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Immunology and Infection

Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/50490
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecule Medicine, McMaster University

Summary

Die Kolonisation des murinen Nasopharynx mit Streptococcus pneumoniae und die anschließende Extraktion von anhaftenden oder rekrutierten Zellen wird beschrieben. Diese Technik beinhaltet das Spülen des Nasopharynx und die Sammlung der Flüssigkeit durch die Nares und ist anpassungsfähig für verschiedene Auslesungen, einschließlich Differentialzellquantifizierung und Analyse der mRNA-Expression in situ.

Abstract

Nasopharyngeale Kolonisation durch Streptococcus pneumoniae ist eine Voraussetzung für die Invasion in die Lunge oder Blutkreislauf1. Dieser Organismus ist in der Lage, die Schleimhautoberfläche des Nasopharynx zu besiedeln, wo er sich aufhalten, sich vermehren und schließlich wirtsabwehren überwinden kann, um in andere Gewebe des Wirts einzudringen. Die Einrichtung einer Infektion in den normalerweise unteren Atemwegen führt zu einer Lungenentzündung. Alternativ können sich die Bakterien in den Blutkreislauf verbreiten und Bakteriämie verursachen, die mit hohen Sterblichkeitsraten verbunden ist2, oder direkt zur Entwicklung von Pneumokokken-Meningitis führen. Das Verständnis der Kinetik und immunioniert auf die nasopharyngeale Kolonisation ist ein wichtiger Aspekt der S. pneumoniae-Infektionsmodelle.

Unser Mausmodell der intranasalen Kolonisation ist an die menschlichen Modelle3 angepasst und wurde von mehreren Forschungsgruppen bei der Untersuchung von Wirtspathogen-Antworten im Nasopharynx4-7verwendet. Im ersten Teil des Modells verwenden wir ein klinisches Isolat von S. pneumoniae, um eine selbstbegrenzende bakterielle Kolonisation zu etablieren, die den Beförderungsereignissen bei menschlichen Erwachsenen ähnelt. Das hier beschriebene Verfahren beinhaltet die Vorbereitung eines bakteriellen Inokulums, gefolgt von der Etablierung eines Kolonisationsereignisses durch Lieferung des Inokulums über einen intranasalen Verabreichungsweg. Residente Makrophagen sind der vorherrschende Zelltyp im Nasopharynx während des stationären Zustands. Typischerweise gibt es nur wenige Lymphozyten in nicht infizierten Mäusen8, aber Schleimhautbesieonisation führt zu niedrigen bis hohen Grad Entzündungen (abhängig von der Virulenz der bakteriellen Arten und Stamm), die zu einer Immunantwort und der anschließenden Rekrutierung von Wirtsimmunzellen führen. Diese Zellen können durch eine Lavage des Trachealinhalts durch die Nares isoliert werden und korrelieren mit der Dichte von Besiedlungsbakterien, um die Kinetik der Infektion besser zu verstehen.

Protocol

Bevor Sie beginnen: Alle Schritte werden in einem Biohazard Level 2 (BSL2) Biological Safety Cabinet (BSC) durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Bitte stellen Sie sicher, dass Sie vor Beginn der Experimente die entsprechende Biohazard-Zulassung für die Verwendung infektiöser bakterieller Krankheitserreger gemäß den institutionellen Richtlinien erhalten haben. Bitte stellen Sie außerdem sicher, dass Sie alle Materialien und Reagenzien haben, die für die Durchführung des Verfahrens im Voraus erforderlich sind. Mäuse, die in diesen Experimenten verwendet wurden, haben weibliche C57BL/6-Mäuse aus Jackson Laboratories, Charles River oder Taconic aufgenommen und waren 10-14 Wochen alt (obwohl wir keine geschlechtsabhängigen signifikanten Unterschiede in der Kinetik der nasalen Kolonisation Clearance oder Infektion gefunden haben). Alle in diesen Experimenten verwendeten Mäuse wurden unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen gezüchtet und gepflegt und waren frei von häufigen Viren (LCMV, MNV,MPV, Reovirus ECTV und andere) Bakterien(z. B. H. pylori)und Parasiten(z. B. Pinworm, Ektoparasiten) durch Fäkalienprobentests sowie häufige anatomische Beurteilung von Sentinelmäusen, die in ihren Einrichtungen untergebracht sind. Bei der Durchführung dieser Experimente empfehlen wir die Verwendung von Kontrollmäusen, die nicht jünger als 10-12 Wochen und nicht älter als 6 Monate sind. Mäuse, die jünger oder älter als diese Altersgruppe sind anfälliger für längere nasopharyngeale Beförderungsdauer und erhöhte Wahrscheinlichkeit der Verbreitung von Infektionen. Maushintergrund ist eine weitere wichtige Überlegung, die die Ergebnisse eines Kolonisationsexperiments beeinflussen kann, da mehrere Gruppen gezeigt haben, dass Mäuse unterschiedlicher genetischer Herkunft unterschiedliche Anfälligkeiten für den S. pneumoniae D39 (Serotyp 2) Stamm9,10haben. S. pneumoniae ist kein natürlich vorkommender muriner Erreger und sein einziges natürliches Reservoir ist der menschliche Nasopharynx. Die Übertragung erfolgt über Atemtröpfchen, und da Mäuse keine Atemsekrete produzieren, können einzelne Mäuse das Bakterium nicht auf andere Mäuse übertragen, so dass es keine Bedenken für die Maus-zu-Maus-Übertragunggibt 11. Eine visuelle Übersicht über die in diesem Manuskript beschriebenen Verfahren finden Sie in Abbildung 1.

1. Vorbereitung der S. pneumoniae Kultur

  1. Impfen Sie 5 ml tryptische soja Agar für die Suspension Wachstum von Streptococcus pneumoniae.
  2. Kultur unter statischen Bedingungen bei 37 °C bei 5%CO2, bis das bakterielle Inokulum das Wachstum der Logphase mit einer entsprechenden Flüssigkeitsdichte von 108 KBE/ml erreicht, wie durch einen auf 600 nm eingestellten Kilometerzähler bestimmt. Der genaue Messwert entsprechend dieser KBE unterscheidet sich je nach dem spezifischen ausgewählten Bakterienstamm; für die meisten Stämme von S. pneumoniae entspricht dies einem OD600 Bereich von 0,45-0,55. Typischerweise wachsen S. pneumoniae Stämme in flüssiger Kultur innerhalb von 1,5-2,5 Stunden unter den empfohlenen Bedingungen auf diese Dichte an, ohne dass eine Subkultivierung erforderlich ist. Die Kultur sollte nicht überwachsen (jenseits eines OD-Wertes von 0,75), da dies den Punkt darstellt, an dem die Bakterien nicht mehr im Logphasenwachstum sind und einer umfassenden Autolyse unterzogen werden.
  3. Jede Maus wird mit etwa 107 Bakterien geimpft. Daher für jede 9 zu kolonisierte Maus pipette 1 ml Inokulum in ein Eppendorf-Rohr und drehen sie bei 15.000 x g für 1 min. Ein weißliches Pellet sollte sichtbar sein. Entfernen Sie den Überstand, achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören und die Bakterien in 100 l Phosphat gepufferter Saline (PBS) wieder auszusetzen, wodurch die Konzentration auf 109 KBE/ml erhöht wird. In diesem Stadium sollten die Bakterien lebensfähig bleiben, aber nicht ohne weiteres replizieren.
  4. Wenn Sie mehrere Aliquots verwenden, kombinieren Sie in einem Rohr, um leichte Variationen der Bakteriendichte zwischen Proben zu kontrollieren.
  5. Halten Sie Bakterien auf Eis, bis sie zur Impfung bereit sind, für maximal 1 Stunde.
  6. Um eine genaue Bakterienzahl zu erhalten, führen Sie log-weise serielle Verdünnungsserien durch, die mit ordentlichem bakteriellem Inokulum beginnen. Seriell 10-fach verdünnen und 10 l bis 90 l steriles PBS hinzufügen.
  7. Ausbanden Sie 3 Tropfen mit 10 l Proben von Verdünnungen 10-5 - 10-9,plus eine PBS-kontaminationskontrolle, auf separat beschriftete Abschnitte der tryptischen Soja-Agar -Platte (TSA), ergänzt durch 5% Schafsblut (Abbildung 2). Stellen Sie sicher, dass Pipettenspitzen für jeden Schritt geändert werden, der von einer höheren KBE-Konzentration auf eine niedrigere KBE-Konzentration verdünnt wird, um zu vermeiden, dass überschüssige Bakterien übertragen werden und die Variabilität der Ergebnisse erhöht wird. Menschliche Blutagar (HBA) Platten können auch anstelle von TSA verwendet werden. Da viele Stämme von S. pneumoniae resistent gegen Neomycin sind (von 5-20 g/ml), kann dieses Antibiotikum auch während der Plattenvorbereitungsphase dem Agarmedium der Wahl zugesetzt werden. Dies erleichtert die Aufzählung, da es nicht resistente Bakterien eliminiert. Die Antibiotika-Empfindlichkeit jedes Stammes muss im Voraus getestet werden, um die optimale Konzentration von Antibiotika für jeden Bakterienstamm zu bestimmen.
  8. 15-30 min unbedeckt trocknen lassen, dann Platten abdecken und kopfüber in bakteriellen Inkubator auf 37 °C und 5%CO2legen. Wachsen Sie Bakterienkolonien auf dem Teller für 24 Stunden.
  9. Bestimmen Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten und ihre entsprechende Konzentration. Basierend auf Denseraten des OD600-Wertes sollte die Konzentration im Bereich von 1-4 x 109 KBE/ml liegen. S. pneumoniae Kolonien sollten als kleine, kreisförmige Kolonien in gelblich-beige Farbe erscheinen, wobei eine kleine Depression in der Mitte ihnen ein donutartiges Aussehen verleiht (Abbildung 3).

2. Murine intranasale Kolonisation

  1. Bremsen Sie Mäuse, indem Sie sie in ein Maus-Restrainer-Gerät legen (ein modifiziertes 50 ml Falcon-Rohr mit abgeschnittener Spitze, um eine Öffnung zu erzeugen), um sie durch die Basis ihres Körpers mit Daumen zu sichern, so dass ihre Nasen einfach aus dem verjüngten Ende des Retrainerapparates auftauchen (Abbildung 4). Die Verwendung dieses Geräts ermöglicht die Immobilisierung des Mauskopfes und die Segregation seiner Nares in einer Weise, die die Bewegung minimiert und Versuche des Tieres behindert, die Pipettenspitze zu masticate, so dass eine vollständige Lieferung des Inoculums ermöglicht. Alternativ können Mäuse durch Abschürfungen am Hals und manuelle Zurückhaltung immobilisiert werden. Wir empfehlen keine Anästhesie der Tiere vor der intranasalen Impfung. Die Verwaltung des Inokulums an Tiere unter Anästhesie führt dazu, dass sich einige der Inokulume auf die Lunge ausbreiten12,13.
  2. Mit einer P10- oder P20-Pipette, impfen Sie jede Maus, indem Sie 10 l der vorbereiteten Kultur ablagern, sie gleichmäßig zwischen beiden Nares verteilen (lassen Sie Inokulum in die Nase tropfen, indem Sie die Impfung allmählich pulsieren, und nehmen Sie sich Zeit, damit Mäuse Inoculum einatmen). Um die vollständige Lieferung des Inokulums zu erreichen, pausieren Sie die Verwaltung an jedem Punkt, an dem die Maus beginnt, ihre Nase übermäßig zu bewegen. Das gesamte Inokulum darf nicht in die Nares injiziert werden, da die Mäuse während des Ausatmens einige durch die Nase vertreiben können; Da die vertriebene Menge jedoch in der Regel winzig ist und das Inokulum eine extrem hohe Menge an Bakterien enthält, wirkt sich dies nicht signifikant auf die besiedelnde bakterielle Belastung aus. Darüber hinaus ist die für die Besiedlung in der Nasopharyngealschleimhaut verfügbare Oberfläche begrenzt und folglich haben wir und andere festgestellt, dass die empfohlene Dosis von 107 ausreicht, um bei allen Mäusen konsistente Bakterienwerte zu erhalten, was zu einer minimalen Variabilität in den Anfangsmengen von besiedelnden Bakterien14,15 führt.
  3. Wiegen Sie Mäuse, wenn Sie Gewichtsindikatoren als Teil Ihrer Endpunktüberwachung verwenden. Überwachen Sie Mäuse alle 12-24 Stunden auf klinische Symptome, einschließlich Lethargie, Rüschenfell und Gewichtsverlust. Mäuse zeigen in der Regel erst 3-5 Tage nach der Kolonisation Krankheitssymptome, und diesen wird Gewichtsverlust vorausgehen, der durchschnittlich etwa 5% des gesamten Körpergewichts pro Tag betragen kann. Wenn die Mäuse zunehmend krank werden, nehmen sie geknickte Haltungen an und zeigen eine verminderte Aktivität und eine verminderte Reaktionsfähigkeit auf Stimulation, einschließlich der Handhabung. In diesem Stadium ist Krankheit in der Regel ein Hinweis auf Sepsis und/oder Lungenentzündung und wird wahrscheinlich tödlich sein, obwohl Mäuse mit 1 ml subkutaner Saline täglich behandelt werden können, um die Ergebnisse zu verbessern. Überlebende Mäuse sollten nach Tag 7 nach der Kolonisierung eine Verbesserung zeigen, wie durch Gewichtsstabilisierung gefolgt von Gewichtszunahme belegt wird, obwohl verschiedene Stämme von S. pneumoniae Krankheiten schneller induzieren und zu einem Fortschreiten der klinischen Symptome entlang einer anderen Zeitlinie führen können. Abbildung 5 für ein repräsentatives Ergebnis des Gewichts, das bei Mäusen verfolgt wird, die mit dem P1547-Stamm kolonisiert sind.

3. Nasal Lavage Probensammlung

Vor Beginn: Konserven mit 1 ml Spritzen zubereiten, die mit 26 3/8 G abgeschrägten Nadeln gekrönt sind. Schneiden Sie 2,5 cm Stück PE20 Polyethylenrohre mit einem Innendurchmesser von 0,38 mm, so dass jedes Ende eine abgeschrägte Spitze hat. Schieben Sie mit Zangen ein 2,5 cm langes Stück PE20-Polyethylenschlauch (Innendurchmesser 0,38 mm) auf die Nadelspitze, um zu vermeiden, dass die Schlauchseite unterbrochen wird. Kanülierte Nadeln können bis zum Bedarf in 70% Ethanol aufbewahrt werden.

  1. Euthanisieren Sie versuchsexperimentelle Mäuse. Da zervikale Dislokation entha möglicherweise die Luftröhre schädigen kann, muss diese Methode der Euthanasie vermieden werden. Unsere bevorzugte Methode ist isoflurane Anästhesie gefolgt von Exsanguination, jedoch stellen Sie sicher, dass Sie institutionelle Richtlinien bei der Auswahl der Art der Euthanasie zu folgen.
  2. Mit 70% wässrigem Ethanol sterilisieren Sie das superoanterioröse Fell des Tieres, insbesondere den Hals, und achten Sie darauf, dass Ethanol nicht auf die Nares zugreift.
  3. Machen Sie einen einzigen Längsschnitt entlang der Mittellinie des Halses des Tieres, und zwei horizontale Schnitte an beiden Enden, wodurch eine Öffnung, um die Luftröhre vorzustellen.
  4. Schälen Sie die Haut vorsichtig auf beiden Seiten zurück und enthüllen Sie das Darunter des Halsgewebes.
  5. Trachea sollte sichtbar sein, umgeben von Längsmuskeln auf beiden Seiten. Schnippchen Sie diese sorgfältig, um einen klaren Blick auf die Luftröhre selbst zu bieten, wobei darauf zu achten ist, dass die umgebende Vaskulatur nicht abtrennung.
  6. Wenn die Gefäße geschnitten wurde und Blut vorhanden ist, vor dem Fortfahren, lassen Sie Blutungen aufhalten, und reinigen Sie dann den Bereich mehrmals durch die Abgabe sterilen PBS und mit steriler Gaze, um sanft überschüssige Feuchtigkeit in der Gegend aufzusaugen.
  7. Sobald die Luftröhre richtig belichtet ist, machen Sie einen quer, semilunaren Schnitt in der Luftröhre etwa auf halbem Weg nach oben (Abbildung 6).
  8. Ziehen Sie 1.000 l sterilisierte SPBS in zuvor vorbereitete Kanülennadeln.
  9. Legen Sie Kanüle in die Luftröhre in Richtung der Nase, halten Sie die abgeschrägte Kante nach unten zeigen für eine einfache Einfügung (Abbildung 7). Sobald die Nadel an Ort und Stelle ist, drehen Sie es um 180°, und sonden Sie vorsichtig nach oben, bis Sie Lichtwiderstand spüren.
  10. Platzieren Sie Eppendorf für die Probensammlung direkt unter der Nase der Maus.
  11. Testen Sie die korrekte Platzierung der Nadel, indem Sie eine minimale Menge an PBS-Lavageflüssigkeit (ca. 20 ,l) abgeben - Flüssigkeitstropfen sollte sich um die Nares der Maus bilden; wenn dies der Fall ist, fahren Sie mit Schritt 3.13 fort).
  12. Wenn Test PBS tritt direkt aus dem Mund des Tieres, ziehen Sie die Kanüle zurück, und neu positionieren, indem Sie wieder sanft nach vorne, bis sehr leichte Widerstand gefühlt wird - achten Sie darauf, Kanüle nicht zu weit über diesen Widerstand zu schieben, wie Sie es am Nasengaumen vorbei und durch die Mundhöhle bewegen.
  13. Inhalt der Nadel schnell zu verdrängen und maximale Menge an Zellen zu sammeln - Inhalt sollte durch die Nares der Maus und in Sammelrohr fließen. Probe sofort auf Eis legen.
  14. Um Proben für die RNA-Analyse zu sammeln, wiederholen Sie die Schritte 3.8-3.13) mit einer kanülierten Nadel, die 500 l RNA-Lysepuffer auf derselben Maus enthält. Dies ermöglicht die Entnahme von Lysatproben aus den verbleibenden Zellpopulationen, die größtenteils aus dem nasopharyngealen Schleimhautepithel bestehen, da nicht haftende Zellen nach der ersten PBS-Lava hätten entfernt werden müssen. Bitte beachten Sie, dass der RNA-Lysepuffer das Epithel denudet und umgebendes Gewebe zerstört, daher ist darauf zu achten, dass der Kontakt mit Organen wie der Lunge vermieden wird, wenn eine Retention dieser Gewebe gewünscht wird. Nach der Entnahme die Probe in den RNA-Lysepuffer direkt auf Trockeneis legen, um zu frieren. Einmal im Lysepuffer können Proben gemäß den Anweisungen des Herstellers gelagert werden und sind in der Regel mehrere Monate bei -70 °C stabil.

4. Bestimmung der bakteriellen Belastung im Nasopharynx

  1. Quantitieren Sie Bakterien, indem Sie eine serielle Verdünnungsserie für jede murine Nasenspülprobe vorbereiten. Im Allgemeinen ist mit einer bakteriellen Belastung zwischen 0-104 KBE zu rechnen, daher führen Sie drei 10-fache serielle Verdünnungen durch. 10 l der ordentlichen Nasenspülprobe (100 KBE/ml) in die erste Röhre mit einer Konzentration von 10-1 CFU/ml geben.
  2. Dividieren Sie die bakteriologische Platte in Quadranten und beschriften Quadranten jeweils mit einem Mitglied der Verdünnungsreihe (100-10-3 CFU/ml). Verkleben Sie 3 Tropfen von 10 l Proben der 3 Verdünnungen und die saubere Probe auf Tryptic Soja-Agar-Platten, ergänzt mit 5% Schafsblut, wie in Abbildung 2.
  3. 15-30 min unbedeckt trocknen lassen, dann Platten abdecken und kopfüber in bakteriellen Inkubator mit optimalen Bedingungen für das Bakterienwachstum (typischerweise 37 °C und 5% CO2)platzieren.
  4. Wachsen Sie Bakterienkolonien auf dem Teller für 18-24 Stunden.
  5. Bestimmen Sie die Anzahl der besiedelnden Bakterien, indem Sie die auf der Platte gebildeten Kolonien für jede Verdünnung durchschnittlich bestimmen (Abbildung 3). Abbildung 8 zeigt die bakterielle Dichte während verschiedener Zeitpunkte, wie durch die Kultur der Nasenspülungen bestimmt, bei Mäusen, die mit 3 verschiedenen Stämmen von S. pneumoniae für bis zu 21 Tage kolonisiert sind.

5. Vorbereitung von Proben für Durchflusszytometer

Vor Beginn: Bereiten Sie eine Mischung von Antikörpern vor. Für die Quantifizierung von Leukozytenpopulationen empfehlen wir folgende Mischung an den angegebenen Verdünnungen: PE-Ly6G (Klon 1A8, 1 g/ml), FITC-Ly6C (Klon AL-21,1 g/ml), eFluor 450-CD45 (Klon 30-F11, 2,67 g/ml), APC-F4/80 (Klon PM8 RUO, 0,67 g/ml), PerCP-Cy5.5-CD11c (Klon N418 RUO, 0,5 g/ml), PE-Cy7-CD11b (Klon M1/70, 0,33 g/ml), Alexa Fluor 700-CD3 (Klon 1782, 4 g/ml), eFluor 605NC-CD4 (Klon GK1,5, 6,67 g/ml). Bitte beachten Sie, dass es sich bei dieser Mischung um eine 2-fache Konzentration handelt (siehe Schritt 5.5). Alle Antikörper sollten im FACs Wash Puffer (0,5% fetales Kalbsserum, 2mM EDTA, 0,1% Natriumazid in PBS) verdünnt werden, die ebenfalls vorher zubereitet werden sollten. In einer Mischung aus isotypübereinstimmenden Kontrollantikörpern, idealerweise vom gleichen Lieferanten wie die markierten Antikörper und in den gleichen Konzentrationen wie die spezifischen Antikörper, sollte hergestellt werden. Die mit den Isotypkontrollantikörpern behandelten Proben funktionieren als Negativkontrolle. Jede Fluoreszenz, die in den proben beobachtet wurde, die mit den Isotypkontrollantikörpern behandelt wurden, sollte als Hintergrund betrachtet werden.

  1. Eine Zentrifuge vorgeben, die 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen auf 4 °C drehen kann.
  2. Zentrifugen-Nasenspülproben bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C. Sorgfältig Pipette aus Überstand und Reserve. Hinweis: Aufgrund der geringen Menge an Zellen innerhalb des Nasopharynx ist das Zellpellet nur sichtbar, wenn es eine unerwünschte Kontamination der roten Blutkörperchen gibt, die rot rot wird. Wenn dies beobachtet wird, sollte die Probe verworfen werden.
  3. Probe in 50 l fc resuspendieren? RIIb/CD16-2 (2.4G2) Antikörper (der Fc-Rezeptoren bindet und unspezifische Antikörperbindung reduziert) im FACs Wash Buffer in einer Konzentration von 4 g/ml.
  4. Inkubationsprobe auf Eis für 30 min.
  5. Fügen Sie der Probe 50 l vorvorbereiteten 2x konzentrierten fluoreszierenden Antikörpermix hinzu. Legen Sie eine repräsentative Probe aus jeder Versuchsgruppe beiseite, um als Isotypkontrolle zu fungieren. Fügen Sie diese Probe anstelle der Fleckenmischung den Isotyp-Antikörpermix hinzu.
  6. Inkubationsprobe auf Eis für 1 Stunde.
  7. Zentrifugenproben bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C. Überstand entsorgen und in 200 l PBS resuspendieren.
  8. Wiederholen Sie Schritt 5.7.
  9. Nach der zweiten Wäsche proben zentrifugen proben wieder bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C.
  10. Resuspend in entweder in PBS (wenn probe sofort läuft) oder 2% Paraformaldehyd (wenn Proben 1-3 Tage nach der Färbung laufen).
  11. Bei der Durchführung der Durchflusszytometrie sammeln Sie die maximale Anzahl von Ereignissen pro Probe oder bis die gesamte Probe angesaugt wurde. Bei nicht infizierten, gesunden, jungen Mäusen werden dies nur 1.000-2.000 Gesamtereignisse sein; Während eines bakteriellen Besiedlungsereignisses kann diese Zahl um mehr als das 2-zu-5-fache steigen, abhängig vom Krankheitsstatus bei Tieren und Faktoren wie Alter und genetischem Hintergrund. Abbildung 9 zeigt repräsentative Durchflusszytometrieergebnisse, die aus einem 3-Laser-Becton-Dickenson-LSRII-Durchflusszytometer mit einem Vorwärtsstreu von 450 und einer Seitenstreuung von 300 gesammelt wurden, obwohl wir empfehlen, die Parameter für das spezifische Durchflusszytometer zu optimieren, das Sie vor der Probenentnahme verwenden möchten. Hinweis: Wenn eine Probe gleichmäßige Spuren von Blutkontamination enthält, werden die insgesamt erfassten Ereignisse deutlich höher sein als erwartet, und die Probe sollte von der Analyse ausgeschlossen werden.

6. Quantitative PCR (qPCR) Analyse von Nasenlavages

  1. Tauzelle lysiert ab Schritt 3.14 Raumtemperatur.
  2. Befolgen Sie das empfohlene Protokoll, das mit der bevorzugten RNA-Extraktion Ihrer Wahl versehen ist.
  3. Nach Abschluss des RNA-Extraktionsverfahrens wie angewiesen, quantifizieren Sie die Menge der RNA mit einem Spektralphotometer oder einer elektrophoresebasierten Methode (Abbildung 10). Wir erhalten routinemäßig zwischen 975 und 3.250 ng Gesamt-RNA pro Probe mit einem Verhältnis von 260/280 nm von >1,7 oder einer RNA-Integritätsnummer (RIN) um 8,1±0,13.
  4. Transkribieren CDNA mit der M-MULV Reverse Transcriptase nach dem Herstellerprotokoll mit 1.000 ng RNA (maximal 13 l).
  5. Verdünnen Sie die resultierenden cDNA-Proben 8x und aliquot gleichmäßig in 4 separate Rohre für die Langzeitlagerung bei -20 oder -80 °C.
  6. Um die Genexpression nach qPCR zu messen, Bereiten Sie 25 l Probenreaktionen in Dreifacharbeit auf Eis oder Kalteblock vor, die: 12,5 l 2x qPCR-Master-Mix aus qPCR-Kit Ihrer Wahl, 0,25 l Referenzfarbstoff, 2 l verdünnter cDNA (Schritt 7,5), 1 l gemischte Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung (400 nM Endwasser), 9,25 l RNAse-DNAse-freies Wasser enthalten. Dieses Protokoll ist eine Anpassung der zuvor veröffentlichten Methoden16.
  7. Im Allgemeinen stellen wir fest, dass eine zweistufige qPCR-Verstärkung ( 95 °C für 10 min gefolgt von bis zu 40 Zyklen x [95 °C x 15 sec, 60 °C x 1 min]) wirksam ist (Abbildung 11a); Allerdings muss jedes Primerpaar optimiert werden. Dissoziationskurven (Schmelzen) müssen nach der Verstärkung durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass keine unspezifische Verstärkung aufgetreten ist. Verstärkung (Abbildung 11b)
  8. Wir führen routinemäßig Standardkurven für jedes analysierte Gen sowie einen Standardkalibrator (abgeleitet aus Lungen- oder Milzhomogenat) für jede analysierte 96-Well-Platte durch. Relative Transkriptsmengen werden durch die erste Normalisierung der Rohzyklusschwellenwerte (Ct) durch den Referenzfarbstoff und die Transformation der resultierenden Werte durch die jeweilige Standardkurve ermittelt. Diese relativen Mengen werden anschließend auf den Standardkalibrator und ein Haushaltsgen normalisiert.

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Representative Results

Abbildung 1 stellt eine Übersichtschaltplan mit den wichtigsten Schritten des Protokolls dar. Die Abbildungen 2-3 enthalten eine Visualisierung der mikrobiologischen Methodik, die den hier beschriebenen Protokollen innewohnt. Abbildung 4 stellt die richtige Positionierung einer Maus dar, um eine intranasale Kolonisation durchzuführen, während Abbildung 5 typischerweise Gewichtsänderungen von Mäusen zeigt, die mit dem S. pneumoniae-Stamm P1547 kolonisiert sind. Die Abbildungen 6-7 stellen spezifische Stadien des Nasal-Lavage-Teils des Prozesses dar, um diese beiden Techniken zu unterstützen. Die Abbildungen 8-11 bestehen aus repräsentativen Ergebnissen von Analysen, die an Proben durchgeführt wurden, die aus dem Nasopharynx einer Maus nach Nasenspülung entnommen wurden. Insbesondere ist Abbildung 8 ein repräsentatives Ergebnis der bakteriellen Belastung im Nasopharynx, wie durch die Kultivierung von Nasenspülungen bestimmt, die von Mäusen gewonnen wurden, die entweder mit dem S. pneumoniae-Stamm P1121, P1547 oder P1542 kolonisiert wurden. Abbildung 9 stellt die Zellphänotypisierung isolierter nasopharyngealer Immunzellen mit zytometrischen Flusstechniken dar. Abbildungen 10-11 zeigen repräsentative Ergebnisse zur expressionalen Analyse der nasopharyngealen mRNA über quantitative PCR.

Figure 1
Abbildung 1. Flussdiagramm der intranasalen Inokulationundung und der Isolierung von Nasenspülzellen mithilfe eines Mausmodells. Zuerst werden die Bakterien für die Impfung vorbereitet, und dann an murine Probanden intranasal gegeben. Nach Ablauf der gewünschten Zeit werden Mäuse über terminale Blutungen eingeschläfert und ihre Nasopharyngealzellen über zwei Nasenspülschritte isoliert: ein PBS-Waschschritt gefolgt von einer Sekundärwäsche im RNA-Lysepuffer. Die Zellen aus der vorläufigen PBS-Waschanlage werden isoliert und mit Flow-Zytometrie-Techniken analysiert, während RNA, die aus der zweiten Probe isoliert wurde, verwendet werden kann, um die relativen Häufigkeiten von Molekülen zu untersuchen, die auf Transkriptionsebene von Interesse sind.

Figure 2
Abbildung 2. Zur Bestimmung der bakteriellen Konzentration werden 10 l Tropfen in Dreifache auf einer Platte plattiert,die in Abschnitte unterteilt ist, die eine andere serielle Verdünnung darstellen. Diese Tropfen dürfen dann trocknen und die Platten werden über Nacht bei 37 °C, 5%CO2inkubiert.

Figure 3
Abbildung 3. Konzentration von Streptoccous pneumoniae isoliert aus dem Nasopharynx eines repräsentativen Tieres. Jede diskrete Kolonie stellt eine Kolonie bildende Einheit dar, jede Sammlung von Kolonien stellt einen 10-l-Tropfen (in Triplicaten plattiert) und jeder Quadrant auf der Platte stellt eine separate serielle Verdünnung dar. Die bakterielle Konzentration wird in DerKBE/ml bestimmt, indem die Anzahl der zählbaren, vollständig gebildeten Kolonien innerhalb und dann zwischen qualifizierten Quadranten durchschnittlich ermittelt wird.

Figure 4
Abbildung 4. Die Bewegung jeder zu impfenden Maus muss minimiert werden, insbesondere am Hals, um eine ordnungsgemäße Abgabe von bakteriellem Inokulum zu ermöglichen. Um dies zu erreichen, wird die Subjektmaus in einem modifizierten Restriktionsapparat, bestehend aus einem 50 ml Falcon-Rohr mit einer Blende an seinem verjüngten Ende, zurückgehalten. Die Maus wird dann so positioniert, dass ihre Nase aus der Blende hervortritt, wo sie vom Forscher betreten werden kann, so dass eine intranasale Impfung durchgeführt werden kann.

Figure 5
Abbildung 5. Gewicht der Mäuse, die mit dem Stamm P1547 besiedelt sind, aus mindestens 2 repräsentativen Experimenten, die täglich nach der anfänglichen Impfung (n=6) verfolgt werden, um typische Gewichtsänderungen darzustellen, die nach der nasopharyngealen Besiedlung erwartet werden. Das Gewicht wird als prozentuale Änderung des Anfangsgewichts angezeigt. Bitte beachten Sie die erwartete scharfe anfängliche Gewichtsverlust zwischen den Tagen 3-5 gesehen, gefolgt von Stabilisierung und allmähliche Gewichtszunahme bei überlebenden Mäusen.

Figure 6
Abbildung 6. Bei Luftröhrenexposition werden flankierende Längsmuskeln vor dem Trachealschnitt sorgfältig entfernt, so dass die umgebenden Blutgefäße nicht stark werden. Ein kleiner, semilunarer Schnitt wird dann auf halbem Weg mit einer feinen chirurgischen Schere in der Luftröhre gemacht. Es ist wichtig, den Durchmesser der Luftröhre nur teilweise zu durchschneiden, so dass sie nachträder intakt bleibt.

Figure 7
Abbildung 7. Einsetzen der kanülierten Nadel in die Luftröhrenöffnung nach oben zur Nase. Sobald Kanüle an Ort und Stelle ist, Sonden Sie sanft, bis Widerstand erreicht ist, dann spülen Inhalt durch die Nares.

Figure 8
Abbildung 8. Eine repräsentative Serie von bakteriellen Belastungen, die aus dem Nasopharynx mit dem nasalen Spülverfahren isoliert wurden, beschrieben nach der Besiedlung von C57BL/6-Mäusen (Dreiecke) mit dem S. pneumoniae-Stamm P1547 (A), P1542 (B) oder P1121 (C). Eine vergleichende Besiedlung von BALB/C-Mäusen (Kreisen) nach P1121-Kolonisation wird auch in (C )angezeigt. Im Laufe der Kolonisation werden verschiedene Zeitpunkte angezeigt, einschließlich der Tage 3, 7, 14 und 21. Im Allgemeinen wird an Tag 3 mit einer hohen Anfangsbelastung gerechnet, wobei sich an Tag 7 kaum verringert. Die Räumung wird in der Regel bis zum 14. Tag eingeleitet, wobei die vollständige oder fast vollständige Clearance nach der Kolonisation mit den meisten Stämmen bis zum 21. Tag nachgewiesen wird. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9. Repräsentatives Histogramm (A) und Punktdiagramm (B) der Gesamtzellen, die von murinen Nasenlavages isoliert sind, wie durch Durchflusszytometrie analysiert. Die differenzielle Expression von Markern auf Zellpopulationen ermöglicht die Identifizierung von Leukozyten-Teilmengen durch den Einsatz von fluoreszierenden Antikörpern, die gegen diese Proteine gerichtet sind. Wie hier gezeigt, werden Leukozytenpopulationen ausgewählt, indem zuerst singlet-Zellen mit einem Forward Scatter (Area) versus Forward Scatter (Width) Gate (A) gegatingn und dann für CD45+-Zellen innerhalb dieser Teilmenge (B) angereichert werden. Diese Population kann weiter in spezifische Zelltypen unterteilt werden, indem für CD11b und Ly6G doppelpositive Neutrophile (C) geziniert werden. Die Analyse der CD11b-Population kann durchgeführt werden, um F4/80+, CD11b-Makrophagen (D) oder CD11b-, CD3- und CD4-Doppelpositive CD4-T-Zellen (E) zu zeigen. Zellpopulationen können phänotypisiert werden, solange sie entweder eine oder eine Kombination mehrerer einzigartiger Oberflächenrezeptoren ausdrücken, die verwendet werden können, um sie von anderen Zelltypen zu unterscheiden. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

Figure 10
Abbildung 10. Repräsentatives Elektropherogramm nach der automatischen Sequenzierung einer Probe, die aus murinen Nasenspülen isoliert ist. Das resultierende Elektropherogramm zeigt die Quantifizierungsdaten und die charakteristische Signatur einer qualitativ hochwertigen Gesamt-RNA-Probe aus dem nasopharyngealen Bereich. Bei der Durchführung von Analysen der gesamten RNA werden die Bereiche unter den RNA-Spitzen für die beiden großen ribosomalen RNA, 18S und 28S, verwendet, um ihr entsprechendes Verhältnis zu berechnen. Signifikante Veränderungen in den Spitzenverhältnissen von 18S und 28S sind typischerweise ein Indiz für eine degradierte RNA. Der Grad des Abbaus kann durch die RNA-Integritätsnummer (RIN) zusammengefasst werden; die RIN für diese repräsentative Stichprobe ist 8.1. Ein Beispiel für stark degradierte RNA ist in (B) und (C) dargestellt, und die nachfolgende RIN ist 1,9 bzw. 4,6. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

Figure 11
Abbildung 11. Amplifikationsdiagramm (A) und Dissoziationskurve (B) aus qPCR-Analyse von Nasenwaschzellenlysaten, was ein Beispiel dafür ist, wie diese beiden Auslesungen in der Regel nach einer effizienten und korrekt nachgewiesenen Verstärkung von mRNA-Produkten aussehen sollten, die aus dem murinen Nasopharynx isoliert sind. Vertreten ist eine Standardkurve für das Housekeeping-Gen 18S. Die in (A) angezeigten Ergebnisse zeigen das gewünschte PCR-Produkt nach Verstärkung mit Primern gegen GAPDH. Die Linie stellt den Zyklusschwellenwert (Ct) dar. Der Punkt, an dem die Amplifikationsdiagramme, die verschiedenen Proben entsprechen, diesen Schwellenwert überschreiten, ermöglicht einen Vergleich zwischen den Proben, wobei niedrigere Werte höheren Mengen an RNA entsprechen. Die Parzelle in (B) zeigt, dass die maximale Schmelztemperatur des qPCR-Produkts 85 °C beträgt und dass in dieser Reaktion keine kontaminierenden Produkte vorhanden sind, die sich als zusätzliche Spitze, getrennt von der gewünschten Produktspitze, zeigen würden. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

Dehnungsname Serotyp Virulenz Sterblichkeit bei Mäusen Erwartete Kolonisationsdauer
P1121 23F Asymptomatisch 0% 21-28 Tage
P1542 4 Niedrig 0-20% 21-28 Tage
P1547 6A Mitte 20-50% 14-21 Tage
D39 2 Hoch 70-100% 14-21 Tage

Tabelle 1. Eine tabellarische Übersicht über 4 häufig verwendete s. pneumoniae klinische Isolatestämme, ihre entsprechende Serotypzahl, den damit verbundenen Grad an Virulenz, den erwarteten Anteil der Invasivität innerhalb einer kolonisierten Untergruppe von Mäusen und die typische Dauer einer nasopharyngealen Kolonisation.

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Discussion

In dieser Studie präsentierten wir detaillierte Methoden für die intranasale Besiedlung von Mäusen unter Verwendung eines klinischen Isolatestamms von Streptococcus pneumoniae und die anschließende Isolierung und Charakterisierung der Immunzellen, die als Reaktion auf die Bakterien an Nasopharynx rekrutiert wurden. Wir demonstrierten, wie ein bakterielles Inokulum in nährstoffreichen Medien kultiviert werden kann und verwendet werden, um ein Kolonisationsereignis bei Mäusen zu etablieren, das zunächst auf den Nasopharynx beschränkt ist. Wir zeigten dann, wie reagierende Immunzelltypen, die zu Nasopharynx rekrutiert werden, nach Trachealexposition, Schnitt und Nasenspülung durch den Einsatz einer kanülierten Nadel isoliert werden können. Nasenspülproben können in PBS gesammelt werden, um intakte, leicht anhaftende Zellen zu isolieren; Die RNA aus enger anhaftenden Zellen und der umgebenden epithelialen Schleimhautschicht kann durch Anwendung einer Sekundärwäsche, die aus RNA-Lysepuffern besteht, isoliert werden. Die ersteren dieser Proben können dann verwendet werden, um die spezifischen Zellen, die im Rahmen der Kolonisation über Strömungszytometrie-Techniken rekrutiert werden, zu phänotypisieren, während letztere auf die Q-PCR-Analyse angewendet werden können, um die Effektorfunktionen dieser rekrutierten Zellen zu bestimmen, indem die transkriptionelle Expression von Immunregulatoren von Interesse betrachtet wird. Nasenspülungsproben können zusätzlich verwendet werden, um die Kinetik der Clearance eines bakteriellen Kolonisationsereignisses zu bestimmen, bei dem verschiedene experimentelle Gruppen verglichen werden, um spezifische Forschungsfragen zu beantworten.

Die Anwendung dieser Methode der intranasalen Kolonisation ermöglicht die Etablierung eines Kolonisationsereignisses, das zunächst auf die Nasopharynx des Tieres beschränkt ist. Jede nachträgliche Verbreitung der Bakterien im Blut oder an den Organen tritt daher sekundär zu Verletzungen der Immunabwehr in der Nasopharyngealschleimhaut lokalisiert. Die schrittweise Progression, die durch dieses Modell erreicht wird, spiegelt den Prozess der Pneumokokken-Invasion beim Menschen genauer wider, so dass man die Dynamik zwischen den besiedelnden Bakterien und der Wirtsnasenschleimhaut untersuchen kann - und vielleicht Verschiebungen in der bakteriellen Pathogenität und/oder Wirtsimmunität besser verstehen kann, die die Entwicklung von Verbreitungskrankheiten ermöglichen. Dies steht im Gegensatz zu Modellen, die auf die Etablierung eines anfänglichen Kolonisationsereignisses verzichten und sich entscheiden, invasive Erkrankungen isoliert durch direkte Abgabe des bakteriellen Inokulums in die Lunge mittels Intratrachaelinstillation, des Blutes mittels Gefäßinjektion oder perperitoneum mittels Peritonealinjektion zu untersuchen.

Die Durchführung einer PBS-Nasenspülung nach einem Kolonisationsereignis ermöglicht die Isolierung von nicht oder leicht anhaftenden Zellen, die an den Nasopharynx rekrutiert werden, sowie aller mukosally-assoziierten Bakterien. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass diese Technik begrenzt ist, da sie keine Zellen oder Bakterien freisetzt, die zwischen oder unter dem Epithel gereist sind, noch wird es die Ernte von Zellen oder Bakterien ermöglichen, die sich auf das nasale-assoziierte Lymphgewebe (NALT) lokalisiert haben, ein Lymphorgan, das nach einer Pneumokokken-Kolonisation17,18als potenzielle Infektionsstelle gemeldet wurde. Wenn weitere Untersuchungen der NALT gewünscht werden, empfehlen wir Mikrodissektion und Entfernung dieses Gewebegroßhandels für die Studie nach PBS Nasenspülung; Da sich diese beiden Techniken nicht gegenseitig ausschließen, können sie an demselben Tier durchgeführt werden. Aufgrund der lytischen und destruktiven Natur des RNA-Ernteschritts (der sekundären Lavage mit RNA-Lysepuffer) sollte dieser Schritt jedoch weggelassen werden, wenn sie beabsichtigen, die NALT zu ernten. Obwohl die Nasenspülung ein weniger technisch anspruchsvolles Verfahren ist, für Gruppen, die eine umfassendere Bewertung der bakteriellen Belastung erhalten möchten, die nicht nur mukosallyassoziierte Bakterien umfasst, sondern auch solche, die in das Nasopharyngealgewebe eingedrungen sind, schlagen wir vor, das Nasopharyngealgewebe nach entfernung des oberen Schädelknochens von kolonisierten Mäusen und die Zerlegung des Gewebes innerhalb des Nasenkonchaes zu ernten, wievonanderen beschrieben.

Die Art einer ausgelösten Immunantwort hängt von der Interaktion zwischen Wirt und Krankheitserreger ab. Über 90 Serotypen von S. pneumoniae wurden bis heute charakterisiert, alle mit unterschiedlichen Konzentrationen von Pathogenität und Virulenzfaktor-Expression, was zu einer differentialen Prävalenz in der menschlichen Bevölkerung20-23. In ähnlicher Weise wurde bei Mäusen berichtet, dass das Ausmaß und die Kinetik, die mit der Immunantwort verbunden ist, die als Reaktion auf eine nasopharyngeale Kolonisation ausgelöst wird, vom Kolonisierungsstamm selbst abhängt24. Daher ist die Auswahl eines geeigneten Stammes, der für die Etablierung einer nasopharyngealen Kolonisation verwendet werden kann, keine triviale Angelegenheit, ebenso wenig wie die Auswahl des genetischen Hintergrunds der Maus. Abbildung 8 enthält Beispieldaten, die die Kinetik der Clearance einer nasopharyngealen Kolonisation von 3 verschiedenen S. pneumoniae-Stämmen nach der intranasalen Besiedlung weiblicher Mäuse auf einem C57BL/6-Hintergrund darstellen. Tabelle 1 gibt einen Überblick über den Grad der Virulenz und die Dauer der erwarteten Kolonisationszeit (wenn sie auf dem C57BL/6-Hintergrund verwendet wird) mit 4 S. pneumoniae klinische Isolatstämme, die in der Literatur beschrieben sind und bekanntermaßen in der Lage sind, eine nasopharyngeale Koloninisation zu etablieren25: die Avirulent P1121 (Serotyp 23F)26,27 die niederviruletes P1542 (Serotyp 4)28, die Mittelvirulenz P1547 (Serotyp 6A)29-31, und die gut charakterisiert, hochvirulent D39 (Serotyp 2)32-36. Wenn das experimentelle Ziel darin besteht, ein asymptomatisches nasatäres Nonzonisationsereignis ohne begleitende bakterielle Verbreitung an andere Gewebe streng zu untersuchen, empfehlen wir die Verwendung des aviulenten P1121-Stamms, der als potenter Kolonisator gekennzeichnet ist, da längere Kolonisationsereignisse (bis zu 28 Tage vor der beobachteten Clearance) ein Kennzeichen dieses Stammes sind. In der Regel werden Mäuse, die mit P1121 kolonisiert sind, kein Risiko für invasive Krankheiten haben und keine klinischen Indikatoren für Krankheiten anzeigen (mit Ausnahme der vorübergehenden Gewichtsabnahme). Der Rest der Stämme sollte in Abhängigkeit von gewünschtem Grad der Virulenz und damit verbundener Sterblichkeit eingesetzt werden, wobei Virulenz nicht den Grad der Infektion bedeutet, der sich innerhalb einer einzelnen Maus entwickelt, sondern der Anteil der Mäuse, die klinische Krankheitszeichen aufweisen. Es sollte auch angemerkt werden, dass in der Regel, Grad der Virulenz korreliert umgekehrt mit der Länge der Kolonisation Dauer, mit mehr virulenten Stämmekolonisieren für einen kürzeren Zeitraum. Alle 3 der beschriebenen virulenten Stämme führen zur Sterblichkeit bei Mäusen aufgrund einer Sepsis, mit fulminanter Lungenentzündung oder gleichzeitiger Lungenentzündung und Sepsis, die sich in einer Untergruppe von Mäusen entwickelt. Die Unterschiede in der Lokalisierung von invasiven Bakterien können dehnungsspezifisch sein, da bereits berichtet wurde, dass bestimmte Stämme Tropismen für bestimmte Organe zeigen37. Bei einem kleinen Prozentsatz der Tiere kann sich nach der Kolonisation auch eine spontane Meningitis entwickeln. Die Bestimmung der Todesursache sowie des Grades der Invasivität kann durch die Entnahme von zugehörigen Geweben (Lunge, Milz und/oder Gehirn) von Tieren am Endpunkt erreicht werden. Die Homogenisierung dieser Gewebe und die anschließende Beschichtung können auf das Vorhandensein invasiver Bakterien und entsprechender Titer hinweisen.

Ein Beispiel für eine Quantifizierung der Bakterienkulturdichte ist in Abbildung 3dargestellt. Wenn die Kultur zu konzentriert ist, wachsen Kolonien zu dicht, um einzeln gezählt zu werden, aber Kolonien, die aus einzelnen Zellen gewonnen werden, können unterschieden werden, wenn eine log-weise Verdünnungsreihe plattiert wird. Das Verschichten von drei technischen Replikationen pro Verdünnung minimiert die Variabilität. Bitte beachten Sie, dass bei der Quantifizierung von Bakterien, die aus einem nasalen Kolonisationsereignis gewonnen wurden, kokultivierte Verunreinigungen auftreten können, die andere Bakterienarten darstellen, die gleichzeitig aus dem murinen Nasopharynx isoliert sind. Wenn der bakterielle Stamm von Interesse irgendwelche bekannten Antibiotikaresistenzen hat (z. B. sind viele Stämme von S. pneumoniae resistent gegen Gentamycin oder Neomycin bis zu 5 g/ml), kann man die Inzidenz von Verunreinigungen minimieren, indem man die Wachstumsmedien in einer angemessenen Konzentration mit dem Antibiotikum ergänzt und so das Schadstoffwachstum begrenzt.

Die Durchflusszytometrie kann verwendet werden, um Zelloberflächenmarker an Nasenspülproben zu analysieren. Für die Analyse von Zelltypen, die im Zusammenhang mit einer Infektion rekrutiert werden, kann beispielsweise eine Mischung von Antikörpern, die für die grobe Differenzierung von Leukozyten spezifisch sind, einschließlich Makrophagen (F4/80+), Neutrophile (CD11b+ und Ly6G+) und T-Zellen (CD3+ und CD4+ oder CD8+) als zuvor veröffentlicht verwendet werden. Darüber hinaus können diese Analysen mit zytometrischen Flussanalysen kombiniert werden, die an verschiedenen Geweben oder Blut durchgeführt werden, um den Handel mit Immunzellen während einer Infektion besser zu verstehen. Aufgrund der begrenzten Anzahl von Zellen (in der Regel Nummerierung in den niedrigen Tausenden), die aus dem Nasopharynx isoliert werden können, ist die Identifizierung seltener Teilmengen in der Regel eine Herausforderung, obwohl Forscher, die dies erreichen möchten, erwägen sollten, Proben von mehreren Mäusen zu bündeln, um die gewünschten Zellzahlen zu erzielen. Da aus dieser Region eine endliche Anzahl von Zellen extrahiert werden kann, empfehlen wir außerdem, diese Daten hinsichtlich der Gesamtzahl der Zellen zu analysieren.

Obwohl die Proteinexpressionsniveaus in der Nasopharynx-Aktivität in der Regel niedrig sind und die Möglichkeit der Proteinproduktion einschränken, ist es möglich, die Produktion von Wirtsmolekülen als Reaktion auf die besiedelnden Bakterien auf RNA-Ebene zu analysieren. Um dies zu erreichen, können Nasenspülungen mit EINEM RNA-Lysepuffer anstelle von PBS durchgeführt werden, was eine Analyse der Genexpression ermöglicht. Für die qPCR-Verstärkungserkennung ist es wichtig, eine entsprechende Dissoziationskurve (Abbildung 11) auszuführen, um sicherzustellen, dass das richtige und gewünschte Produkt erkannt wurde. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass der Test jede doppelsträngige DNA einschließlich Primer-Dimer, kontaminierende DNA und PCR-Produkt aus falsch annealed Primer erkennen wird.

Wir hoffen, dass die hier beschriebenen Methoden Sie ermutigen werden, ein intranasales Kolonisationsmodell anzuwenden, um die Wirtsreaktionen auf Krankheitserreger zu untersuchen, die im Kontext dieser unteruntersuchten Region wichtig sind. Für bestimmte menschliche Krankheitserreger, wie S. pneumoniae, wirkt ein vorhergehendes nasopharyngeales Kolonisationsereignis als wichtiger Vorläufer der anschließenden bakteriellen Verbreitung und der tödlichen Fortsetzungen, die folgen können, einschließlich der Vermehrung in die Lunge, die zu einer Lungenentzündung oder sonst zum Blut führen kann, und daraus resultierenden Bakteriämieunden und septischen Schock. So, durch die Untersuchung der bakteriellen Kolonisation in dieser Region, können wir besser verstehen, wie man es zu kontrollieren und verhindern, dass ernstere Pathologie überhaupt auftreten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Jeffery Weiser von der University of Pennsylvania für sein Geschenk der klinischen Stämme von Streptococcus pneumoniae. Diese Arbeit wurde von den Canadian Institutes for Health Research finanziert. CV wurde durch ein M. G. DeGroote Stipendium und ein Stipendium der Canadian Thoracic Society finanziert. Diese Arbeit wurde von der Ontario Lung Association und den Canadian Institutes of Health Research (CIHR) finanziert. Die Arbeit im Bowdish-Labor wird zum Teil von Michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research und dem McMaster Immunology Research Centre unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1 ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001

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Immunologie Ausgabe 83 Streptococcus pneumoniae Nasenspülung Nasopharynx Murin Durchflusszytometrie RNA Quantitative PCR rekrutierte Makrophagen Neutrophilen T-Zellen Effektorzellen intranasale Kolonisation
Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit <em>Streptococcus pneumoniae</em>
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