שיטה רגישה לכמת תאי סרטן senescent
Summary
אם מונעת הזדקנות או מקדמת tumorigenesis נותר שנוי במחלוקת. מאז תרופות chemotherapeutical יכולות לגרום לתאים סרטניים להזדקן, לומד הזדקנות הוא חיוני למציעים טיפולים חדשים. עם זאת, assay β-גלקטוזידאז הסטנדרטי ומשמש באופן נרחב מציג חסרונות עיקריים. אנו מציעים כאן assay מבוסס זרימת cytometry מהירה ורגיש לכמת הזדקנות.
Abstract
תאים אנושיים לא ללא הגבלת זמן להתרבות. על הרמזים חיצוניים ו / או פנימיים, תאים עלולים למות או להיכנס לעצירת מחזור תא יציב הנקראת הזדקנות. כמה מנגנונים תאיים, כמו התקצרות הטלומרים וביטוי לא תקין של אונקוגנים mitogenic, הוכחו לגרום להזדקנות. הזדקנות אינה מוגבלת לתאים נורמלים; כבר דיווחו תאים סרטניים גם להזדקן.
תרופות Chemotherapeutical הוכחו לגרום להזדקנות בתאים סרטניים. עם זאת, נותר שנוי במחלוקת בין ההזדקנות מונעת או מקדמת tumorigenesis. כפי שסופו של דבר עשוי להיות מטופל ספציפי, שיטה מהירה ורגישה להערכת הזדקנות בתא סרטני בקרוב תידרש.
לשם כך, assay הסטנדרטי β-גלקטוזידאז, שיטה המשמשת כיום, מציגה חסרונות עיקריים: זה זמן רב ולא רגיש. אנו מציעים כאן assay מבוסס cytometry זרימה ללמוד הזדקנות על live תאים. assay זה מציע את היתרון של להיות מהיר, רגיש, ויכול להיות בשילוב לimmunolabeling של סמנים תאיים שונים.
Introduction
מאז ראשית שנות השישים וגילויו על ידי Hayflick ומורהד, הזדקנות עדיין נשארה סקרנות סלולרית 1. תאים אנושיים לא לזמן בלתי מוגבל ולהתרבות, על ידי הזדקנות, Hayflick ומורהד טבעו את התהליך הסלולרי של הזדקנות. הזדקנות היא עצירת מחזור תא יציב שבו תאים נשארים פעילים מטבולית בניגוד למוות תאי. נכון להיום, ארבעה מנגנונים תאיים הוכחו לגרום להזדקנות: התקצרות הטלומרים, נזק לדנ"א, הפרעות הכרומטין, וביטוי לא תקין של אונקוגנים mitogenic 2. זה מצביע על כך לא רק תאים נורמלים, אלא גם תאים סרטניים מסוגלים לעבור הזדקנות 3. כעניין של עובדה, תאים סרטניים שעברו הזדקנות הוצגו מהווים מכשול להתקדמות נוספת 4-5 גידול. עם זאת, מספר דוחות החברה ציינו כי, בנסיבות מסוימות, הזדקנות תאית יכולה גם לקדם ממאירות 6-7. לומד הזדקנות של הסרטן celLS עומד להיות דחף בחקר הסרטן המשמש כיום כתרופות כימותרפיות יכולות להוביל להזדקנות של תאים סרטניים במבחנה לא רק, אלא גם in vivo 8.
Assay האדון לחקור את הימצאותם של תאים מזדקנים הוא assay β-גלקטוזידאז ב-pH חומצי. assay histochemical זה משקף את העלייה בbiogenesis lysosomal מתרחש ברוב התאים מזדקנים. בקצרה, אקסוגני X-gal, הוחל לתאים, הוא ביקע ידי β-גלקטוזידאז המועשר בlysosomes של תאים מזדקנים, והוליד צבע כחול 9. לאחר מכן ניתן לכמת את התאים המזדקנים הכחולים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. אמנם פופולרי מאוד, assay β-גלקטוזידאז מציג חסרונות עיקריים. ראשית, assay זה מתבצע בתאים קבועים. שנית, זה זמן רב, משום שמשתמע לכמת את מידת ההזדקנות על ידי ספירת מספר גבוה באופן משמעותי של תאים מזדקנים תחת מיקרוסקופ. שלישית, assay זהאינו רגיש לאפליה בין תאים מזדקנים ואינם senescent לחלוטין מסתמכת על המתבונן.
אנו דנים כאן assay בלתי מנוצל, מהיר, ורגיש המבוסס על cytometry להעריך את הימצאותם של תאים מזדקנים חיים. assay זה מבוסס על הידרוליזה של מולקולה חדירה קרום, 5 dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (C 12 FDG), על ידי β-גלקטוזידאז מועשר בתאים מזדקנים. לאחר הידרוליזה ועירור לייזר, FDG C 12 פולט הקרינה ירוקה ולכן יכול להיות מזוהה על ידי זרימת cytometry 10, 11. זיהוי של תאים מזדקנים באמצעות cytometry הזרימה מציע את היתרון של להיות מהיר ורגיש מאוד. בנוסף לכך, זיהוי של תאים מזדקנים ידי cytometry הזרימה יכול להיות בשילוב עם זיהוי של סמנים תאיים אחרים. assay זה יכול לשמש כדי לזהות תאים מזדקנים בתוך אוכלוסייה של תאים סרטניים שטופלו בכימותרפיה וניתן להגדיר באופן שגרתיעל סעיפי רקמות, לאחר הניתוק סלולרי, במרפאה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצגנו כאן שיטה המבוססת על זרימת cytometry לכמת הזדקנות תאית בתאי סרטן חיים. שיטה זו מבוססת על השימוש במתחם החדיר הקרום, FDG C 12, ולכן יכולה לשמש בכל סוגי תאים, ולאחר טיפולים שונים, כל עוד המתחם הוא נלקח על ידי התאים. על ספיגת הסלולר, FDG C 12 הוא הידרוליזה על ידי β-גלקט?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים SF 4206 ICORE (אוניברסיטת דה קאן) עבור השימוש במתקן cytometry. JC קיבל מלגות לפוסט דוקטורט מConseil d'דה Radioprotection EDF וConseil האזורי של נורמנדי התחתי. נתונים אלה היו חלק מפרויקטים שמומנו על ידי Ligue Nationale contre le הסרטן – Comités de l'אורן et du קלבדוס.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
- Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
- Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
- Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
- Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
- Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).
