Summary

Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Published: January 17, 2014
doi:

Summary

A colonização da nasofaringe murina com Streptococcus pneumoniae e a subsequente extração de células aderentes ou recrutadas é descrita. Esta técnica envolve a lavagem da nasofaringe e a coleta do fluido através das nares e é adaptável para várias leituras, incluindo quantificação celular diferencial e análise da expressão mRNA in situ.

Abstract

A colonização nasofaríngea por Streptococcus pneumoniae é um pré-requisito para a invasão aos pulmões ou corrente sanguínea1. Este organismo é capaz de colonizar a superfície mucosa da nasofaringe, onde pode residir, multiplicar e eventualmente superar as defesas hospedeiras para invadir outros tecidos do hospedeiro. O estabelecimento de uma infecção no trato respiratório normalmente inferior resulta em pneumonia. Alternativamente, as bactérias podem se disseminar na corrente sanguínea causando bacteremia, que está associada a altas taxas de mortalidade2, ou então levar diretamente ao desenvolvimento de meningite pneumocócica. Entender a cinética e as respostas imunológicas à colonização nasofaríngea é um aspecto importante dos modelos de infecção por S. pneumoniae.

Nosso modelo de camundongos de colonização intranasal é adaptado dos modelos humanos3 e tem sido usado por vários grupos de pesquisa no estudo de respostas hospedeiras-patógenos na nasofaringe4-7. Na primeira parte do modelo, utilizamos um isolado clínico de S. pneumoniae para estabelecer uma colonização bacteriana auto-limitante que seja semelhante aos eventos de transporte em adultos humanos. O procedimento aqui detalhado envolve a preparação de um inóculo bacteriano, seguido da criação de um evento de colonização através da entrega do inóculo através de uma via intranasal de administração. Macrófagos residentes são o tipo de célula predominante na nasofaringe durante o estado estável. Normalmente, há poucos linfócitos presentes em camundongos não infectados8, no entanto a colonização mucosa levará a inflamações de baixo a alto grau (dependendo da virulência das espécies bacterianas e da cepa) que resultarão em uma resposta imune e o subsequente recrutamento de células imunes hospedeiras. Essas células podem ser isoladas por um lavado do conteúdo traqueal através das nares, e correlacionadas com a densidade das bactérias de colonização para entender melhor a cinética da infecção.

Protocol

Antes de começar: todas as etapas são feitas em um Gabinete de Segurança Biológica Nível 2 (BSL2) de Biohazard ( BSC) a menos que seja indicado de outra forma. Certifique-se de que obteve a aprovação biohazard apropriada para o uso de patógenos bacterianos infecciosos de acordo com as diretrizes institucionais antes do início dos experimentos. Além disso, certifique-se de que você tenha todos os materiais e reagentes necessários para realizar o procedimento preparado com antecedência. Os cam…

Representative Results

A Figura 1 representa uma visão geral que resume os principais passos do protocolo. As figuras 2-3 fornecem visualização da metodologia microbiológica inerente aos protocolos aqui descritos. A Figura 4 representa o posicionamento adequado de um rato para realizar uma colonização intranasal, enquanto a Figura 5 retrata tipicamente mudanças no peso de camundongos colonizados com cepa de S. pneumoniae P1547. As figuras 6-7 r…

Discussion

Neste estudo, foram apresentados métodos detalhados para a colonização intranasal de camundongos utilizando uma cepa de streptococcus pneumoniae e o subsequente isolamento e caracterização das células imunes recrutadas para nasofaringe em resposta à bactéria. Demonstramos como um inóculo bacteriano pode ser cultivado em mídia rica em nutrientes e usado para estabelecer um evento de colonização em camundongos, que é inicialmente restrito à nasofaringe. Em seguida, mostramos como os tipos de células…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Jeffery Weiser da Universidade da Pensilvânia por seu dom das cepas clínicas de Streptococcus pneumoniae. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde. Cv foi financiado por uma bolsa M. G. DeGroote e uma bolsa da Sociedade Torácica Canadense. Este trabalho foi financiado pela Ontário Lung Association e institutos canadenses de pesquisa em saúde (CIHR). O trabalho no laboratório Bowdish é apoiado em parte por Michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research e pelo McMaster Imunology Research Centre.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing – PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26G3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001

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Cite This Article
Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, T., Bowdish, D. M. E. Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae. J. Vis. Exp. (83), e50490, doi:10.3791/50490 (2014).

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