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Immunology and Infection

Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/50490
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecule Medicine, McMaster University

Summary

A colonização da nasofaringe murina com Streptococcus pneumoniae e a subsequente extração de células aderentes ou recrutadas é descrita. Esta técnica envolve a lavagem da nasofaringe e a coleta do fluido através das nares e é adaptável para várias leituras, incluindo quantificação celular diferencial e análise da expressão mRNA in situ.

Abstract

A colonização nasofaríngea por Streptococcus pneumoniae é um pré-requisito para a invasão aos pulmões ou corrente sanguínea1. Este organismo é capaz de colonizar a superfície mucosa da nasofaringe, onde pode residir, multiplicar e eventualmente superar as defesas hospedeiras para invadir outros tecidos do hospedeiro. O estabelecimento de uma infecção no trato respiratório normalmente inferior resulta em pneumonia. Alternativamente, as bactérias podem se disseminar na corrente sanguínea causando bacteremia, que está associada a altas taxas de mortalidade2, ou então levar diretamente ao desenvolvimento de meningite pneumocócica. Entender a cinética e as respostas imunológicas à colonização nasofaríngea é um aspecto importante dos modelos de infecção por S. pneumoniae.

Nosso modelo de camundongos de colonização intranasal é adaptado dos modelos humanos3 e tem sido usado por vários grupos de pesquisa no estudo de respostas hospedeiras-patógenos na nasofaringe4-7. Na primeira parte do modelo, utilizamos um isolado clínico de S. pneumoniae para estabelecer uma colonização bacteriana auto-limitante que seja semelhante aos eventos de transporte em adultos humanos. O procedimento aqui detalhado envolve a preparação de um inóculo bacteriano, seguido da criação de um evento de colonização através da entrega do inóculo através de uma via intranasal de administração. Macrófagos residentes são o tipo de célula predominante na nasofaringe durante o estado estável. Normalmente, há poucos linfócitos presentes em camundongos não infectados8, no entanto a colonização mucosa levará a inflamações de baixo a alto grau (dependendo da virulência das espécies bacterianas e da cepa) que resultarão em uma resposta imune e o subsequente recrutamento de células imunes hospedeiras. Essas células podem ser isoladas por um lavado do conteúdo traqueal através das nares, e correlacionadas com a densidade das bactérias de colonização para entender melhor a cinética da infecção.

Protocol

Antes de começar: todas as etapas são feitas em um Gabinete de Segurança Biológica Nível 2 (BSL2) de Biohazard ( BSC) a menos que seja indicado de outra forma. Certifique-se de que obteve a aprovação biohazard apropriada para o uso de patógenos bacterianos infecciosos de acordo com as diretrizes institucionais antes do início dos experimentos. Além disso, certifique-se de que você tenha todos os materiais e reagentes necessários para realizar o procedimento preparado com antecedência. Os camundongos usados nesses experimentos incluíram camundongos C57BL/6 femininos dos Laboratórios Jackson, Charles River ou Taconic e tinham de 10 a 14 semanas de idade (embora não tenhamos encontrado diferenças significativas de gênero na cinética do despejo ou infecção da colonização nasal). Todos os camundongos usados nesses experimentos foram criados e mantidos em condições específicas de livre de patógenos, e estavam livres de vírus comuns, (LCMV, MNV, MPV, reovírus ECTV, e outras) bactérias(por exemplo, H. pylori) e parasitas(por exemplo, pinworm, ectoparasitas) por testes de amostras fecais, bem como avaliação anatômica frequente de ratos sentinelas cohoused dentro de suas salas de instalação. Ao realizar esses experimentos, recomendamos o uso de ratos de controle não inferiores a 10-12 semanas de idade e não mais do que 6 meses de idade. Camundongos mais jovens ou mais velhos do que essa faixa etária são mais suscetíveis à maior duração do transporte nasofaríngeo e ao aumento da probabilidade de disseminação da infecção. O fundo do rato é outra consideração importante que pode impactar os resultados de um experimento de colonização, pois vários grupos demonstraram que camundongos de diferentes origens genéticas têm diferentes suscetibilidades à cepa S. pneumoniae D39 (sorotipo 2)9,10. S. pneumoniae não é um patógeno murina que ocorre naturalmente e seu único reservatório natural é a nasofaringe humana. A transmissão ocorre por meio de gotículas respiratórias, e como os camundongos não produzem secreções respiratórias, camundongos individuais não podem transmitir a bactéria para outros camundongos, portanto não há preocupação com a transmissão de camundongos para camundongos11. Para uma visão geral visual dos procedimentos descritos neste manuscrito, consulte a Figura 1.

1. Preparação da Cultura S. pneumoniae

  1. Inocular 5 ml de ágar de soja trippática para o crescimento da suspensão de Streptococcus pneumoniae.
  2. Cultura em condições estáticas a 37 °C em 5% de CO2 até que o inóculo bacteriano atinja o crescimento da fase de tronco com uma densidade líquida correspondente de 108 UFC/ml, conforme determinado por um odômetro definido para 600 nm. A leitura exata correspondente a esta UFC difere dependendo da cepa bacteriana selecionada específica; para a maioria das cepas de S. pneumoniae isso corresponde a uma faixa deOD 600 de 0,45-0,55. Normalmente, as cepas de s. pneumoniae na cultura líquida crescerão para essa densidade dentro de 1,5-2,5 horas sob as condições recomendadas, sem necessidade de subcultura. A cultura não deve ser permitida a superação (além de uma leitura de OD de 0,75) pois isso representa o ponto em que as bactérias não estão mais em crescimento de fase de registro e estão sofrendo extensas autólises.
  3. Cada rato será inoculado com aproximadamente 107 bactérias. Portanto, para cada 9 ratos a serem colonizados, pipeta 1 ml de inóculo em um tubo Eppendorf e gire a 15.000 x g por 1 min. Uma pelota esbranquiçada deve ser visível. Remova o supernasciente, tomando cuidado para não perturbar a pelota e resuspensar as bactérias em 100 μl de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), aumentando assim a concentração para 109 UFC/ml. Nesta fase, as bactérias devem permanecer viáveis, mas não se replicarão prontamente.
  4. Se usar várias alíquotas, combine-se em um tubo para controlar pequenas variações inter-amostrais na densidade bacteriana.
  5. Mantenha as bactérias no gelo até ficarem prontas para a inoculação, por um máximo de 1 hora.
  6. Para obter uma contagem bacteriana exata, realize séries de diluição serial em termos de tronco começando com um inóculo bacteriano puro. Diluir serialmente 10 vezes, adicionando 10 μl de 90 μl de PBS estéril.
  7. Aplauda 3 gotas de 10 μl de amostras de diluições 10-5 - 10-9, mais um controle de contaminação somente PBS, em seções separadamente rotuladas de ágar de soja tripptic (TSA) suplementado com 5% de sangue de ovelha(Figura 2). Certifique-se de que as pontas da pipeta sejam alteradas para cada etapa diluindo de uma maior concentração de UFC para uma menor concentração de UFC para evitar o excesso de bactérias e a crescente variabilidade dos resultados. Placas de ágar de sangue humano (HBA) também podem ser usadas em vez de TSA. Uma vez que muitas cepas de S. pneumoniae são resistentes à neomicina (de 5-20 μg/ml), este antibiótico também pode ser adicionado ao meio de ágar de escolha durante a fase de preparação da placa. Isso facilita a enumeração, pois elimina bactérias não ressarentes. A suscetibilidade antibiótico de cada cepa deve ser testada com antecedência para determinar a concentração ideal de antibiótico para usar em cada cepa bacteriana.
  8. Deixe secar por 15-30 min descobertos, depois cubra as placas e coloque de cabeça para baixo na incubadora bacteriana definida a 37 °C e 5% de CO2. Cresça colônias bacterianas na placa por 24 horas.
  9. Determine o número de unidades formadoras de colônias e sua concentração correspondente. Com base nas determinações do valor OD600, a concentração deve estar dentro da faixa de 1-4 x 109 COLÔNIAS DE CFU/ml. S. pneumoniae devem aparecer como pequenas colônias circulares de cor amarelada-bege, com uma pequena depressão no centro dando-lhes uma aparência semelhante a donut(Figura 3).

2. Colonização Intranasal Murine

  1. Contenha os ratos colocando-os em um aparelho de contenção de camundongos (um tubo Falcon modificado de 50 ml com a ponta cortada para criar uma abertura) protegendo-os pela base de seu corpo com o polegar para que seus narizes saiam da extremidade afilada do aparelho de contenção(Figura 4). O uso deste aparelho permite a imobilização da cabeça do camundongo e a segregação de seus nares de forma a minimizar o movimento, bem como impedir tentativas do animal de mastigar a ponta pipeta, permitindo a entrega completa do inóculo. Alternativamente, os camundongos podem ser imobilizados através de arranhões no pescoço e contenção manual. Não recomendamos anestesia dos animais antes da inoculação intranasal. Administrar o inóculo aos animais sob anestesia resulta em parte do inóculo se espalhando para os pulmões12,13.
  2. Usando uma pipeta P10 ou P20, inocular cada rato depositando 10 μl da cultura preparada, distribuindo-o uniformemente entre ambas as nares (permita que o inóculo escorresse no nariz, pulsando a inoculação gradualmente, levando tempo para os ratos inalarem inóculo). Para conseguir a entrega completa do inóculo, pausa a administração a qualquer momento o mouse começa a mover seu nariz excessivamente. Todo o inóculo não pode ser injetado nas nares, pois os ratos podem expulsar alguns pelo nariz durante a expiração; no entanto, como a quantidade expelida tende a ser minúscula, e o inóculo contém uma quantidade extremamente alta de bactérias, isso não afeta significativamente a carga bacteriana colonizadora. Além disso, a área de superfície disponível para colonização na mucosa nasofaríngea é limitada e, consequentemente, nós e outros descobrimos que a dose recomendada de10 7 é suficiente para obter níveis consistentes de bactérias em todos os camundongos, resultando em variabilidade mínima em quantidades iniciais de bactérias colonizadoras14,15 .
  3. Pese camundongos se utilizar indicadores de peso como parte do seu monitoramento de ponto final. Monitore camundongos a cada 12-24 horas para sintomas clínicos, incluindo letargia, pele de babados e perda de peso. Os camundongos normalmente não apresentarão sintomas de doença até 3-5 dias após a colonização, e estes serão precedidos pela perda de peso, que pode em média cerca de 5% do peso corporal total por dia. À medida que os camundongos ficam cada vez mais doentes, eles assumirão posturas curvadas e mostrarão diminuição da atividade e diminuição da capacidade de resposta à estimulação, incluindo o manuseio. Nesta fase, a doença é tipicamente indicativa de sepse e/ou pneumonia e provavelmente será terminal, embora os camundongos possam ser tratados com 1 ml de soro fisiológico subcutâneo diariamente para melhorar os resultados. Os camundongos sobreviventes devem começar a apresentar melhora após o 7º dia pós-colonização, como evidenciado pela estabilização do peso seguida do ganho de peso, embora diferentes cepas de S. pneumoniae possam induzir a doença mais rapidamente e resultar em progressão de sintomas clínicos ao longo de uma linha de tempo diferente. Consulte a Figura 5 para obter um resultado representativo de peso rastreado em camundongos colonizados com a cepa P1547.

3. Coleção de Amostras de Lavage Nasal

Antes do início: prepare agulhas canuladas usando seringas de 1 ml tampadas com agulhas chanfradas de 3/8 G. Corte 2,5 cm de tubos de polietileno PE20 com diâmetro interno de 0,38 mm, garantindo que cada extremidade tenha uma ponta chanfrada. Utilizando fórceps, deslize um pedaço de 2,5 cm de comprimento da tubulação de polietileno PE20 (diâmetro interno 0,38 mm) na ponta da agulha, evitando perfurar o lado do tubo. Agulhas canuladas podem ser mantidas em 70% de etanol até que seja necessário.

  1. Eutanize ratos experimentais. Como a luxação cervical pode potencialmente danificar a traqueia, este método de eutanásia deve ser evitado. Nosso método preferido é a anestesia isoflurane seguida de exsanguinação, no entanto, garantir que você siga as diretrizes institucionais ao selecionar o modo de eutanásia.
  2. Utilizando 70% de etanol aquoso, esterilize a pele superoanterior do animal, particularmente o pescoço, tomando cuidado para evitar que o etanol acesse as nares.
  3. Faça um único corte longitudinal ao longo da linha média do pescoço do animal, e dois cortes horizontais em cada extremidade, criando uma abertura para vislumbrar a traqueia.
  4. Retire cuidadosamente a pele para ambos os lados, revelando tecido do pescoço por baixo.
  5. Traqueia deve ser visível, cercada por músculos longitudinais de ambos os lados. Corte-os cuidadosamente para fornecer uma visão clara da própria traqueia, tomando cuidado para não cortar a vasculatura circundante.
  6. Se a vasculatura foi cortada e o sangue estiver presente, antes do processo, permitir que o sangramento pare e, em seguida, limpe a área várias vezes, dispensando PBS estéril e usando gaze estéril para absorver suavemente o excesso de umidade na área.
  7. Uma vez que a traqueia esteja devidamente exposta, faça um corte transversal e semilunar na traqueia a meio caminho de cima(Figura 6).
  8. Elabore 1.000 μl de PBS esterilizado em agulha canladada previamente preparada.
  9. Insira cânula na traqueia em direção ao nariz, mantendo a borda chanfrada apontando para baixo para facilitar a inserção(Figura 7). Uma vez que a agulha esteja no lugar, gire-a 180°, e teste suavemente para cima até sentir resistência à luz.
  10. Coloque Eppendorf designado para coleta de amostras logo abaixo do nariz do mouse.
  11. Teste a colocação correta da agulha dispensando uma quantidade mínima (~20 μl) de fluido de lavagem PBS - a gota de fluido deve se formar ao redor das nares do mouse; se for esse o caso, proceda à etapa 3.13).
  12. Se o teste pbs emergir diretamente para fora da boca do animal, puxar a cânula para trás, e reposicionar-se novamente sondando suavemente para a frente até que uma resistência muito leve seja sentida - tome cuidado para não empurrar a cânula muito longe desta resistência, como você vai movê-la além do paladar nasal e através da cavidade oral.
  13. Dispensar rapidamente o conteúdo da agulha para ajudar a deslocar e coletar a quantidade máxima de células - o conteúdo deve fluir através das nares do mouse e para o tubo de coleta. Coloque a amostra imediatamente no gelo.
  14. Para coletar amostras para análise de RNA, repita as etapas 3.8-3.13) usando uma agulha canulada contendo 500 μl de tampão de RNA no mesmo mouse. Isso permitirá a coleta de amostra de liseto das populações de células remanescentes, em grande parte composta do epitélio mucosal nasofaríngeo, uma vez que as células não adesedentes deveriam ter sido removidas após a lavagem inicial da PBS. Observe que o tampão de rna lysis irá desnudir o epitélio e destruir o tecido circundante, por isso deve-se tomar cuidado para evitar o contato com órgãos como os pulmões, se a retenção desses tecidos for desejada. Uma vez coletada, coloque a amostra no tampão de rna lise diretamente no gelo seco para congelar. Uma vez no tampão de lise, as amostras podem ser armazenadas de acordo com as instruções do fabricante, e são estáveis normalmente a -70 °C por vários meses.

4. Determinação da Carga Bacteriana na Nasofaringa

  1. Quantitate bactérias preparando uma série de diluição serial para cada amostra de lavage nasal murina. Em geral, espera-se que a carga bacteriana seja entre 0-104 UFC, portanto, realizar três diluições seriais de 10 vezes. Adicione 10 μl da amostra de lavage nasal (100 UFC/ml) ao primeiro tubo a uma concentração de 10-1 CFU/ml. Vórtice completamente.
  2. Divida a placa bacteriológica em quadrantes e rotule os quadrantes cada um com um membro da série de diluição (10-10-3 CFU/ml). Aplauda 3 gotas de 10 μl amostras das 3 diluições e a amostra pura em placas de ágar de soja tripptica suplementadas com 5% de sangue de ovelha, como na Figura 2.
  3. Deixe secar por 15-30 minutos descobertos, depois cubra as placas e coloque de cabeça para baixo na incubadora bacteriana com condições ideais para o crescimento bacteriano (tipicamente 37 °C e 5% de CO2).
  4. Cresça colônias bacterianas na placa por 18-24 horas.
  5. Determine o número de bactérias colonizadoras, com a média das colônias formadas em placa para cada diluição(Figura 3). A Figura 8 demonstra densidade bacteriana em diferentes momentos, conforme determinado pela cultura de lavages nasais, em camundongos colonizados com 3 cepas diferentes de S. pneumoniae por até 21 dias.

5. Preparação de Amostras para Cicímetro de Fluxo

Antes de começar: Prepare a mistura de anticorpos. Para quantificação de populações leucócitos, recomendamos a seguinte mistura nas diluições especificadas: PE-Ly6G (clone 1A8, 1 μg/ml), FITC-Ly6C (clone AL-21,1 μg/ml), eFluor 450-CD45 (clone 30-F11, 2,67 μg/ml), APC-F4/80 (clone PM8 RUO, 0,67 μg/ml), PerCP-Cy5.5-CD11c (clone N418 RUO, 0,5 μg/ml), PE-Cy7-CD11b (clone M1/70, 0,33 μg/ml), Alexa Fluor 700-CD3 (clone 1782, 4 μg/ml), eFluor 605NC-CD4 (clone GK1.5, 6,67 μg/ml). Observe que esta mistura é de 2x de concentração (ver passo 5.5). Todos os anticorpos devem ser diluídos no tampão de lavagem dos FACs (soro de bezerro fetal de 0,5%, 2mM EDTA, 0,1% azida de sódio na PBS) que também deve ser preparado antecipadamente. Em uma mistura de anticorpos de controle combinados de isótipo, idealmente do mesmo fornecedor dos anticorpos rotulados e nas mesmas concentrações que os anticorpos específicos, devem ser preparados. As amostras tratadas com os anticorpos de controle do isótipo funcionarão como o controle negativo. Qualquer fluorescência observada nas amostras tratadas com os anticorpos de controle do isótipo deve ser considerada de fundo.

  1. Prechill uma centrífuga capaz de girar tubos Eppendorf de 1,5 ml a 4 °C.
  2. Centrífuga amostras de lavage nasal a 2.000 x g por 10 min a 4 °C. Pipeta cuidadosamente para fora supernante e reserva. Nota: devido à pequena quantidade de células dentro da nasofaringe, a pelota celular não será visível a menos que haja contaminação indesejada de glóbulos vermelhos, que será vermelho brilhante. Se isso for visto, a amostra deve ser descartada.
  3. Amostra de resuspend em 50 μl de Fc? Anticorpo RIIb/CD16-2 (2.4G2) (que liga receptores Fc e reduz a ligação de anticorpos não específicos) em FACs Wash Buffer a uma concentração de 4 μg/ml.
  4. Incubar amostras no gelo por 30 minutos.
  5. Adicione 50 μl de mistura de anticorpos fluorescentes concentrados de 2x pré-preparados à amostra. Reserve uma amostra representativa de cada grupo experimental para atuar como um controle isótipo. Adicione a mistura de anticorpos isótipo a esta amostra em vez de mistura de manchas.
  6. Incubar amostra no gelo por 1 hora.
  7. Centrífuga amostras a 2.000 x g para 10 min a 4 °C. Descarte supernaspe e resuspend em 200 μl de PBS.
  8. Repita o passo 5.7.
  9. Após a segunda lavagem, as amostras centrífugas novamente a 2.000 x g por 10 min a 4 °C.
  10. Resuspend em PBS (se executar amostra imediatamente) ou 2% paraformaldeído (se executar amostras de 1-3 dias após a coloração).
  11. Ao realizar a citometria de fluxo, colete a quantidade máxima de eventos por amostra ou até que toda a amostra tenha sido aspirada. Em camundongos jovens e não infectados, saudáveis, isso será de apenas 1.000-2.000 eventos totais; Durante um evento de colonização bacteriana, esse número pode aumentar mais de 2 a 5 vezes o status da doença em animais e fatores como idade e fundo genético. A Figura 9 mostra resultados representativos de citometria de fluxo coletados de um citômetro de fluxo Becton Dickenson LSRII de 3 lasers usando uma dispersão dianteira de 450 e dispersão lateral de 300, embora recomendemos a otimização de parâmetros para o citómetro de fluxo específico que você pretende usar antes da coleta da amostra. Nota: se uma amostra contiver mesmo vestígios de contaminação sanguínea, o total de eventos coletados será significativamente maior do que o esperado e a amostra deve ser descontada da análise.

6. Análise quantitativa de PCR (qPCR) das Lavages Nasal

  1. O degelo das células lístidas a partir da temperatura ambiente do passo 3.14.
  2. Siga o protocolo recomendado fornecido com a extração preferida de RNA de escolha.
  3. Após concluir o procedimento de extração de RNA como instruído, quantifique a quantidade de RNA usando um método baseado em espectrofotômetro ou eletroforese(Figura 10). Nós rotineiramente obtemos entre 975 e 3.250 ng total de RNA por amostra com uma razão de 260/280 nm de >1,7 ou um número de integridade de RNA (RIN) em torno de 8,1±0,13.
  4. Transcreva cDNA usando a Transcriptase Reversa M-MULV de acordo com o protocolo do fabricante com 1.000 ng de RNA (máximo de 13 μl).
  5. Diluir as amostras de CDNA resultantes 8x, e alíquota igualmente em 4 tubos separados para armazenamento a longo prazo a -20 ou -80 °C.
  6. Para medir a expressão genética por qPCR, prepare 25 μl amostras de reações em triplicado no gelo ou bloco frio contendo: 12,5 μl de 2x qPCR master mix do kit qPCR de sua escolha, 0,25 μl de corante de referência, 2 μl de cDNA diluído (etapa 7.5), 1 μl de primers mistos para a frente e reverso (final de 400 nM), 9,25 μl de água livre RNAse-DNAse. Este protocolo é uma adaptação dos métodos publicados anteriormente16.
  7. Em geral, descobrimos que uma amplificação qPCR de duas etapas ( 95 °C para 10 min seguido por até 40 ciclos x [95 °C x 15 seg, 60 °C x 1 min]) é eficaz(Figura 11a); no entanto, cada par de primer deve ser otimizado. As curvas de dissociação (derretimento) devem ser realizadas após a amplificação para garantir que não ocorreu nenhuma amplificação inespecífica. amplificação (Figura 11b)
  8. Executamos rotineiramente curvas padrão para cada gene analisado, bem como um calibrador padrão (derivado de homogeneato de pulmão ou baço) para cada placa de 96 poços analisada. Os valores relativos da transcrição são obtidos pela primeira normalização dos valores do limiar de ciclo bruto (TC) pelo corante de referência e transformando os valores resultantes através da respectiva curva padrão. Essas quantidades relativas são posteriormente normalizadas para o calibrador padrão e um gene de limpeza, conforme aplicável.

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Representative Results

A Figura 1 representa uma visão geral que resume os principais passos do protocolo. As figuras 2-3 fornecem visualização da metodologia microbiológica inerente aos protocolos aqui descritos. A Figura 4 representa o posicionamento adequado de um rato para realizar uma colonização intranasal, enquanto a Figura 5 retrata tipicamente mudanças no peso de camundongos colonizados com cepa de S. pneumoniae P1547. As figuras 6-7 representam etapas específicas da porção de lavage nasal do processo, para visualização assistida dessas duas técnicas. As figuras 8-11 consistem em resultados representativos de análises realizadas em amostras coletadas da nasofaringe de um rato após lavage nasal. Especificamente, a Figura 8 é um resultado representativo da carga bacteriana na nasofaringe, conforme determinado através da cultura de lavages nasais obtidos de camundongos colonizados com cepa de S. pneumoniae P1121, P1547 ou P1542. A Figura 9 representa fenotipagem celular de células imunes nasofaríngeas isoladas usando técnicas citométricas de fluxo. As figuras 10-11 apresentam resultados representativos relativos à análise expressional do mRNA nasofaríngeo via PCR quantitativo.

Figure 1
Figura 1. Fluxograma dos procedimentos de isolamento de células de lavage intranasal e nasal usando um modelo de mouse. Primeiro, as bactérias são preparadas para a inoculação, e depois dadas aos sujeitos murinos intranasalmente. Após o tempo desejado, os camundongos são eutanizados através de sangramento terminal, e suas células nasofaríngeas são isoladas através de dois degraus de lavage nasal: um passo de lavagem PBS seguido de uma lavagem secundária no tampão de lise RNA. As células da lavagem preliminar da PBS são isoladas e analisadas usando técnicas de citometria de fluxo, enquanto o RNA isolado da segunda amostra pode ser usado para investigar as abundâncias relativas de moléculas de interesse no nível transcricional.

Figure 2
Figura 2. Para determinar a concentração bacteriana, as gotas de 10 μl são emplacar em triplicado em uma placa dividida em seções que representam uma diluição serial diferente. Essas gotas são então permitidas para secar e as placas são incubadas durante a noite a 37 °C, 5% DE CO2.

Figure 3
Figura 3. Concentração de pneumonia estreptocúpica isolada da nasofaringe de um animal representativo. Cada colônia discreta representa uma unidade formadora de colônias, cada coleção de colônias representa uma gota de 10 μl (banhada em triplicados) e cada quadrante na placa representa uma diluição serial separada. A concentração bacteriana é determinada na UFC/ml pela média do número de colônias contáveis e totalmente formadas dentro e, entre elas, quadrantes qualificados.

Figure 4
Figura 4. O movimento de qualquer rato a ser inoculado deve ser minimizado, particularmente no pescoço, para permitir a entrega adequada do inóculo bacteriano. Para isso, o rato sujeito é contido em um aparelho de restrição modificado que consiste em um tubo Falcon de 50 ml com uma abertura em sua extremidade afilada. O camundongo é então posicionado para que seu nariz emerja da abertura, onde pode ser acessado pelo pesquisador, permitindo a realização da inoculação intranasal.

Figure 5
Figura 5. Peso de camundongos colonizados com cepa P1547 de um mínimo de 2 experimentos representativos rastreados diariamente após a inoculação inicial (n=6) para retratar mudanças típicas de peso esperadas após a colonização nasofaríngea. O peso é mostrado como uma mudança percentual do peso inicial. Observe a perda de peso inicial esperada observada entre os dias 3-5, seguida de estabilização e aumento gradual de peso em camundongos sobreviventes.

Figure 6
Figura 6. Após a exposição traqueal, os músculos longitudinais flanqueados são removidos cuidadosamente antes da incisão traqueal de uma maneira que não enima os vasos sanguíneos circundantes. Uma pequena incisão semilunar é então feita no meio da traqueia usando uma tesoura cirúrgica fina. É importante cortar o diâmetro da traqueia apenas parcialmente, deixando-a intacta posteriormente.

Figure 7
Figura 7. Inserção da agulha canulada na abertura traqueal para cima em direção ao nariz. Uma vez que a cânula esteja no lugar, teste suavemente até que a resistência seja atingida, em seguida, limpe o conteúdo através das nares.

Figure 8
Figura 8. Uma série representativa de carga bacteriana isolada da nasofaringe usando o procedimento de lavage nasal descrito após a colonização de camundongos C57BL/6 (triângulos) com cepa de S. pneumoniae P1547 (A), P1542 (B) ou P1121 (C). Uma colonização comparativa de camundongos BALB/C (círculos) após a colonização P1121 também é exibida em (C). Diferentes pontos de tempo são mostrados ao longo da colonização, incluindo os dias 3, 7, 14 e 21. Geralmente, uma alta carga inicial é esperada no dia 3, com pouca diminuição no dia 7. A liberação é normalmente iniciada até o dia 14, com liberação total ou quase completa evidenciada até o dia 21 após a colonização com a maioria das cepas. Clique aqui para ver a figura maior.

Figure 9
Figura 9. Histograma representativo (A) e gráfico de pontos (B) de células totais isoladas de lavages nasais murinas, conforme analisado pela citometria de fluxo. A expressão diferencial dos marcadores nas populações celulares permite a identificação de subconjuntos leucócitos através do uso de anticorpos fluorescentes direcionados contra essas proteínas. Como mostrado aqui, as populações de leucócitos são selecionadas primeiro gating em células singlet usando um portão de dispersão dianteira (área) versus dispersão dianteira (largura) e,emseguida, enriquecendo para células CD45+ dentro desse subconjunto(B). Essa população pode ser subdividida em tipos de células específicas por gating para cd11b e ly6G de neutrófilos duplos positivos(C). A análise da população cd11b pode ser realizada para revelar células F4/80+, CD11b-macrófagos(D) ou CD11b-, CD3 e CD4 duplamente positivas células CD4 T(E). Populações celulares podem ser fenotipadas desde que expressem um, ou uma combinação de vários receptores de superfície únicos que podem ser usados para distingui-los de outros tipos de células. Clique aqui para ver a figura maior.

Figure 10
Figura 10. Eletroferograma representativo após sequenciamento automático de eletroforese de uma amostra isolada de lavages nasais murinas. O eletroferograma resultante mostra os dados de quantitação e a assinatura característica de uma amostra total de RNA de alta qualidade derivada da região nasofaríngea. Ao realizar análises do RNA total, as áreas sob os picos de RNA para os dois principais RNA ribossômicos, 18S e 28S, são usadas para calcular sua razão correspondente. Mudanças significativas nas proporções de picos atribuíveis a 18S e 28S são tipicamente indicativas de RNA degradado. O grau de degradação pode ser resumido pelo número de integridade do RNA (RIN); o RIN para esta amostra representativa é 8.1. Um exemplo de RNA altamente degradado é mostrado em (B) e (C), e o RIN subsequente é 1.9 e 4.6, respectivamente. Clique aqui para ver a figura maior.

Figure 11
Figura 11. Gráfico de amplificação (A) e curva dissociação (derretimento) (B) da análise qPCR de lisatos de células de lavagem nasal, fornecendo um exemplo de como essas duas leituras devem normalmente olhar após uma amplificação eficiente e corretamente detectada de produtos de mRNA isolados da nasofaringe murina. Representado é uma curva padrão para o gene de limpeza 18S. Os resultados exibidos em (A) mostram o produto PCR desejado após a amplificação usando primers contra GAPDH. A linha representa o limiar de ciclo (Ct). O ponto em que as parcelas de amplificação correspondentes a diferentes amostras cruzam esse limiar permite a comparação entre as amostras, com valores mais baixos correspondentes a maiores quantidades de RNA de juros contidas nele. O enredo em (B) mostra que a temperatura máxima de fusão do produto qPCR é de 85 °C e que não há produtos contaminantes presentes nesta reação, o que apareceria como um pico adicional separado do pico desejado do produto. Clique aqui para ver a figura maior.

Nome da tensão Serótipo Virulência Mortalidade em camundongos Duração esperada da colonização
P1121 23F Assintomático 0% 21-28 dias
P1542 4 baixo 0-20% 21-28 dias
P1547 6A Meados 20-50% 14-21 dias
D39 2 alto 70-100% 14-21 dias

Mesa 1. Uma visão geral tabular de 4 cepas isoladas clínicas S. pneumoniae comumente empregadas, seu número de sorotipo correspondente, grau associado de virulência, proporção esperada de invasividade dentro de um subconjunto colonizado de camundongos e duração típica de uma colonização nasofaríngea.

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Discussion

Neste estudo, foram apresentados métodos detalhados para a colonização intranasal de camundongos utilizando uma cepa de streptococcus pneumoniae e o subsequente isolamento e caracterização das células imunes recrutadas para nasofaringe em resposta à bactéria. Demonstramos como um inóculo bacteriano pode ser cultivado em mídia rica em nutrientes e usado para estabelecer um evento de colonização em camundongos, que é inicialmente restrito à nasofaringe. Em seguida, mostramos como os tipos de células imunes que são recrutados para a nasofaringe podem ser isolados após exposição traqueal, incisão e uma lavagem nasal através do uso de uma agulha canulada. Amostras de lavage nasal podem ser coletadas em PBS para isolar células intactas e levemente aderentes; o RNA de células mais firmemente aderentes e camada mucosa epitelial circundante pode ser isolado aplicando uma lavagem secundária consistindo de tampão de rna lise. A primeira dessas amostras pode então ser usada para fenótipo das células específicas recrutadas no contexto da colonização através de técnicas de citometria de fluxo, enquanto estas podem ser aplicadas à análise Q-PCR, para determinar as funções efetivas dessas células recrutadas, olhando para a expressão transcricional dos reguladores imunológicos de interesse. As amostras de lavage nasal podem adicionalmente ser usadas para determinar a cinética do despejo de um evento de colonização bacteriana comparando diferentes grupos experimentais para abordar questões específicas de pesquisa.

A utilização desse método de colonização intranasal permite o estabelecimento de um evento de colonização que inicialmente se limita à nasofaringe do animal. Qualquer disseminação subsequente da bactéria no sangue ou órgãos, portanto, ocorre secundária a violações nas defesas imunológicas localizadas dentro da mucosa nasofaríngea. A progressão passo a passo alcançada através desse modelo reflete com mais precisão o processo de invasão pneumocócica em humanos, permitindo estudar a dinâmica entre as bactérias colonizadoras e a mucosa nasal hospedeira - e talvez entender melhor as mudanças na patogenicidade bacteriana e/ou imunidade hospedeira que permitem o desenvolvimento da disseminação da doença. Isso contrasta com modelos que desistam do estabelecimento de um evento inicial de colonização e optem por estudar doenças invasivas isoladamente através da entrega direta do inóculo bacteriano aos pulmões via instilação intratrachael, ao sangue via injeção vascular ou ao peritônio através de injeção peritérea.

A condução de um lavage nasal pbs após um evento de colonização permite o isolamento de células não ou levemente aderentes recrutadas para a nasofaringe, bem como qualquer bactéria associada mucosamente. Deve-se notar, no entanto, que essa técnica é limitada, pois não liberará células ou bactérias que viajaram entre ou abaixo do epitélio, nem permitirá a colheita de células ou bactérias localizadas no tecido linfoide associado às naais (NALT), órgão linfoide que foi relatado como um local potencial de infecção após uma colonização pneumocócica17,18. Se for desejado um estudo mais aprofundado do NALT, recomendamos a microdisseção e remoção deste tecido por atacado para estudo após o lavage nasal pbs; como essas duas técnicas não são mutuamente exclusivas, elas podem ser conduzidas no mesmo animal. No entanto, devido à natureza lítica e destrutiva da etapa de colheita do RNA (o lavage secundário usando tampão de rna lysis), esta etapa deve ser omitida se pretender colher o NALT. Embora a lavagem nasal seja um procedimento menos tecnicamente desafiador, para grupos que desejam obter uma avaliação mais abrangente da carga bacteriana que inclui não apenas bactérias associadas à mucosa, mas também aquelas que invadiram o tecido nasofaríngeo, sugerimos a colheita do tecido nasofaríngeo após a remoção do osso superior do crânio de camundongos colonizados e dissecção do tecido dentro da concha nasal, como descrito por outros19.

A natureza de uma resposta imune provocada depende da interação entre hospedeiro e patógeno. Mais de 90 sorotipos de S. pneumoniae foram caracterizados até o momento, todos com diferentes níveis de patogenicidade e expressão do fator virulência, resultando em prevalência diferencial na população humana20-23. Da mesma forma, em camundongos, foi relatado que a extensão e cinética associada à resposta imune provocada em resposta a uma colonização nasofaríngea depende da própria cepa colonizadora24. Assim, a seleção de uma cepa adequada para utilizar para o estabelecimento de uma colonização nasofaríngea não é uma questão trivial, nem a seleção de fundo genético de camundongos. A Figura 8 fornece dados amostrais que retratam a cinética da liberação de uma colonização nasofaríngea de 3 diferentes cepas de S. pneumoniae após a colonização intranasal de camundongos fêmeas em um fundo C57BL/6. A Tabela 1 fornece uma visão geral do grau de virtuosidade e duração do tempo de colonização esperado (quando utilizado no fundo C57BL/6) com 4 cepas isoladas clínicas S. pneumoniae descritas na literatura e conhecidas por serem capazes de estabelecer uma colonização nasofaríngea25: o avirulent P1121 (sorotipo 23F)26,27 a baixa virulência P1542 (sorotipo 4)28, a virulência média P1547 (sorotipo 6A)29-31, e o amplamente utilizado, bem caracterizado, altamente virulento D39 (sorotipo 2)32-36. Se o objetivo experimental é estudar rigorosamente um evento de colonização nasal assintomática sem a divulgação bacteriana para outros tecidos, recomendamos o uso da cepa avirulent P1121, que é caracterizada como um potente colonizador, pois eventos de colonização mais longos (até 28 dias antes do despejo observado) são uma marca dessa cepa. Normalmente, camundongos colonizados com P1121 não correm risco de doença invasiva e não apresentarão indicadores clínicos de doença (com exceção da perda temporária de peso). O restante das cepas deve ser empregado dependendo do grau desejado de virulência e mortalidade associada, com virulência considerada não o grau de infecção que se desenvolve dentro de um camundongo individual, mas sim a proporção de camundongos que apresentam sinais clínicos de doença. Deve-se notar também que, tipicamente, o grau de virulência se correlaciona inversamente com o comprimento da duração da colonização, com cepas mais virulentas colonizando por um período mais curto de tempo. Todas as 3 cepas virulentas descritas levam à mortalidade em camundongos devido, mais comumente, à sepse, com pneumonia fulminante, ou pneumonia simultânea e sepse em desenvolvimento em um subconjunto de camundongos. As diferenças na localização de bactérias invasivas podem ser específicas da cepa, pois foi relatado anteriormente que certas cepas apresentam tropismos para determinados órgãos37. Em uma pequena porcentagem de animais, a meningite espontânea também pode se desenvolver após a colonização. A determinação da causa da morte, bem como o grau de invasividade, pode ser realizada através da coleta de tecidos associados (pulmões, baço e/ou cérebro) de animais no ponto final. A homogeneização desses tecidos e o revestimento subsequente podem indicar presença de bactérias invasivas e mamatas correspondentes.

Um exemplo de quantificação da densidade da cultura bacteriana é mostrado na Figura 3. Se a cultura é muito concentrada, as colônias crescem muito densamente para serem contadas individualmente, no entanto colônias derivadas de células únicas podem ser distinguidas se uma série de diluição em termos de troncos for banhada. O revestimento de três réplicas técnicas por diluição minimiza a variabilidade. Por favor, note que ao quantificar bactérias recuperadas de um evento de colonização nasal, pode-se encontrar contaminantes coculturados, representando outras espécies bacterianas simultaneamente isoladas da nasofaringe murina. Se a cepa bacteriana de interesse tiver alguma resistência a antibióticos conhecida (por exemplo, muitas cepas de S. pneumoniae são resistentes à gentamicina ou neomicina até 5 μg/ml), pode-se minimizar a incidência de contaminantes complementando a mídia de crescimento com o antibiótico em uma concentração adequada, limitando assim o crescimento contaminante.

A citometria de fluxo pode ser usada para analisar marcadores de superfície celular em amostras de lavage nasais. Por exemplo, para a análise de tipos celulares recrutados no contexto de uma infecção, uma mistura de anticorpos específicos para a diferenciação bruta de leucócitos, incluindo macrófagos (F4/80+), neutrófilos (CD11b+ e Ly6G+), e células T (CD3+ e CD4+ ou CD8+), podem ser usados como publicado anteriormente . Além disso, essas análises podem ser combinadas com análises citométricas de fluxo realizadas em diferentes tecidos ou sangue, para melhor compreender o tráfico de células imunes durante o curso de uma infecção. Devido ao número limitado de células (tipicamente numeradas nos milhares baixos) que podem ser isoladas da nasofaringe, identificar subconjuntos raros é tipicamente desafiador, embora os pesquisadores que desejam realizar isso devem considerar a coleta de amostras de vários camundongos para alcançar a contagem de células desejada. Além disso, como um número finito de células pode ser extraído dessa região, recomendamos analisar esses dados em relação ao número total de células.

Embora os níveis de expressão proteica sejam tipicamente baixos na nasofaringe limitando a possibilidade de avaliar a produção de proteínas, é possível analisar a produção de moléculas hospedeiras em resposta às bactérias colonizadoras no nível de RNA. Para isso, as lavages nasais podem ser conduzidas usando tampão de rna lysis no lugar da PBS, que permite a análise da expressão genética. Para a detecção de amplificação qPCR, é importante executar uma curva de dissociação correspondente (Figura 11) para garantir que o produto correto e desejado seja detectado. Isso se deve ao fato de que o ensaio detectará qualquer DNA duplo encalhado, incluindo dimers de primer, DNA contaminante e produto PCR de primer mal-lançado.

Esperamos que os métodos aqui descritos o incentivem a aplicar um modelo de colonização intranasal para estudar respostas hospedeiras a patógenos importantes no contexto desta região subestudada. Para certos patógenos humanos, como S. pneumoniae, um evento de colonização nasofaríngea anterior atua como um importante precursor da disseminação bacteriana e das sequelas fatais que podem vir a seguir, incluindo a propagação para os pulmões, que pode levar a pneumonia, ou então ao sangue, e bacteremia resultante e choque séptico. Assim, ao estudar a colonização bacteriana nesta região, podemos entender melhor como controlá-la e evitar que patologias mais graves ocorram completamente.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Jeffery Weiser da Universidade da Pensilvânia por seu dom das cepas clínicas de Streptococcus pneumoniae. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde. Cv foi financiado por uma bolsa M. G. DeGroote e uma bolsa da Sociedade Torácica Canadense. Este trabalho foi financiado pela Ontário Lung Association e institutos canadenses de pesquisa em saúde (CIHR). O trabalho no laboratório Bowdish é apoiado em parte por Michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research e pelo McMaster Imunology Research Centre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1 ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001

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Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com <em>Streptococcus pneumoniae</em>
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