Un metodo sensibile per quantificare le cellule tumorali senescenti
Summary
Sia senescenza impedisce o promuove la tumorigenesi rimane controverso. Poiché i farmaci chemioterapici possono indurre le cellule tumorali a senesce, studiando la senescenza è essenziale per proporre nuove terapie. Tuttavia, il dosaggio standard di β-galattosidasi e ampiamente utilizzato presenta gravi inconvenienti. Proponiamo qui un saggio di citometria di flusso basato rapido e sensibile per quantificare senescenza.
Abstract
Le cellule umane non proliferano indefinitamente. Su indicazioni esterne e / o intrinseca, le cellule potrebbero morire o entrare in un arresto del ciclo cellulare stabile chiamato senescenza. Diversi meccanismi cellulari, come accorciamento dei telomeri e anormale espressione di oncogeni mitogeni, hanno dimostrato di causare senescenza. La senescenza non è limitato alle cellule normali, sono state riportate anche le cellule tumorali a senesce.
Farmaci chemioterapici hanno dimostrato di indurre la senescenza nelle cellule tumorali. Tuttavia, resta controverso se la senescenza impedisce o promuove la tumorigenesi. Come potrebbe eventualmente essere paziente-specifico, sarà presto necessario un metodo rapido e sensibile per valutare senescenza in cellule di cancro.
A tal fine, il saggio β-galattosidasi standard, il metodo attualmente utilizzato, presenta notevoli svantaggi: è tempo e non è sensibile. Proponiamo qui un saggio di citometria a base di flusso per studiare senescenza su Live cellule. Questo saggio offre il vantaggio di essere rapida, sensibile, e può essere accoppiato al immunomarcatura dei diversi marcatori cellulari.
Introduction
Poiché primi anni Sessanta e la sua scoperta da Hayflick e Moorhead, senescenza rimane una curiosità cellulare 1. Le cellule umane non proliferano indefinitamente e, da senescenza, Hayflick e Moorhead coniato il processo di invecchiamento cellulare. Senescenza è un arresto del ciclo cellulare stabile in cui le cellule rimangono metabolicamente attive in contrapposizione alla morte cellulare. Ad oggi, quattro meccanismi cellulari hanno mostrato di indurre senescenza: telomeri, danno al DNA, cromatina perturbazione, e anormale espressione di oncogeni mitogenico 2. Ciò indica che non solo le cellule normali, ma anche le cellule tumorali sono in grado di sottoporsi a senescenza 3. È un dato di fatto, le cellule di cancro sottoposti senescenza hanno mostrato di costituire una barriera ulteriore progressione tumorale 4-5. Tuttavia, diversi studi hanno ormai evidenziato che, in determinate circostanze, la senescenza cellulare può anche promuovere malignità 6-7. Studiare la senescenza di cancro celLS sta per diventare uno stimolo nella ricerca sul cancro come attualmente utilizzati farmaci chemioterapici possono portare alla senescenza delle cellule tumorali non solo in vitro ma anche in vivo 8.
Il saggio maestro di indagare per la presenza di cellule senescenti è il saggio β-galattosidasi a pH acido. Questo saggio istochimico riflette l'aumento nella biogenesi lisosomiale che si verificano nella maggior parte delle cellule senescenti. Brevemente, esogeno X-gal, applicato alle celle, è tagliata da β-galattosidasi arricchito in lisosomi delle cellule senescenti, dando origine ad un colore blu 9. Le cellule senescenti blu possono quindi essere quantificati al microscopio in campo chiaro. Anche se molto popolare, il saggio di β-galattosidasi presenta grossi inconvenienti. Prima, questa prova viene eseguita su cellule fissate. Secondo, è molto tempo perché implica per quantificare il grado di senescenza contando un significativamente elevato numero di cellule senescenti al microscopio. Terzo, questo dosaggionon è sensibile come la discriminazione tra cellule senescenti e non senescenti si basa interamente sul osservatore.
Discutiamo qui un, analisi di citometria a base di veloce, sensibile e non sfruttato per valutare la presenza di cellule senescenti dal vivo. Questo saggio è basato sulla idrolisi di una membrana permeabile molecola, il 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galattopiranoside (C 12 FDG), da β-galattosidasi arricchita in cellule senescenti. Dopo idrolisi e eccitazione laser, il C 12 FDG emette fluorescenza verde e può quindi essere rilevata mediante citometria di flusso 10, 11. Il rilevamento di cellule senescenti tramite citofluorimetria offre il grande vantaggio di essere rapido e sensibile. Inoltre, la rilevazione di cellule senescenti mediante citometria di flusso può essere accoppiato con il rilevamento di altri marcatori cellulari. Questo test può essere utilizzato per rilevare le cellule senescenti all'interno di una popolazione di cellule cancerose trattati con chemioterapia e può essere impostato routinariamentesu su sezioni di tessuto, dopo la dissociazione cellulare, in clinica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo presentato qui un metodo di citometria a base di flusso per quantificare la senescenza cellulare in cellule tumorali dal vivo. Questo metodo si basa sull'uso del composto membrana permeabile, il C 12 FDG, e può quindi essere utilizzato in qualsiasi tipi cellulari e dopo vari trattamenti finché il composto viene assorbito dalle cellule. Dopo l'assorbimento cellulare, il C 12 FDG viene idrolizzato dalla β-galattosidasi, arricchito nei lisosomi delle cellule senescenti. Dopo eccitaz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il SF 4206 ICORE (Université de Caen) per l'utilizzo della struttura di citometria. JC ha ricevuto borse di studio post-dottorato dal Conseil de Radioprotezione d'EDF e Conseil Régional della Bassa Normandia. Tali dati erano parte di progetti finanziati dalla Ligue Nationale contre le Cancer – Comités de l'Orne et du Calvados.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
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