En følsom metode til at kvantificere ældede kræftceller
Summary
Hvorvidt senescence forhindrer eller fremmer tumorigenese stadig kontroversielt. Da chemotherapeutical medicin kan fremkalde kræftceller til senesce, studere senescence er afgørende for at foreslå nye behandlingsformer. Men den standard og bredt anvendt β-galactosidaseanalyse giver store ulemper. Vi foreslår her en hurtig og følsom flowcytometri-baseret assay at kvantificere degeneration.
Abstract
Humane celler ikke uendelige formere sig. Ved eksterne og / eller indre cues, kan cellerne dø eller indtaste en stabil cellecyklusstop kaldes ældning. Adskillige cellulære mekanismer, såsom telomer afkortning og unormal udtryk for mitogene onkogener, har vist sig at forårsage degeneration. Ældning er ikke begrænset til normale celler, cancerceller er også blevet rapporteret at senesce.
Chemotherapeutical lægemidler har vist sig at inducere degeneration i kræftceller. Men det er stadig kontroversielt, om degeneration forhindrer eller fremmer tumorigenese. Da det i sidste ende kunne være patient-specifikke, vil en hurtig og følsom metode til at vurdere senescens i kræftcellen snart være påkrævet.
Til dette formål viser standard β-galactosidaseanalyse, den anvendte metode, alvorlige ulemper: det er tidskrævende og ikke følsom. Vi foreslår her en flowcytometri-baseret assay at studere ældning på live celler. Dette assay har den fordel af at være hurtig, følsom, og kan kobles til immunolabeling af forskellige cellulære markører.
Introduction
Siden begyndelsen af tresserne, og dens opdagelse af Hayflick og Moorhead, stadig senescence stadig et cellulært nysgerrighed 1.. Menneskelige celler ikke uendelige formere, og ved degeneration, opfandt Hayflick og Moorhead den cellulære ældningsprocessen. Ældning er en stabil cellecyklusstop hvor cellerne forbliver metabolisk aktive i modsætning til celledød. Til dato har fire cellulære mekanismer vist sig at inducere degeneration: telomer afkortning, DNA-skader, kromatin forstyrrelse, og unormal ekspression af mitogene onkogener 2. Dette indikerer, at ikke alene normale celler, men også kræftceller er i stand til at undergå senescens 3.. Som en kendsgerning, blev kræftceller undergår degeneration vist at udgøre en hindring for yderligere tumorudvikling 4-5. Imidlertid har flere rapporter nu påpeget, at under visse omstændigheder kan cellulære ældning også fremme malignitet 6-7. Studere ældning for kræft cells er ved at blive en trang i kræftforskning, som i øjeblikket anvendes kemoterapeutiske stoffer kan føre til degeneration af kræftceller ikke kun in vitro, men også in vivo 8..
Føreren assay til at undersøge for tilstedeværelsen af senescentceller er β-galactosidaseanalyse i surt miljø. Denne histokemisk assay afspejler øget i lysosomale biogenese forekommer i de fleste senescentceller. Kort fortalt exogent X-gal, anvendt på celler, spaltes ved β-galactosidase beriget i lysosomer af senescentceller, giver anledning til en blå farve 9.. De blå senescentceller kan derefter kvantificeres under et lysfelt mikroskop. Selvom meget populær, præsenterer β-galactosidaseanalyse store ulemper. Først er dette assay udføres på fikserede celler. For det andet, det er tidskrævende, fordi det indebærer at kvantificere graden af ældning ved at tælle et signifikant højt antal senescentceller under et mikroskop. Tredje dette assayer ikke følsom som den forskelsbehandling mellem ældede og ikke-senescentceller helt afhængig af observatør.
Vi diskuterer her et uudnyttet, hurtig og følsom cytometri-baseret assay til at vurdere tilstedeværelsen af levende senescentceller. Dette assay er baseret på hydrolyse af en membranpermeabel molekyle, 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranosid (C 12 FDG), ved β-galactosidase beriget i senescentceller. Efter hydrolyse og laser excitation udsender C 12 FDG grøn fluorescens, og kan derfor detekteres ved flowcytometri 10, 11. Påvisning af senescentceller via flowcytometri giver den store fordel at være hurtigere og mere følsom. Desuden kan detektering af senescentceller ved flowcytometri kobles med påvisning af andre cellulære markører. Dette assay kan anvendes til at detektere senescentceller i en population af kræftceller behandlet med kemoterapi og kan rutinemæssigt indstillesop på vævssnit, efter cellulær dissociation. i klinikken
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi præsenteres her en flowcytometri-baserede metode til at kvantificere cellulær degeneration i levende kræftceller. Denne metode er baseret på anvendelsen af membranen permeabel substans, C 12 FDG, og kan derfor anvendes i alle celletyper og efter forskellige behandlinger, så længe forbindelsen er taget op af cellerne. Efter cellulær optagelse, er C 12 FDG hydrolyseres af β-galactosidase, beriget i lysosomer af senescentceller. Efter laserexcitation, udsender forbindelsen grøn fluorescens…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker SF 4206 Icore (Université de Caen) for anvendelsen af cytometri facilitet. JC modtog ph.d.-stipendier fra Conseil de Radioprotection d'EDF og Conseil Régional i Basse-Normandie. Disse data var en del af projekter finansieret af Ligue Nationale contre le Cancer – Comités de l'Orne et du Calvados.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
- Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
- Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
- Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
- Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
- Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).
