Immun. 75, 83-90 (2007).
  5. van Rossum, A., Lysenko, E., et al. Host and bacterial factors contributing to the clearance of colonisation by Streptococcus pneumoniae in a murine model. Infect. Immun. 73, 7718-7726 (2005).
  6. Barocchi, M. A., Ries, J., et al. A pneumococcal pilus influences virulence and host inflammatory responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2857-2862 (2006).
  7. Malley, R., Henneke, P., et al. Recognition of pneumolysin by Toll-like receptor 4 confers resistance to pneumococcal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1966-1971 (2003).
  8. McCool, T. L., Weiser, J. N. Limited role of antibody in clearance of Streptococcus pneumoniae in a murine model of colonization. Infect. Immun. 72, 5807-5813 (2004).
  9. Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69 (1), 426-434 (2001).
  10. Jeong, D., Jeong, E., et al. Difference in resistance to Streptococcus pneumoniae infection in mice. Lab Anim. Res. 27, 91-98 (2011).
  11. Wu, H. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  12. Southam, D. S., Dolovich, M., et al. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position. Lung Physiol. 282, 833-839 (2002).
  13. Miller, M. A., Stabenow, J. M., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
  14. Briles, D. E., Novak, L. Nasal Colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73 (10), 6945-6951 (2005).
  15. Wu, H. -Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  16. Mo, Y., Wan, R., et al. Application of reverse transcription-PCR and real-time PCR in nanotoxicity research. Methods Mol. Biol. 926, 99-112 (2012).
  17. Kuper, C. F., Koornstra, P. J., et al. The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Trends Immunol. 13, 219-224 (1992).
  18. Zhang, Q., Leong, S. C., et al. Characterisation of regulatory T cells in nasal associated lymphoid tissue in children: relationships with pneumococcal colonization. PLoS Pathog. 7, (2011).
  19. Briles, D. E., Novak, L., et al. Nasal colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73, 6945-6951 (2005).
  20. Weinberger, D. M., Trzcinski, K., et al. Pneumococcal capsular polysaccharide structure predicts serotype prevalence. PLoS Pathog. 5, (2009).
  21. Bryant, W. P., J,, et al. Which Pneumococcal Serogroups Cause the Most Invasive Disease: Implications for Conjugate Vaccine Formulation and Use, Part I. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
  22. Hausdorff, W. P., Feikin, D. R., et al. Epidemiological differences among pneumococcal serotypes. Lancet Infect. Dis. 5, 83-93 (2005).
  23. Brueggemann, A., Griffiths, D., et al. Clonal Relationships between Invasive and Carriage Streptococcus pneumoniae and Serotype and Clone Specific Differences in Invasive Disease Potential. J. Infect. Dis. 187, 1424-1432 (2003).
  24. Mohler, J., Azoulay-Dupis, E., et al. Streptococcus pneumoniae strain-dependent lung inflammatory responses in a murine model of pneumococcal pneumonia. Intensive Care Med. 29, 808-816 (2003).
  25. Wu, H. Y., Virolainen, A., Mathews, B., King, J., Russell, M. W., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  26. Zhang, Z., Clarke, T. B., et al. Cellular effectors mediating Th17-dependent clearance of pneumococcal colonization in mice. J. Clin. Invest. 119, 1899-1909 (2009).
  27. Parker, D., Martin, F. J., et al. Streptococcus pneumoniae DNA initiates type I interferon signaling in the respiratory tract. MBio. 2, (2011).
  28. Haya, D. L., Camilli, A. Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors. Mol. Microbiol. 45, 1389-1406 (2002).
  29. Nakamura, S., Favis, K. M., et al. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. J. Clin. Invest. 121, 3657-3665 (2011).
  30. Kim, J. O., Weiser, J. N. Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 177, 368-377 (1998).
  31. Roche, A. M., King, S. J., et al. Live attenuated Streptococcus pneumoniae strains induce serotype-independent mucosal and systemic protection in mice. Infect. Immun. 75, 2469-2475 (2007).
  32. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  33. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  34. Richards, L., Ferreira, D. M., Miyaji, E. N., Andrew, P. W., Kadioglu, A. The immunising effect of pneumococcal nasopharyngeal colonisation; protection against future colonisation and fatal invasive disease. Immunobiology. , 215-251 (2010).
  35. Lanie, J. A., Ng, W. L., et al. Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
  36. Robertson, G. T., Ng, W. L., Foley, J., Gilmour, R., Winkler, M. E. Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and. 184, 3508-3520 (2002).
  37. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
  38. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Organ-specific models of Streptococcus pneumoniae disease. Scand. J. Infect. D. 35, 647-652 (2003).
  39. Swirski, F. K., Nahrendorf, M., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).

Tags

Immunologie Streptococcus pneumoniae Neusspoeling nasopharynx murine flowcytometrie RNA Kwantitatieve PCR gerekruteerde macrofagen neutrofielen T-cellen effectorcellen intranasale kolonisatie
Karakterisering van inflammatoire reacties tijdens intranasale kolonisatie met <em>Streptococcus pneumoniae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, … More

Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, T., Bowdish, D. M. E. Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae. J. Vis. Exp. (83), e50490, doi:10.3791/50490 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter