Summary

En følsom metode til at kvantificere ældede kræftceller

Published: August 02, 2013
doi:

Summary

Hvorvidt senescence forhindrer eller fremmer tumorigenese stadig kontroversielt. Da chemotherapeutical medicin kan fremkalde kræftceller til senesce, studere senescence er afgørende for at foreslå nye behandlingsformer. Men den standard og bredt anvendt β-galactosidaseanalyse giver store ulemper. Vi foreslår her en hurtig og følsom flowcytometri-baseret assay at kvantificere degeneration.

Abstract

Humane celler ikke uendelige formere sig. Ved eksterne og / eller indre cues, kan cellerne dø eller indtaste en stabil cellecyklusstop kaldes ældning. Adskillige cellulære mekanismer, såsom telomer afkortning og unormal udtryk for mitogene onkogener, har vist sig at forårsage degeneration. Ældning er ikke begrænset til normale celler, cancerceller er også blevet rapporteret at senesce.

Chemotherapeutical lægemidler har vist sig at inducere degeneration i kræftceller. Men det er stadig kontroversielt, om degeneration forhindrer eller fremmer tumorigenese. Da det i sidste ende kunne være patient-specifikke, vil en hurtig og følsom metode til at vurdere senescens i kræftcellen snart være påkrævet.

Til dette formål viser standard β-galactosidaseanalyse, den anvendte metode, alvorlige ulemper: det er tidskrævende og ikke følsom. Vi foreslår her en flowcytometri-baseret assay at studere ældning på live celler. Dette assay har den fordel af at være hurtig, følsom, og kan kobles til immunolabeling af forskellige cellulære markører.

Introduction

Siden begyndelsen af tresserne, og dens opdagelse af Hayflick og Moorhead, stadig senescence stadig et cellulært nysgerrighed 1.. Menneskelige celler ikke uendelige formere, og ved degeneration, opfandt Hayflick og Moorhead den cellulære ældningsprocessen. Ældning er en stabil cellecyklusstop hvor cellerne forbliver metabolisk aktive i modsætning til celledød. Til dato har fire cellulære mekanismer vist sig at inducere degeneration: telomer afkortning, DNA-skader, kromatin forstyrrelse, og unormal ekspression af mitogene onkogener 2. Dette indikerer, at ikke alene normale celler, men også kræftceller er i stand til at undergå senescens 3.. Som en kendsgerning, blev kræftceller undergår degeneration vist at udgøre en hindring for yderligere tumorudvikling 4-5. Imidlertid har flere rapporter nu påpeget, at under visse omstændigheder kan cellulære ældning også fremme malignitet 6-7. Studere ældning for kræft cells er ved at blive en trang i kræftforskning, som i øjeblikket anvendes kemoterapeutiske stoffer kan føre til degeneration af kræftceller ikke kun in vitro, men også in vivo 8..

Føreren assay til at undersøge for tilstedeværelsen af ​​senescentceller er β-galactosidaseanalyse i surt miljø. Denne histokemisk assay afspejler øget i lysosomale biogenese forekommer i de fleste senescentceller. Kort fortalt exogent X-gal, anvendt på celler, spaltes ved β-galactosidase beriget i lysosomer af senescentceller, giver anledning til en blå farve 9.. De blå senescentceller kan derefter kvantificeres under et lysfelt mikroskop. Selvom meget populær, præsenterer β-galactosidaseanalyse store ulemper. Først er dette assay udføres på fikserede celler. For det andet, det er tidskrævende, fordi det indebærer at kvantificere graden af ​​ældning ved at tælle et signifikant højt antal senescentceller under et mikroskop. Tredje dette assayer ikke følsom som den forskelsbehandling mellem ældede og ikke-senescentceller helt afhængig af observatør.

Vi diskuterer her et uudnyttet, hurtig og følsom cytometri-baseret assay til at vurdere tilstedeværelsen af ​​levende senescentceller. Dette assay er baseret på hydrolyse af en membranpermeabel molekyle, 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranosid (C 12 FDG), ved β-galactosidase beriget i senescentceller. Efter hydrolyse og laser excitation udsender C 12 FDG grøn fluorescens, og kan derfor detekteres ved flowcytometri 10, 11. Påvisning af senescentceller via flowcytometri giver den store fordel at være hurtigere og mere følsom. Desuden kan detektering af senescentceller ved flowcytometri kobles med påvisning af andre cellulære markører. Dette assay kan anvendes til at detektere senescentceller i en population af kræftceller behandlet med kemoterapi og kan rutinemæssigt indstillesop på vævssnit, efter cellulær dissociation. i klinikken

Protocol

1.. Udarbejdelse af C12FDG, bafilomycin A1 og Cell Culture Opløs C 12 FDG pulver i dimethylsulfoxid (DMSO) til en slutkoncentration på 20 mM. Alikvot og opbevares ved -20 ° C. DMSO bør anvendes med passende sikkerhedsbetingelser. Opløs bafilomycin A1 pulver i DMSO til en slutkoncentration på 0,1 mM. Alikvot og opbevares ved – 20 ° C. Bafilomycin bør anvendes med passende sikkerhedsbetingelser. Dyrke RPMI 8226 cellelinie eller andre cellelinier adhærente eller ikke, i me…

Representative Results

Myelomatose, en hæmatologisk malignitet, blev anvendt til at evaluere degeneration induceret af en kemoterapeutiske procedure. At gøre en kommercielt tilgængelig MM cellelinje (RPMI 8226) blev behandlet i 2 dage med doxorubicin, et kemoterapeutiske lægemiddel. Cellerne blev derefter underkastet bafilomycin A1 behandling og yderligere inkuberet med C 12 FDG. Celler blev analyseret ved flowcytometri. Figur 1 illustrerer de forskellige trin og viser, at procentdelen af senescentceller kan be…

Discussion

Vi præsenteres her en flowcytometri-baserede metode til at kvantificere cellulær degeneration i levende kræftceller. Denne metode er baseret på anvendelsen af membranen permeabel substans, C 12 FDG, og kan derfor anvendes i alle celletyper og efter forskellige behandlinger, så længe forbindelsen er taget op af cellerne. Efter cellulær optagelse, er C 12 FDG hydrolyseres af β-galactosidase, beriget i lysosomer af senescentceller. Efter laserexcitation, udsender forbindelsen grøn fluorescens…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker SF 4206 Icore (Université de Caen) for anvendelsen af ​​cytometri facilitet. JC modtog ph.d.-stipendier fra Conseil de Radioprotection d'EDF og Conseil Régional i Basse-Normandie. Disse data var en del af projekter finansieret af Ligue Nationale contre le Cancer – Comités de l'Orne et du Calvados.

Materials

Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments
5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside Invitrogen D-2893
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Bafilomycin A1 Sigma B1793
Doxorubicin Sandoz
Trypan blue Sigma T8154
RPMI 1640 cell culture medium Lonza BE12-702
Fetal calf serum PAA Laboratories GmBH A15 101
Antibiotics Gibco 5290-018
Gallios flow cytometer Beckman Coulter A94291

References

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
  3. Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
  4. Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
  5. Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
  6. Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
  7. Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
  8. Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
  9. Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
  10. Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
  11. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  12. Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).

Play Video

Cite This Article
Cahu, J., Sola, B. A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells. J. Vis. Exp. (78), e50494, doi:10.3791/50494 (2013).

View Video