En følsom metode for å kvantifisere senescent kreftceller
Summary
Enten senescence hindrer eller fremmer tumorigenesis fortsatt kontroversielt. Siden chemotherapeutical medikamenter kan indusere kreft celler til å senesce, studere senescence er avgjørende for å foreslå nye behandlingsformer. Imidlertid presenterer standard og bredt brukes β-galaktosidase-analyse store ulemper. Det foreslås her en hurtig og følsom flowcytometri-basert assay for å kvantifisere senescens.
Abstract
Menneskeceller ikke ubestemt tid sprer. Ved eksterne og / eller indre signaler, kan celler dør eller angi en stabil cellesyklus arrest kalt senescence. Mange cellulære mekanismer, for eksempel telomerer forkortes og unormal ekspresjon av mitogene onkogener, har vist seg å forårsake begynnende alderdom. Senescence er ikke begrenset til normale celler, kreftceller har også blitt rapportert å senesce.
Chemotherapeutical narkotika har vist seg å indusere senescence i kreftceller. Imidlertid er det fortsatt kontroversielt hvorvidt senescence hindrer eller fremmer tumorigenesis. Som det kan eventuelt være pasient-spesifikke, vil en hurtig og følsom metode for å vurdere senescens i kreftcelle snart være nødvendig.
For dette formål, presenterer standard β-galaktosidase-analyse, den for tiden brukte metode, store ulemper: det er tidkrevende og ikke følsom. Vi foreslår her en flowcytometri-baserte analysen for å studere senescence på live celler. Denne analysen har fordelen av å være hurtig, sensitiv og kan kobles sammen med den immunolabeling av ulike cellulære markører.
Introduction
Siden begynnelsen av sekstitallet og sin oppdagelse av Hayflick og Moorhead, forblir senescence fortsatt en mobil nysgjerrighet en. Menneskeceller ikke ubestemt tid spre seg og, etter senescence, Hayflick og Moorhead innførte mobilnettet aldringsprosessen. Senescence er en stabil cellesyklus-stans i hvilken celler forblir metabolsk aktive i motsetning til cellulær død. Hittil har fire cellulære mekanismene vist seg å indusere senescence: telomerer forkortes, DNA-skade, kromatin uro og unormal uttrykk for mitogene oncogenes to. Dette indikerer at ikke bare normale celler, men også kreftceller er i stand til å gjennomgå senescens 3.. Som et spørsmål om Faktisk ble kreftceller gjennomgår senescens vist seg å utgjøre en barriere mot ytterligere tumor progresjon 4-5. Imidlertid har flere rapporter nå påpekt at, under visse omstendigheter, kan cellular senescence også fremme malignitet 6-7. Studerer senescence av kreft cells er i ferd med å bli en trang i kreftforskning som i dag brukes cellegifter kan føre til senescence av kreftceller ikke bare in vitro, men også in vivo åtte.
Master analyse for å undersøke for tilstedeværelse av senescent celler er β-galaktosidase-analyse ved sur pH. Dette histochemical analysen reflekterer økt i lysosomalt biogenesis forekommer i de fleste senescent celler. Kort fortalt blir eksogene X-gal, anvendt på celler, spaltet ved β-galaktosidase anriket på lysosomene til senescent celler, gir opphav til en blå farge 9.. De blå senescent cellene kan da kvantifiseres under et sterkt felt mikroskop. Selv om svært populært, presenterer β-galaktosidase analysen store ulemper. Først blir denne analysen utført på faste celler. For det andre er det tidkrevende, fordi det innebærer å kvantifisere graden av senescence ved å telle en betydelig høyt antall senescent cellene under et mikroskop. Tredje, denne analysener ikke følsom som diskriminering mellom senescent og ikke-senescent celler helt avhengig av observatøren.
Vi diskuterer her et uutnyttet, rask og følsom cytometry-baserte analysen å vurdere for tilstedeværelse av levende senescent celler. Denne analysen er basert på hydrolyse av en permeabel membran molekyl, 5-di-dodecanoylaminofluorescein β-D-galaktopyranosid (C 12 FDG), ved β-galaktosidase anriket på senescent celler. Etter hydrolyse og laser-eksitasjon, avgir C 12 FDG grønn fluorescens og kan derfor påvises ved flyt-cytometri 10, 11 sammen. Påvisning av senescent celler via flow cytometri byr den store fordel av å være hurtig og følsom. I tillegg kan påvisning av senescent celler ved flow cytometri være kombinert med påvisning av andre cellulære markører. Denne analysen kan brukes til å detektere senescent celler i en populasjon av kreftceller behandlet med kjemoterapi og kan rutinemessig sattopp på vevsdelene, etter mobilnettet dissosiasjon, i klinikken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenteres her en flowcytometri-basert metode for å kvantifisere mobilnettet senescence i levende kreftceller. Denne metoden er basert på bruk av membranen permeabel forbindelse, C 12 FDG, og kan derfor benyttes i alle celletyper og etter forskjellige behandlinger så lenge forbindelsen blir tatt opp av cellene. Ved cellulært opptak, er C 12 FDG hydrolysert ved β-galaktosidase, anriket på lysosomene til senescent celler. Etter laser eksitasjon, avgir det sammensatte grønn fluorescens, noe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker SF 4206 icore (Université de Caen) for bruk av cytometry anlegget. JC fikk postdocs fra Conseil de strålevern d'EDF og Conseil Régional av Basse-Normandie. Disse data var en del av prosjekter finansiert av Ligue Nationale contre le Cancer – comites de l'Orne et du Calvados.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
- Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
- Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
- Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
- Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
- Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).
