Summary
Murine nazofarenksin Streptococcus pneumoniae ile kolonizasyonu ve daha sonra yapışık veya işe alınan hücrelerin çıkarılması açıklanmaktadır. Bu teknik, nazofarenksin yıkanmasını ve sıvının nares yoluyla toplanmasını içerir ve diferansiyel hücre niceliği ve mRNA ekspresyonunun yerinde analizi dedahil olmak üzere çeşitli okumalar için uyarlanabilir.
Abstract
Streptococcus pneumoniae tarafından nazofarengeal kolonizasyon akciğerlere veya kan dolaşımına istilanın ön koşuludur1. Bu organizma, nazofarenksin mukozal yüzeyini kolonileştirebilir, burada konakçının diğer dokularına istila etmek için konak savunmalarını barındırabilir, çoğaltabilir ve sonunda üstesinden gelebilir. Normalde alt solunum yollarında bir enfeksiyonun kurulması zatürre ile sonuçlanır. Alternatif olarak, bakteriler kan dolaşımına yayılabilir ve yüksek ölüm oranları2ile ilişkili olan bakteriyemiye neden olabilir veya doğrudan pnömokok menenjitinin gelişmesine yol açabilir. Nazofarengeal kolonizasyonun kinetiğini ve immün yanıtlarını anlamak S. pneumoniae enfeksiyon modellerinin önemli bir yönüdür.
İntranazal kolonizasyon fare modelimiz insan modellerindenuyarlanmıştır 3 ve nazofarenks4-7konak-patojen yanıtlarının incelenmesinde birden fazla araştırma grubu tarafından kullanılmıştır. Modelin ilk bölümünde, insan yetişkinlerde taşıma olaylarına benzer, kendi kendini sınırlayan bir bakteri kolonizasyonu oluşturmak için S. pneumoniae'nin klinik bir izolesini kullanıyoruz. Burada ayrıntılı olarak açıklanan prosedür, bakteriyel bir inoculumun hazırlanmasını ve ardından inoculumun intranazal bir uygulama yolu ile teslim edilmesi yoluyla bir kolonileşme olayının kurulmasını içerir. Yerleşik makrofajlar, sabit durum sırasında nazofarenksteki baskın hücre tipidir. Tipik olarak, enfekte olmayan farelerde az sayıda lenfosit vardır8, ancak mukozal kolonizasyon, bağışıklık yanıtı ve daha sonra konak bağışıklık hücrelerinin işe alınmasıyla sonuçlanacak düşük ila yüksek dereceli inflamasyona (bakteri türlerinin ve suşunun virülansına bağlı olarak) yol açacaktır. Bu hücreler, nares yoluyla trakeal içeriğin bir lavajı ile izole edilebilir ve enfeksiyonun kinetiğini daha iyi anlamak için kolonizasyon bakterilerinin yoğunluğu ile ilişkilidir.
Protocol
Başlamadan önce: Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar Biyolojik Tehlike Seviye 2 (BSL2) Biyolojik Güvenlik Kabininde (BSC) yapılır. Deneylerin başlatılmasından önce lütfen kurumsal yönergelere göre enfeksiyöz bakteriyel patojenlerin kullanımı için uygun Biyolojik Tehlike Onayını almış olduğundan emin olun. Ayrıca, lütfen prosedürü önceden yapmak için gerekli tüm malzeme ve reaktiflere sahip olduğundan emin olun. Bu deneylerde kullanılan fareler Jackson Laboratuvarları, Charles Nehri veya Taconic'ten dişi C57BL / 6 fareleri dahil etti ve 10-14 haftalıktı (burun kolonizasyonu boşluğu veya enfeksiyonu kinetiğinde cinsiyete bağlı önemli farklılıklar bulamamış olsak da). Bu deneylerde kullanılan tüm fareler spesifik patojen içermeyen koşullar altında yetiştirilmiş ve sürdürülmüştür ve yaygın virüslerden, (LCMV, MNV, MPV, reovirüs ECTV ve diğer) bakterilerden(örneğin H. pylori)ve parazitlerden(örneğin pinworm, ektopazitler) dışkı örnek testi ile ve tesis odalarında bulunan sentinel farelerin sık anatomik değerlendirmesinden arındırılmıştır. Bu deneyleri yaparken, 10-12 haftadan küçük olmayan ve 6 aydan büyük olmayan kontrol fareleri kullanmanızı öneririz. Bu yaş aralığından daha genç veya daha yaşlı fareler, daha uzun nazofarengeal taşıma süresine ve enfeksiyonu yayma olasılığının artmasına daha duyarlıdır. Fare arka planı, bir kolonileşme deneyinin sonuçlarını etkileyebilecek bir başka önemli husustur, çünkü birkaç grup farklı genetik geçmişlere sahip farelerin S. pneumoniae D39 (serotip 2) suşu9,10'a farklı hassasiyetlere sahip olduğunu göstermiştir. S. pneumoniae doğal olarak meydana gelen bir murine patojeni değildir ve tek doğal rezervuarı insan nazofarenksidir. Bulaşma solunum damlacıkları yoluyla gerçekleşir ve fareler solunum salgıları üretmediği için, bireysel fareler bakteriyi diğer farelere iletemez, bu nedenle fareden fareye iletim için endişe yoktur11. Bu yazıda açıklanan prosedürlere görsel bir genel bakış için lütfen Şekil 1'e bakın.
1. S. pneumoniae Kültürünün Hazırlanması
- Streptococcus pneumoniae'ninsüspansiyon büyümesi için 5 ml triptik soya agarını aşıla.
- Bakteriyel inoculum 600 nm olarak ayarlanmış bir kilometre sayacı tarafından belirlenen 108 CFU/ ml'lik bir sıvı yoğunluğu ile kütük faz büyümesine ulaşana kadar% 5 CO2'de 37 ° C'de statik koşullar altında kültür. Bu CFU'ya karşılık gelen tam okuma, seçilen belirli bakteri suşuna bağlı olarak farklılık gösterecektir; S. pneumoniae suşlarının çoğu içinbu, 0.45-0.55 OD 600 aralığına karşılık gelir. Tipik olarak, sıvı kültüründeki S. pneumoniae suşları, alt kültüre gerek kalmadan, önerilen koşullar altında 1,5-2,5 saat içinde bu yoğunluğa büyüyecektir. Kültürün aşırı büyümesine izin verilmemelidir (0,75'lik bir OD okumasının ötesinde), bakterilerin artık kütük faz büyümesinde olmadığı ve kapsamlı otolizden geçtiği noktayı temsil eder.
- Her fare yaklaşık 107 bakteri ile aşılanacaktır. Bu nedenle, her 9 farenin kolonize edilmesi için, bir Eppendorf tüpüne 1 ml inoculum pipet ve 1 dakika boyunca 15.000 x g'da döner. Beyazımsı bir pelet görünür olmalıdır. Peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatantı çıkarın ve bakterileri 100 μl fosfat tamponlu saline (PBS) yeniden harcamaya dikkat edin, böylece konsantrasyonu 109 CFU / ml'ye çıkarın. Bu aşamada, bakteri canlı kalmalıdır, ancak kolayca çoğalmaz.
- Birden fazla aliquot kullanıyorsanız, bakteri yoğunluğundaki hafif numuneler arası varyasyonları kontrol etmek için tek bir tüpte birleştirin.
- Bakterileri aşıya hazır olana kadar maksimum 1 saat boyunca buzda tutun.
- Tam bir bakteri sayısı elde etmek için, düzgün bakteriyel inoculum ile başlayan kütük açısından seri seyreltme serisi gerçekleştirin. 90 μl steril PBS'ye 10 μl ekleyerek seri olarak 10 kat seyreltin.
- 10-5 - 10 -9 seyreltme numunelerinin 3 damlasının yanı sıra,%5koyun kanı ile desteklenmiş tryptic soya agar (TSA) plakasının ayrı etiketli bölümlerine sadece PBS kontaminasyon kontrolü plakası (Şekil 2). Pipet uçlarının, aşırı bakterileri taşımayı ve sonuçların değişkenliğini artırmayı önlemek için daha yüksek bir CFU konsantrasyonundan daha düşük bir CFU konsantrasyonuna seyreltilen her adım için değiştirildiğinden emin olun. TSA yerine insan kanı agar (HBA) plakaları da kullanılabilir. Birçok S. pneumoniae türü neomisin (5-20 μg / ml'den itibaren) dirençli olduğundan, bu antibiyotik plaka hazırlama aşamasında tercih edilen agar ortamına da eklenebilir. Bu, dirençli olmayan bakterileri ortadan kaldırdığı için numaralandırmayı kolaylaştırır. Her bir bakteri suşu için kullanılacak en uygun antibiyotik konsantrasyonunu belirlemek için her bir suşun antibiyotik duyarlılığı önceden test edilmelidir.
- 15-30 dakika açıkta kurumaya bırakın, ardından plakaları örtün ve 37 °C ve% 5 CO2'yeayarlanmış bakteri inkübatörüne baş aşağı yerleştirin. 24 saat boyunca tabakta bakteri kolonileri yetiştirin.
- Koloni oluşturan birimlerin sayısını ve ilgili konsantrasyonlarını belirleyin. OD600 değerinin tespitlerine dayanarak, konsantrasyon 1-4 x 109 CFU/ml aralığında olmalıdır.
2. Murine İntranazal Kolonizasyon
- Fareleri bir fare kısıtlayıcı aparatına (diyafram oluşturmak için ucu kesilmiş modifiye edilmiş 50 ml Falcon tüp) yerleştirerek, burunlarının kısıtlayıcı aparatın konik ucundan yeni çıkması için başparmakla vücutlarının tabanına sabitleyerek dizginleyin(Şekil 4). Bu cihazın kullanımı, farenin kafasının hareketsiz hale getirilmesine ve nareslerinin hareketi en aza indirecek şekilde ayrılmasına izin verir ve hayvandan pipet ucunu mastikleştirme girişimlerini engeller ve inokülün tamamen teslim edilmesine izin verir. Alternatif olarak, fareler boyundaki sürtünme ve manuel kısıtlama yoluyla hareketsiz hale getirilebilir. İntranazal aşılamadan önce hayvanların anestezisini önermiyoruz. Inoculumun anestezi altındaki hayvanlara idaresi, inokülün bir kısmının akciğerlere yayılmasına neden olur12,13.
- Bir P10 veya P20 pipeti kullanarak, hazırlanan kültürün 10 μl'sini biriktirerek her fareyi aşılayarak, her iki nar arasında eşit olarak dağıtarak (inoculum'un aşıyı yavaş yavaş titreterek buruna damlamasına izin verin, farelerin inoculum soluması zaman ayırır). İnoculumun tam teslimatını elde etmek için, farenin burnunu aşırı hareket ettirmeye başladığı herhangi bir noktada yönetimi duraklatın. Fareler nefes verirken burundan bir miktar dışarı atabileceğinden, tüm inoculum narlara enjekte edilmeyebilir; bununla birlikte, dışarı atılan miktar eksicule olma eğiliminde olduğu ve inoculum son derece yüksek miktarda bakteri içerdiğinden, bu kolonileşen bakteri yükünü önemli ölçüde etkilemez. Ek olarak, nazofarengeal mukozada koloniizasyon için mevcut yüzey alanı sınırlıdır ve sonuç olarak biz ve diğerleri, önerilen 107 dozun tüm farelerde tutarlı bakteri seviyeleri elde etmek için yeterli olduğunu ve ilk miktarlarda kolonileşen bakterilerde minimum değişkenlik ile sonuç olduğunu bulduk14,15 .
- Uç nokta izlemenizin bir parçası olarak ağırlık göstergelerini kullanıyorsanız fareleri tartın. Uyuşukluk, fırfırlı kürk ve kilo kaybı da dahil olmak üzere klinik semptomlar için fareleri her 12-24 saatte bir izleyin. Fareler tipik olarak kolonizasyon sonrası 3-5 güne kadar hastalık semptomları göstermez ve bunlar, günde ortalama% 5'i kadar kilo kaybından önce gelecektir. Fareler giderek hastalandıkça kambur duruşları üstlenecekler ve hareketlerde azalma ve elleçleme de dahil olmak üzere stimülasyona karşı tepkinin azaldığını göstereceklerdir. Bu aşamada, hastalık tipik olarak sepsis ve / veya zatürreenin göstergesidir ve muhtemelen terminal olacaktır, ancak fareler sonuçları iyileştirmek için günlük 1 ml deri altı salin ile tedavi edilebilir. Hayatta kalan fareler, 7. P1547 suşu ile kolonize edilmiş farelerde izlenen ağırlığın temsili bir sonucu için lütfen Şekil 5'e bakın.
3. Burun Lavajı Örnek Toplama
Başlamadan önce: 26 3/8 G eğimli iğnelerle kaplanmış 1 ml şırınga kullanarak konserve iğneler hazırlayın. İç çapı 0,38 mm olan 2,5 cm'lik PE20 polietilen boru parçalarını keserek her ucun eğimli bir uca sahip olmasını sağlayın. Uzun uçları kullanarak, 2,5 cm uzunluğunda bir PE20 polietilen boru parçasını (iç çapı 0,38 mm) iğne ucuna kaydırın ve boru tarafının delinmesine kaçının. Kanüle iğneler ihtiyaç duyulana kadar% 70 etanolde tutulabilir.
- Deneysel farelere ötenazi. Servikal çıkık trakeaya zarar verebileceğinden, bu ötanazi yönteminden kaçınılmalıdır. Tercih edilen yöntemimiz izofluran anestezi ve ardından eksanguinasyondur, ancak ötanazi modunu seçerken kurumsal kurallara uyduğunuzdan emin olun.
- % 70 sulu etanol kullanarak, etanolün narlara erişmesini önlemeye dikkat ederek hayvanın süperoanterior kürkünü, özellikle boynu sterilize edin.
- Hayvanın boynunun orta çizgisi boyunca tek bir uzunlamasına kesim yapın ve her iki ucunda iki yatay kesik yaparak nefes borusunu hayal etmek için bir açıklık oluşturun.
- Cildi her iki tarafa da dikkatlice soyun ve altındaki boyun dokusunu ortaya çıkarın.
- Trakea görünür olmalı, her iki tarafta da boyuna kaslarla çevrili olmalıdır. Trakeanın kendisini net bir şekilde görmek için bunları dikkatlice kesin, çevredeki vaskülatları kesmemeye dikkat edin.
- Vaskülat kesilmişse ve kan varsa, devam etmeden önce kanamanın durmasına izin verin ve ardından steril PBS dağıtarak ve bölgedeki aşırı nemi hafifçe emmek için steril gazlı bez kullanarak bölgeyi birkaç kez temizleyin.
- Trakea düzgün bir şekilde maruz kaldıktan sonra, trakeada yaklaşık yarı yolda enine, semilunar bir kesim yapın (Şekil 6).
- Önceden hazırlanmış konserve iğneye 1.000 μl sterilize PBS hazırlayın.
- Nefes borusuna buruna doğru akarak, eğimli kenarı ekleme kolaylığı için aşağı doğru tutarak ekleyin (Şekil 7). İğne yerleştirildikten sonra 180° döndürün ve ışık direncini hissedene kadar hafifçe yukarı doğru araştırın.
- Eppendorf'u farenin burnunun hemen altına örnek toplama için belirleyin.
- Minimum (~20 μl) miktarda PBS lavaj sıvısı dağıtarak iğnenin doğru yerleştirilmesini test edin - farenin nares etrafında sıvı damlası oluşmalıdır; bu durumda, 3.13 adımına geçin).
- Test PBS doğrudan hayvanın ağzından çıkarsa, kanülleri geri çekin ve çok hafif bir direnç hissedilene kadar tekrar hafifçe ileri doğru kontrol ederek yeniden konumlandırın - kanülleri burun damağı ve ağız boşluğuna taşıyacağınız için bu direncin çok ötesine itmemeye dikkat edin.
- Maksimum miktarda hücrenin yerinden edilmesine ve toplanmasına yardımcı olmak için iğne içeriğini hızla dağıtın - içerikler farenin nares'inden ve toplama tüpüne akmalıdır. Numuneyi hemen buza yerleştirin.
- RNA analizi için numune toplamak için, aynı fare üzerinde 500 μl RNA liziz tamponu içeren bir konserve iğne kullanarak 3.8-3.13) adımlarını yineleyin. Bu, ilk PBS lavajından sonra doğal olmayan hücrelerin çıkarılması gerektiğinden, büyük ölçüde nazofarengeal mukozal epitelden oluşan kalan hücre popülasyonlarından lysate örneğinin toplanmasına izin verecektir. RNA liziz tamponunun epitel denude ve çevre dokuyu yok edeceğini lütfen unutmayın, bu nedenle bu dokuların tutulması isteniyorsa akciğerler gibi organlarla temastan kaçınmaya özen göstermelisiniz. Toplandıktan sonra, numuneyi çıtçıt dondurmak için doğrudan kuru buzun üzerine RNA liziz tamponu içine yerleştirin. Lizis tamponunda, numuneler üreticinin talimatlarına göre saklanabilir ve genellikle birkaç ay boyunca -70 ° C'de stabildir.
4. Nazofarenkste Bakteri Yükünün Belirlenmesi
- Her murine burun lavajı örneği için seri bir seyreltme serisi hazırlayarak bakterileri nicel hale getirin. Genel olarak, bakteri yükünün 0-104 CFU arasında olması beklenebilir, bu nedenle üç adet 10 kat seri seyreltme gerçekleştirin. 10 -1 CFU/ml. Vortex konsantrasyonuna ilk tüpe 10 μl düzgün burun lavajı örneğini(100 CFU/ml) iyice ekleyin.
- Bakteriyolojik plakayı kadranlara bölün ve her biri seyreltme serisinin bir üyesiyle (100 -10-3 CFU/ml) kadranları etiketle. Şekil 2'deolduğu gibi% 5 koyun kanı ile desteklenmiş tryptic soya agar plakaları üzerinde 3 damla 10 μl numune ve temiz örnek.
- 15-30 dakika açıkta kurumaya izin verin, ardından plakaları örtün ve bakteri üremesi için en uygun koşullara sahip bakteri inkübatörüne baş aşağı yerleştirin (tipik olarak 37 °C ve% 5 CO2).
- 18-24 saat boyunca tabakta bakteri kolonileri yetiştirin.
- Her seyreltme için plakada oluşan kolonileri ortalama alarak kolonileşen bakteri sayısını belirleyin (Şekil 3). Şekil 8, 21 güne kadar 3 farklı S. pneumoniae türü ile kolonize edilmiş farelerde, burun lavajlarının kültürü tarafından belirlendiği gibi, farklı zaman noktalarında bakteri yoğunluğunu göstermektedir.
5. Akış Sitometresi için Numunelerin Hazırlanması
Başlamadan önce: Antikor karışımını hazırlayın. Lökosit popülasyonlarının ölçülmesi için, belirtilen seyreltmelerde aşağıdaki karışımı öneririz: PE-Ly6G (klon 1A8, 1 μg/ml), FITC-Ly6C (klon AL-21,1 μg/ml), eFluor 450-CD45 (klon 30-F11, 2,67 μg/ml), APC-F4/80 (klon PM8 RUO, 0,67 μg/ml), PerCP-Cy5,5-CD11c (klon N418 RUO, 0,5 μg/ml), PE-Cy7-CD11b (klon M1/70, 0,33 μg/ml), Alexa Fluor 700-CD3 (klon 1782, 4 μg/ml), eFluor 605NC-CD4 (klon GK1,5, 6,67 μg/ml). Bu karışımın 2x konsantrasyonda olduğunu lütfen unutmayın (bkz. adım 5.5). Tüm antikorlar CCS'de seyreltilmelidir Yıkama tamponu (%0.5 fetal baldır serumu, 2mM EDTA, PBS'de % 0.1 sodyum azit) da önceden hazırlanmalıdır. İzotiple eşleşen kontrol antikorlarının bir karışımında, ideal olarak etiketli antikorlarla aynı tedarikçiden ve spesifik antikorlarla aynı konsantrasyonlarda hazırlanmalıdır. İzotip kontrol antikorları ile tedavi edilen numuneler negatif kontrol işlevi görecektir. İzotip kontrol antikorları ile tedavi edilen örneklerde gözlenen herhangi bir floresan arka plan olarak kabul edilmelidir.
- 1,5 ml Eppendorf tüplerini 4 °C'ye döndürebilen bir santrifüj.
- Santrifüj burun lavaj örnekleri 2.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca. Dikkatlice süpernatant ve rezerv dışarı pipet. Not: Nazofarenks içindeki az miktarda hücre nedeniyle, istenmeyen kırmızı kan hücresi kirlenmesi olmadıkça hücre peletı görünmez, bu da parlak kırmızı olur. Bu görülürse, örnek atılmalıdır.
- 50 μl Fc'de örnek yeniden mi? RIIb/CD16-2 (2.4G2) antikoru (Fc reseptörlerini bağlayan ve spesifik olmayan antikor bağlamayı azaltan) 4 μg/ml konsantrasyonda Pul Yıkama Tamponu.
- Örnek buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
- Numuneye 50 μl hazır 2x konsantre floresan antikor karışımı ekleyin. İzotip kontrolü görevi görmek için her deney grubundan temsili bir örnek ayırin. Leke karışımı yerine izotip antikor karışımını bu örneğe ekleyin.
- 1 saat boyunca buzda kuluçkaya yaslanın.
- 4 °C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüj örnekleri. 200 μl PBS'de süpernatant ve resuspend atın.
- 5.7. adımı yineleyin.
- İkinci yıkamadan sonra, santrifüj numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca tekrar 2.000 x g'da.
- PBS'de (numuneyi hemen çalıştırıyorsanız) veya %2 paraformaldehitte (numuneleri lekelemeden 1-3 gün sonra çalıştırıyorsanız) yeniden dürt.
- Akış sitometrisi yaparken, numune başına veya tüm örnek aspire edilene kadar maksimum olay miktarını toplayın. Enfekte olmayan, sağlıklı, genç farelerde, bu toplam 1.000-2.000 olay kadar az olacaktır; Bakteriyel bir kolonizasyon olayı sırasında, hayvandaki hastalık durumuna ve yaş ve genetik arka plan gibi faktörlere bağlı olarak bu sayı 2 ila 5 kat daha fazla artabilir. Şekil 9, 450 ileri saçılım ve 300 Yan Dağılım kullanılarak 3 lazer becton Dickenson LSRII akış sitometresinden toplanan temsili akış sitometrisi sonuçlarını gösterir, ancak numune toplamadan önce kullanmayı düşündüğünüz belirli akış sitometresi için parametreleri optimize etmenizi öneririz. Not: Bir numunede eser miktarda kan kirlenmesi bile varsa, toplanan toplam olay beklenenden önemli ölçüde daha yüksek olacaktır ve numune analizden indirimli olmalıdır.
6. Burun Lavajlarının Nicel PCR (qPCR) Analizi
- Hücre lysates'i adım 3.14 oda sıcaklığından çözün.
- Tercih edilen RNA ayıklaması ile birlikte sağlanan önerilen protokolü izleyin.
- RNA ekstraksiyon prosedürünü belirtildiği gibi tamamladıktan sonra, spektrofotometre veya elektroforez bazlı bir yöntem kullanarak RNA miktarını ölçün (Şekil 10). Rutin olarak numune başına 975 ila 3.250 ng toplam RNA elde ediyoruz ve 260/280 nm'lik >1.7 oranı veya 8.1.1±0.13 civarında bir RNA bütünlük numarası (RIN).
- M-MULV Ters Transkriptaz'ı kullanarak 1.000 ng RNA (maksimum 13 μl) ile üreticinin protokolüne göre cDNA'yı yazıya dökün.
- Elde edilen cDNA örneklerini 8x ve aliquot'u -20 veya -80 °C'de uzun süreli depolama için 4 ayrı tüpe eşit olarak seyreltin.
- Gen ekspresyonunu qPCR ile ölçmek için, buz veya soğuk blok üzerindeki triplikat içinde 25 μl numune reaksiyonları hazırlayın: seçtiğiniz qPCR kitinden 12,5 μl 2x qPCR ana karışımı, 0,25 μl referans boyası, 2 μl seyreltilmiş cDNA (adım 7,5), 1 μl karışık ileri ve ters astar (400 nM final), 9,25 μl RNAse-DNAse içermeyen su. Bu protokol, daha önce yayımlanan yöntemlerin bir uyarlamasıdır16.
- Genel olarak iki adımlı bir qPCR amplifikasyonu (10 dakika için 95 °C ve ardından 40 döngü x [95 °C x 15 sn, 60 °C x 1 dk]) etkili olduğunu görüyoruz (Şekil 11a); ancak, her astar çifti optimize edilmelidir. Spesifik olmayan bir amplifikasyonun oluşmamasını sağlamak için amplifikasyondan sonra ayrışma (erime) eğrileri yapılmalıdır. amplifikasyon (Şekil 11b)
- Analiz edilen her gen için rutin olarak standart eğrilerin yanı sıra analiz edilen her 96 kuyu plakası için standart bir kalibratör (akciğer veya dalak homojenasyonundan türetilmiştir) çalıştırıyoruz. Göreli transkript tutarları, önce ham döngü eşiği (Ct) değerlerinin referans boya ile normalleştirilmesi ve elde edilen değerlerin ilgili standart eğri üzerinden dönüştürülmesiyle elde edilir. Bu göreli miktarlar daha sonra standart kalibratöre ve uygun olduğu şekilde bir temizlik genine normalleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, protokolün ana adımlarını özetleyen bir genel bakış şemasını temsil eder. Şekil 2-3, burada açıklanan protokollere özgü mikrobiyolojik metodolojinin görselleştirilmesini sağlar. Şekil 4, intranazal kolonizasyon yapmak için bir farenin uygun şekilde konumlandırılmasını temsil ederken, Şekil 5 tipik olarak S. pneumoniae suşu P1547 ile kolonize edilen farelerin ağırlığındaki değişiklikleri gösterir. Şekil 6-7, bu iki tekniğin yardımcı görselleştirilmesi için sürecin burun lavajı kısmının belirli aşamalarını temsil eder. Şekil 8-11, burun lavajını takiben bir farenin nazofarenksinden toplanan örnekler üzerinde yapılan analizlerin temsili sonuçlarından oluşur. Özellikle, Şekil 8, S. pneumoniae suşu P1121, P1547 veya P1542 ile kolonize edilen farelerden elde edilen burun lavajlarının kültleştirilmesiyle belirlenen nazofarenksteki bakteri yükünün temsili bir sonucudur. Şekil 9, akış sitometrik teknikleri kullanılarak izole edilmiş nazofarengeal immün hücrelerin hücre fenotiplemasını temsil eder. Şekil 10-11, kantitatif PCR ile nazofarengeal mRNA'nın ekspresyonel analizi ile ilgili temsili sonuçları gösterir.
Şekil 1. Fare modeli kullanılarak intranazal aşılama ve burun lavaj hücresi izolasyonu işlemlerinin akış şeması. İlk olarak, bakteriler aşılamaya hazırlanır ve daha sonra intranazal olarak murine deneklere verilir. İstenilen süre geçtikten sonra, fareler terminal kanaması yoluyla ötenaziye tabi edilir ve nazofarengeal hücreleri iki burun lavajı adımı ile izole edilir: PBS yıkama adımı ve ardından RNA liziz tamponunda ikincil bir yıkama. Ön PBS yıkamadaki hücreler akış sitometri teknikleri kullanılarak izole edilir ve analiz edilirken, ikinci örnekten izole edilen RNA, transkripsiyonel düzeyde ilgi moleküllerinin göreceli bolluklarını araştırmak için kullanılabilir.
Şekil 2. Bakteri konsantrasyonunu belirlemek için, 10 μl damla, farklı bir seri seyreltmeyi temsil eden bölümlere ayrılmış bir plaka üzerinde üç taraflı olarak kaplanır. Bu damlaların kurumasına izin verilir ve plakalar gece boyunca 37 °C, % 5 CO2'deinkübe edilir.
Şekil 3. Streptoksik pneumoniae konsantrasyonu, temsili bir hayvanın nazofarenksinden izole edilmiştir. Her ayrı koloni bir koloni şekillendirme birimini temsil eder, her koloni koleksiyonu bir 10 μl düşüşü (üç taraflı olarak kaplanır) temsil eder ve plakadaki her çeyrek ayrı bir seri seyreltme temsil eder. Bakteriyel konsantrasyon CFU/ml'de, içinde ve daha sonra uygun kadranlar arasında sayılabilir, tam olarak oluşturulmuş kolonilerin sayısı ortalaması ile belirlenir.
Şekil 4. Bakteriyel inoculum'un düzgün bir şekilde teslim edilmesine izin vermek için, herhangi bir farenin aşılanma hareketi, özellikle boyunda en aza indirilmelidir. Bunu başarmak için, konu fare konik ucunda diyaframlı 50 ml Falcon tüpünden oluşan değiştirilmiş bir kısıtlama aparatında kısıtlanır. Fare daha sonra, burnunun araştırmacı tarafından erişilebileceği diyaframdan ortaya çıkacak şekilde konumlandırılmış ve intranazal aşılamanın gerçekleştirilmesine izin verir.
Şekil 5. P1547 suşu ile kolonize edilen farelerin ağırlığı, nazofarengeal kolonizasyondan sonra beklenen ağırlıktaki tipik değişiklikleri tasvir etmek için ilk aşılamadan (n=6) sonra günlük olarak izlenen en az 2 temsili deneyden. Ağırlık, başlangıç ağırlığının yüzde değişimi olarak gösterilir. Lütfen 3-5 gün arasında görülen beklenen keskin ilk kilo kaybına, ardından stabilizasyona ve hayatta kalan farelerde ağırlıkta kademeli artışa dikkat edin.
Şekil 6. Trakeal maruziyet üzerine, yanlanan boyuna kaslar trakeal kesiden önce çevredeki kan damarlarını şiddetli olmayacak şekilde dikkatlice çıkarılır. Daha sonra ince cerrahi makas kullanılarak nefes borusunun yarısına kadar küçük, yarım yamalak bir kesi yapılır. Trakeanın çapını sadece kısmen kesmek ve arka olarak sağlam bırakmak önemlidir.
Şekil 7. Kanüle iğnenin nefes borusu açıklığına buruna doğru yukarı doğru yerleştirilmesi. Canül yerleştirildikten sonra, direnç karşılanana kadar nazikçe araştırın, ardından içeriği nares boyunca boşaltın.
Şekil 8. C57BL/6 farelerinin (üçgenler) S. pneumoniae suşu P1547 (A), P1542 (B) veya P1121 (C) ile kolonizasyonunu takiben açıklanan burun lavaj prosedürünü kullanarak nazofarenksten izole edilmiş temsili bir bakteri yükü serisi. P1121 kolonizasyonunu takiben BALB/C farelerinin (daireler) karşılaştırmalı kolonizasyonu da(C)içinde görüntülenir. Kolonileşme boyunca 3, 7, 14 ve 21. Genel olarak, 3. Boşluk genellikle 14. Daha büyük bir rakam görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 9. Akış sitometrisi ile analiz edildiği gibi, murine burun lavajlarından izole edilen toplam hücrelerin temsili histogramı (A) ve noktasal çizimi (B). İşaretçilerin hücre popülasyonları üzerindeki ayırıcı ifadesi, bu proteinlere karşı yönlendirilen floresan antikorların kullanımı yoluyla lökosit alt kümelerinin tanımlanmasını sağlar. Burada gösterildiği gibi, lökosit popülasyonları, önce İleri Saçılma (alan) ile İleri Dağılım (genişlik) kapısı(A)kullanılarak singlet hücrelerine gating ve ardından bu alt kümedeki(B)CD45+ hücreler için zenginleştirilerek seçilir. Bu popülasyon, CD11b ve Ly6G çift pozitif nötrofiller (C) için gating ile belirli hücre tiplerine daha fazla bölünebilir. CD11b popülasyonunun analizi F4/80+, CD11b-makrofajları (D) veya CD11b-, CD3 ve CD4 çift pozitif CD4 T hücrelerini (E) ortaya çıkarmak için yapılabilir. Hücre popülasyonları, birini ifade ettikleri sürece veya onları diğer hücre türlerinden ayırmak için kullanılabilecek birkaç benzersiz yüzey reseptörlerinin bir kombinasyonu olarak fenotiplenebilir. Daha büyük bir rakam görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 10. Murine burun lavajlarından izole edilmiş bir numunenin elektroforez otomatik dizilimini takiben temsili elektroferogram. Elde edilen elektroferogram, nezofarengeal bölgeden elde edilen yüksek kaliteli toplam RNA örneğinin nicellik verilerini ve karakteristik imzasını gösterir. Toplam RNA'nın analizleri yaparken, iki ana ribozomal RNA, 18S ve 28S için RNA zirveleri altındaki alanlar, karşılık gelen oranlarını hesaplamak için kullanılır. 18S ve 28S'e atfedilebilecek pik oranlarındaki önemli değişiklikler tipik olarak bozulmuş RNA'nın göstergesidir. Bozulma derecesi RNA bütünlük numarası (RIN) ile özetlenebilir; Bu temsili numunenin RIN'i 8.1'dir. Yüksek oranda bozulmuş RNA örneği (B) ve (C) olarak gösterilir ve sonraki RIN sırasıyla 1.9 ve 4.6'dır. Daha büyük bir rakam görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 11. Burun yıkama hücresi lizazlarının qPCR analizinden amplifikasyon grafiği (A) ve ayrışma (erime) eğrisi (B), bu iki okumanın tipik olarak murine nazofarenksten izole edilmiş mRNA ürünlerinin verimli ve doğru tespit edilmiş bir amplifikasyonunu takiben nasıl görünmesi gerektiğine dair bir örnek sağlar. Temsil edilen, temizlik geni 18S için standart bir eğridir. (A)içinde görüntülenen sonuçlar, GAPDH'ye karşı astarlar kullanılarak amplifikasyondan sonra istenen PCR ürününü gösterir. Çizgi döngü eşiğini (Ct) temsil eder. Farklı örneklere karşılık gelen amplifikasyon çizimlerinin bu eşiği geçtiği nokta, numuneler arasında karşılaştırmaya izin verir ve daha düşük değerler daha yüksek miktarda RNA'ya karşılık gelir. (B)arsası, qPCR ürününün maksimum erime sıcaklığının 85 ° C olduğunu ve bu reaksiyonda herhangi bir kirletici ürün bulunmadığını ve bunun istenen ürün zirvesinden ayrı ek bir tepe olarak ortaya çıkacağını göstermektedir. Daha büyük bir rakam görüntülemek için burayı tıklatın.
| Gerinim Adı | Serotip | Virülans | Farelerde Mortalite | Beklenen Kolonileşme Süresi |
| P1121 | 23F | asemptomatik | 0% | 21-28 gün |
| P1542 | 4 | alçak | 0-20% | 21-28 gün |
| P1547 | 6A | Orta | 20-50% | 14-21 gün |
| D39 | 2 | yüksek | 70-100% | 14-21 gün |
Tablo 1. Yaygın olarak kullanılan 4 S. pneumoniae klinik izolat suşuna, bunlara karşılık gelen serotip sayısına, ilişkili virülans derecelerine, farelerin kolonize edilmiş bir alt kümesindeki invazivliğin beklenen oranına ve nazofarengeal kolonizasyonun tipik süresine tablosal bir genel bakış.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, Streptococcus pneumoniae'nin klinik bir izole suşu kullanılarak farelerin intranazal kolonizasyonu ve bakteriye yanıt olarak nazofarenkse alınan bağışıklık hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı yöntemler sunduk. Bakteriyel bir inoculumun besin bakımından zengin medyada nasıl kültürlendirilebileceğini ve başlangıçta nazofarenks ile sınırlı olan farelerde bir kolonileşme olayı oluşturmak için nasıl kullanılabileceğini gösterdik. Daha sonra nazofarenkse katılan yanıt veren immün hücre tiplerinin, kanüle edilmiş bir iğne kullanılarak trakeal maruziyet, kesi ve burun lavajını takiben nasıl izole edilebileceğini gösterdik. Burun lavaj örnekleri PBS'de sağlam, hafif yapışan hücreleri izole etmek için toplanabilir; daha sıkı yapışan hücrelerden ve çevresindeki epitel mukozal tabakadan elde edilen RNA, RNA liziz tamponundan oluşan ikincil bir yıkama uygulanarak izole edilebilir. Bu örneklerin ilki daha sonra akış sitometri teknikleri ile kolonizasyon bağlamında işe alınan spesifik hücreleri fenotiplamak için kullanılabilirken, ikincisi Q-PCR analizine uygulanabilir, bu işe alınan hücrelerin efektör işlevlerini belirlemek için, ilgili bağışıklık düzenleyicilerinin transkripsiyonel ifadesine bakarak. Burun lavaj örnekleri ayrıca belirli araştırma sorularını ele almak için farklı deneysel grupları karşılaştıran bakteriyel bir koloniizasyon olayının temizlenmesinin kinetiğini belirlemek için kullanılabilir.
Bu intranazal kolonizasyon yönteminin kullanılması, başlangıçta hayvanın nazofarenksi ile sınırlı bir kolonileşme olayının kurulmasına izin verir. Bu nedenle bakterilerin kana veya organlara daha sonra yayılması, nazofarengeal mukoza içinde lokalize olan bağışıklık savunmasındaki ihlallere ikincil olarak gerçekleşir. Bu modelle elde edilen adımsal ilerleme, insanlarda pnömokok istilası sürecini daha doğru bir şekilde yansıtır, kolonileşen bakteriler ile konakçı burun mukozası arasındaki dinamikleri incelemesine izin verir - ve belki de bakteriyel patojeniklik ve / veya konak bağışıklığındaki kaymaları daha iyi anlamasına izin verir. Bu, ilk kolonizasyon olayının kurulmasından vazgeçen ve bakteriyel inokülüsün intraktrakel aşılama yoluyla akciğerlere, damar enjeksiyonu yoluyla kana veya periton enjeksiyonu yoluyla peritona doğrudan teslim edilmesi yoluyla izolasyonda invaziv hastalığı incelemeyi seçen modellerin aksinedir.
Bir kolonileşme olayını takiben PBS burun lavajı yapmak, nazofarenkse işe alınan hafif yapışmayan hücrelerin ve mukoza ile ilişkili bakterilerin izolasyonuna izin verir. Bununla birlikte, bu tekniğin epitel arasında veya altında seyahat eden hücreleri veya bakterileri serbest bırakmayacağı ve pnömokok kolonizasyonunun ardından potansiyel bir enfeksiyon bölgesi olduğu bildirilen bir lenfoid organ olan burun ilişkili lenfoid dokuya (NALT) lokalize olmuş hücrelerin veya bakterilerin toplanmasına izin vermeyeceği için sınırlı olduğu belirtilmelidir17,18. NALT'ın daha fazla incelenmesi isteniyorsa, PBS burun lavajını takiben çalışmak için bu dokunun toptan mikrodiseksiyon ve çıkarılmasını öneririz; bu iki teknik birbirini dışlamadığı için aynı hayvan üzerinde yürütülebilir. Bununla birlikte, RNA hasat adımının likit ve yıkıcı doğası nedeniyle (RNA liziz tamponu kullanan ikincil lavaj), NALT'yi hasat etmek niyetindeyseniz bu adım atlanmalıdır. Burun lavajı teknik olarak daha az zorlayıcı bir prosedür olmasına rağmen, sadece mukoza ile ilişkili bakterileri değil, aynı zamanda nazofarengeal dokuyu istila edenleri de içeren bakteri yükünün daha kapsamlı bir değerlendirmesini elde etmek isteyen gruplar için, kolonize farelerin üst kafatası kemiğinin çıkarılması ve burun conchae içindeki dokunun diseksiyonunun ardından nazofarengeal dokunun hasatını öneriyoruz, diğerleri tarafından açıklandığı gibi19.
Ortaya çıkarıcı bir immün yanıtın doğası konak ve patojen arasındaki etkileşime bağlıdır. Bugüne kadar 90'dan fazla S. pneumoniae serotipleri karakterize edilmiştir, hepsi farklı patojeniklik ve virülans faktörü ekspresyonu seviyeleri ile insan popülasyonunda diferansiyel prevalans ile sonuçlanmıştır20-23. Benzer şekilde, farelerde, nazofarengeal bir kolonizasyona yanıt olarak ortaya çıkan immün yanıtın kapsamının ve kinetiklerin boyutunun kolonileşen suşun kendisine bağlı olduğu bildirilmiştir24. Bu nedenle, nazofarengeal kolonizasyonun kurulması için kullanılacak uygun bir suşun seçilmesi önemsiz bir konu değildir ve fare genetik arka planının seçimi de değildir. Şekil 8, C57BL/6 arka plan üzerinde dişi farelerin intranazal kolonizasyonunu takiben 3 farklı S. pneumoniae suşundan nazofarengeal kolonizasyonun temizlenmesinin kinetiğini gösteren örnek veriler sağlar. Tablo 1, literatürde açıklanan ve nazofarengeal kolonizasyon25: avirul kurabildiği bilinen 4 S. pneumoniae klinik izolat suşları ile beklenen virülans derecesine ve kolonizasyon süresinin uzunluğuna genel bir bakış sunmaktadır. P1121 (serotip 23F)26,27 düşük virülans P1542 (serotip 4)28, orta virülans P1547 (serotip 6A)29-31ve yaygın olarak kullanılan, iyi karakterize, son derece virülan D39 (serotip 2)32-36. Deneysel amaç, diğer dokulara eşlik eden bakteriyel yayılma olmadan asemptomatik bir burun kolonizasyonu olayını kesinlikle incelemekse, daha uzun kolonileşme olayları (gözlemlenen boşluklardan 28 gün öncesine kadar) bu türün bir özelliği olduğu için güçlü bir kolonizatör olarak karakterize edilen avirulent P1121 suşunun kullanılmasını öneririz. Tipik olarak P1121 ile kolonize edilen fareler invaziv hastalık riski oluşturmaz ve hastalığın klinik göstergelerini göstermez (geçici kilo kaybı hariç). Suşların geri kalanı, istenen virülans derecesine ve ilişkili mortaliteye bağlı olarak, bireysel bir fare içinde gelişen enfeksiyon derecesi değil, klinik hastalık belirtileri gösteren farelerin oranı anlamına gelen virülans ile kullanılmalıdır. Ayrıca, tipik olarak, virülans derecesinin kolonileşme süresinin uzunluğu ile ters korelasyona sahip olduğu ve daha virülan suşların daha kısa bir süre için kolonileştiği belirtilmelidir. Tanımlanan virülan suşların 3'ü de farelerde mortaliteye yol açar, en yaygın olarak, sepsis, fulminan pnömoni veya eşzamanlı pnömoni ve sepsis farelerin bir alt kümesinde gelişir. İnvaziv bakterilerin lokalizasyonundaki farklılıklar, daha önce bazı suşların belirli organlar için tromizm gösterdiği bildirildiği için suşlara özgü olabilir37. Hayvanların küçük bir yüzdesinde, spontan menenjit de kolonizasyondan sonra gelişebilir. Ölüm nedeninin belirlenmesi ve invazivlik derecesi, uç noktadaki hayvanlardan ilişkili dokuların (akciğerler, dalak ve / veya beyin) toplanmasıyla gerçekleştirilebilir. Bu dokuların homojenizasyonu ve sonraki kaplama invaziv bakterilerin ve karşılık gelen titrelerin varlığını gösterebilir.
Bakteri kültürü yoğunluğu niceleme örneği Şekil 3'te gösterilmiştir. Kültür çok yoğunlaşmışsa, koloniler ayrı ayrı sayılamayacak kadar yoğun büyür, ancak kütük açısından bir seyreltme serisi kaplanırsa tek hücrelerden türetilen koloniler ayırt edilebilir. Seyreltme başına üç teknik çoğaltmanın kaplanması değişkenliği en aza indirir. Bir burun kolonizasyonu olayından elde edilen bakterileri ölçerken, murine nazofarenksinden aynı anda izole edilmiş diğer bakteri türlerini temsil eden kokültüre edilmiş kirleticilerle karşılaşabileceğini lütfen unutmayın. Bakteriyel ilgi suşunun bilinen herhangi bir antibiyotik direnci varsa (örneğin, S. pneumoniae'nin birçok türü gentamycin veya nemsine 5 μg / ml'ye kadar dirençlidir), büyüme medyasını uygun bir konsantrasyonda antibiyotikle destekleyerek kirleticilerin insidansını en aza indirebilir, böylece kirletici büyümeyi sınırlayabilir.
Burun lavajı örneklerindeki hücre yüzeyi belirteçlerini analiz etmek için akış sitometrisi kullanılabilir. Örneğin, bir enfeksiyon bağlamında işe alınan hücre tiplerinin analizi için, makrofajlar (F4/80 + ), nötrofiller (CD11b + ve Ly6G+) ve T hücreleri (CD3 + veCD4 + veya CD8+) dahil olmak üzere lökositlerin brüt farklılaşmasına özgü antikorların bir karışımı daha önce yayınlandığı gibi kullanılabilir. Ayrıca, bu analizler, bir enfeksiyon sırasında bağışıklık hücresi ticaretini daha iyi anlamak için farklı dokular veya kan üzerinde yapılan akış sitometrik analizi ile birleştirilebilir. Nazofarenksten izole edilebilen sınırlı sayıda hücre (genellikle düşük binlerde numaralandırma) nedeniyle, nadir alt kümeleri tanımlamak genellikle zordur, ancak bunu başarmak isteyen araştırmacılar istenen hücre sayılarını elde etmek için birden fazla fareden örnek almayı düşünmelidir. Ayrıca, bu bölgeden sınırlı sayıda hücre çıkarılabildiğinden, bu verilerin toplam hücre sayısına göre analiz edilmesi öneririz.
Protein ekspresyon seviyeleri tipik olarak nazofarenkste protein üretimini test etme olasılığını sınırlasa da, RNA seviyesindeki kolonileşen bakterilere yanıt olarak konak moleküllerin üretimini analiz etmek mümkündür. Bunu başarmak için burun lavajları, gen ekspresyonunun analiz edilmesine izin veren PBS yerine RNA liziz tamponu kullanılarak yapılabilir. qPCR amplifikasyon tespiti için, doğru ve istenen ürünün algılanmasını sağlamak için karşılık gelen bir ayrışma eğrisi (Şekil 11) çalıştırmak önemlidir. Bunun nedeni, testin astar dimerleri, kontamine DNA ve misannealed astardan PCR ürünü de dahil olmak üzere çift iplikli DNA'yı tespit etmesidir.
Umarız burada açıklanan yöntemler, bu yetersiz bölge bağlamında önemli olan patojenlere konak yanıtlarını incelemek için intranazal bir kolonizasyon modeli uygulamanızı teşvik eder. S. pneumoniaegibi bazı insan patojenleri için, önceki bir nazofarengeal kolonileşme olayı, bakteri yayılımının ve akciğerlere yayılma da dahil olmak üzere, zatürreye veya kana yol açabilecek ölümcül sekellerin önemli bir habercisi olarak işlev görür ve buna neden olan bakterisemi ve septik şok. Böylece, bu bölgedeki bakteriyel kolonizasyonu inceleyerek, onu nasıl kontrol edeceğimizi ve daha ciddi patolojinin tamamen oluşmasını nasıl önleyebileceğimizi daha iyi anlayabiliriz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Streptococcus pneumoniae'ninklinik suşlarını hediye eden Pennsylvania Üniversitesi'nden Dr. Jeffery Weiser'a teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri tarafından finanse edildi. CV, M. G. DeGroote bursu ve Kanada Toraks Derneği'nden bir burs tarafından finanse edildi. Bu çalışma Ontario Akciğer Derneği ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) tarafından finanse edildi. Bowdish laboratuvarındaki çalışmalar kısmen Michael G. DeGroote Bulaşıcı Hastalık Araştırmaları Merkezi ve McMaster İmmünoloji Araştırma Merkezi tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse Ly6C FITC | BD Pharmingen | 553104 | |
| Anti-Mouse Ly6G PE | BD Pharmingen | ||
| Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 | eBioscience | 48-0453-82 | |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen APC | eBioscience | 17-4801-82 | |
| Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 | eBioscience | 25-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0032-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC | eBioscience | 93-0041-42 | |
| Intramedic Polyethylene Tubing - PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| BD 1 ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel | Becton Dickinson | 305110 | |
| Buffer RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton Dickinson | 236950 | |
| Defibrinated Sheep Blood | PML Microbiologicals | A0404 | |
| RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0253L | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 |
References
- Bogaert, D., de Groot, R., et al. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., et al. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
- McCool, T. L., Cate, T. R., et al. The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage. J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).
- Nelson, A., Roche, A. M., et al. Capsule enhances pneumococcal colonisation by limiting mucus-mediated clearance. Infect. Immun. 75, 83-90 (2007).
- van Rossum, A., Lysenko, E., et al. Host and bacterial factors contributing to the clearance of colonisation by Streptococcus pneumoniae in a murine model. Infect. Immun. 73, 7718-7726 (2005).
- Barocchi, M. A., Ries, J., et al. A pneumococcal pilus influences virulence and host inflammatory responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2857-2862 (2006).
- Malley, R., Henneke, P., et al. Recognition of pneumolysin by Toll-like receptor 4 confers resistance to pneumococcal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1966-1971 (2003).
- McCool, T. L., Weiser, J. N. Limited role of antibody in clearance of Streptococcus pneumoniae in a murine model of colonization. Infect. Immun. 72, 5807-5813 (2004).
- Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69 (1), 426-434 (2001).
- Jeong, D., Jeong, E., et al. Difference in resistance to Streptococcus pneumoniae infection in mice. Lab Anim. Res. 27, 91-98 (2011).
- Wu, H. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., et al. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position. Lung Physiol. 282, 833-839 (2002).
- Miller, M. A., Stabenow, J. M., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
- Briles, D. E., Novak, L. Nasal Colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73 (10), 6945-6951 (2005).
- Wu, H. -Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
- Mo, Y., Wan, R., et al. Application of reverse transcription-PCR and real-time PCR in nanotoxicity research. Methods Mol. Biol. 926, 99-112 (2012).
- Kuper, C. F., Koornstra, P. J., et al. The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Trends Immunol. 13, 219-224 (1992).
- Zhang, Q., Leong, S. C., et al. Characterisation of regulatory T cells in nasal associated lymphoid tissue in children: relationships with pneumococcal colonization. PLoS Pathog. 7, (2011).
- Briles, D. E., Novak, L., et al. Nasal colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73, 6945-6951 (2005).
- Weinberger, D. M., Trzcinski, K., et al. Pneumococcal capsular polysaccharide structure predicts serotype prevalence. PLoS Pathog. 5, (2009).
- Bryant, W. P., J,, et al. Which Pneumococcal Serogroups Cause the Most Invasive Disease: Implications for Conjugate Vaccine Formulation and Use, Part I. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
- Hausdorff, W. P., Feikin, D. R., et al. Epidemiological differences among pneumococcal serotypes. Lancet Infect. Dis. 5, 83-93 (2005).
- Brueggemann, A., Griffiths, D., et al. Clonal Relationships between Invasive and Carriage Streptococcus pneumoniae and Serotype and Clone Specific Differences in Invasive Disease Potential. J. Infect. Dis. 187, 1424-1432 (2003).
- Mohler, J., Azoulay-Dupis, E., et al. Streptococcus pneumoniae strain-dependent lung inflammatory responses in a murine model of pneumococcal pneumonia. Intensive Care Med. 29, 808-816 (2003).
- Wu, H. Y., Virolainen, A., Mathews, B., King, J., Russell, M. W., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
- Zhang, Z., Clarke, T. B., et al. Cellular effectors mediating Th17-dependent clearance of pneumococcal colonization in mice. J. Clin. Invest. 119, 1899-1909 (2009).
- Parker, D., Martin, F. J., et al. Streptococcus pneumoniae DNA initiates type I interferon signaling in the respiratory tract. MBio. 2, (2011).
- Haya, D. L., Camilli, A. Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors. Mol. Microbiol. 45, 1389-1406 (2002).
- Nakamura, S., Favis, K. M., et al. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. J. Clin. Invest. 121, 3657-3665 (2011).
- Kim, J. O., Weiser, J. N. Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 177, 368-377 (1998).
- Roche, A. M., King, S. J., et al. Live attenuated Streptococcus pneumoniae strains induce serotype-independent mucosal and systemic protection in mice. Infect. Immun. 75, 2469-2475 (2007).
- Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
- Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
- Richards, L., Ferreira, D. M., Miyaji, E. N., Andrew, P. W., Kadioglu, A. The immunising effect of pneumococcal nasopharyngeal colonisation; protection against future colonisation and fatal invasive disease. Immunobiology. , 215-251 (2010).
- Lanie, J. A., Ng, W. L., et al. Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Robertson, G. T., Ng, W. L., Foley, J., Gilmour, R., Winkler, M. E. Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and. 184, 3508-3520 (2002).
- Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
- Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Organ-specific models of Streptococcus pneumoniae disease. Scand. J. Infect. D. 35, 647-652 (2003).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
