Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מטבולית תיוג של אוצין עשיר חזור קינאזות 1 ו -2 עם רדיואקטיבי פוספט

Published: September 18, 2013 doi: 10.3791/50523
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven and Leuven Institute for Neuroscience and Disease (LIND)

Summary

קינאזות אוצין העשיר החוזרת 1 ו -2 (LRRK1 וLRRK2) הם חלבוני multidomain אשר לקודד שני GTPase ותחומים קינאז ואשר פוספורילציה בתאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתייג LRRK1 וLRRK2 בתאים עם 32 orthophosphate P, ובכך לספק אמצעים כדי למדוד את רמות phophorylation הסלולרי הכוללות שלהם.

Abstract

קינאזות אוצין החוזרת עשיר 1 ו -2 (LRRK1 וLRRK2) הם paralogs אשר חולק ארגון תחום דומה, לרבות תחום קינאז סרין-תראונין, ראס של תחום חלבונים מורכב (ROC), C-מסוף של תחום ROC (COR), ולאוצין עשיר וחוזר כמו ankyrin-בN-הסופית. התפקידים הסלולריים המדויקים של LRRK1 וLRRK2 עדיין לא הובהר, עם זאת LRRK1 היה מעורב בקולטן טירוזין קינאז איתות 1,2, בעוד LRRK2 הוא מעורב בפתוגנזה של מחלת פרקינסון 3,4. בדו"ח זה, אנו מציגים פרוטוקול לתייג חלבוני LRRK1 וLRRK2 בתאים עם 32 orthophosphate P, ובכך לספק אמצעים כדי למדוד את רמות זירחון הכוללות של 2 החלבונים האלה בתאים. בקיצור, זיקה מתויגת חלבוני LRRK באים לידי ביטוי בתאי HEK293T החשופים למדיום המכיל 32 P-orthophosphate. 32 P-orthophosphate נטמע על ידי התאים רק לאחר כמהשעות של דגירה וכל המולקולות בתא המכיל פוספטים מסומנות ובכך רדיואקטיבית. באמצעות תג הזיקה (3xflag) חלבוני LRRK מבודדים ממרכיבים תאיים אחרים על ידי immunoprecipitation. Immunoprecipitates אז מופרדים באמצעות SDS-PAGE, מחק לממברנות PVDF וניתוח של פוספטים המשולבים מתבצע על ידי autoradiography (אות 32 P) וזיהוי מערבי (אות חלבון) של החלבונים בכתמים. הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם כדי לפקח זירחון של כל חלבון אחר שיכול לבוא לידי ביטוי בתאים ומבודד על ידי immunoprecipitation.

Introduction

קינאזות אוצין העשיר החוזרת 1 ו -2 (LRRK1 וLRRK2) הם paralogs multidomain אשר חולק ארגון תחום דומה. שני החלבונים לקודד רצף GTPase דומה למשפחת ראס של GTPases (ראס של חלבונים מורכבים, או ROC), כמו גם בטרמינל C-של תחום ROC (COR), ביעילות סיווג שני החלבונים למשפחת חלבוני Roco 5,6. N-מסוף של טנדם תחום ROC-COR, שני החלבונים לקודד תחום חוזר לאוצין עשיר, כמו גם תחום כמו ankyrin-, בעוד שרק LRRK2 מקודד ארמדיל נוסף domein 6-8. בטרמינל C-של ROC-COR, שני החלבונים לשתף תחום קינאז סרין-תראונין בעוד שרק LRRK2 מקודד תחום WD40 באזור טרמינל C-8. התפקידים הסלולריים המדויקים של LRRK1 וLRRK2 עדיין לא הובהר, עם זאת LRRK1 היה מעורב בקולטן טירוזין קינאז איתות 1,2, בעוד נקודות ראיות גנטיות לתפקיד לLRRK2 בפתוגנזה של מחלת פרקינסון 3,4.

class = "jove_content"> זירחון של חלבונים הוא מנגנון רגולציה משותף בתאים. לדוגמא, זרחון יכול להיות חיוני להפעלה של אנזימים או לגיוס של חלבונים מורכבים איתות. זירחון הסלולרי של LRRK2 התאפיין בהרחבה ומיפוי phosphosite הראה רוב אתרי זירחון הסלולרי להתרחש באשכול בין חוזר ankyrin ותחומים חוזרים עשירים לאוצין 9-11. למרות שאתרי זירחון הסלולרי LRRK1 עדיין לא ממופים, ראיות ממחקרים באמצעות מכתים phosphoprotein של כתמי חלבון LRRK1 immunoprecipitated של מתאי COS7 מצביעות על כך שחלבון LRRK1 פוספורילציה בתאים 12.

מאמר זה מספק פרוטוקול בסיסי למנסה לאמוד רמת זירחון הכללית של LRRK1 וLRRK2 בשורות תאים באמצעות תיוג חילוף חומרים עם 32 P-orthophosphate. האסטרטגיה הכוללת היא פשוטה. זיקה מתויגת הגנה של מחזור LRRKתוספות באות לידי ביטוי בתאי HEK293T החשופים למדיום המכיל 32 P-orthophosphate. 32 P-orthophosphate נטמע על ידי התאים רק לאחר כמה שעות של דגירה וכל המולקולות בתא המכיל פוספטים מסומנים ובכך רדיואקטיבית. תג הזיקה (3xflag) לאחר מכן נעשה שימוש כדי לבודד את חלבוני LRRK ממרכיבים תאיים אחרים על ידי immunoprecipitation. Immunoprecipitates אז מופרדים באמצעות SDS-PAGE, מחק לממברנות PVDF וניתוח של פוספטים המשולבים מתבצע על ידי autoradiography (אות 32 P) וזיהוי מערבי (אות חלבון) של החלבונים בכתמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי משתמש orthophosphate P-שהכותרת רדיואקטיביים 32 לעקוב זירחון הסלולרי של LRRK2. חשוב לזכור כי כל הפעולות עם חומרים כימיים רדיואקטיבי צריכה להתבצע באמצעות אמצעי הגנה מתאים כדי למזער את החשיפה של קרינה רדיואקטיבית למפעיל ואיכות הסביבה. תרכובות המכילות איזוטופים שפולטות קרינה מייננת יכולות להזיק לבריאות אדם ורישוי מחמיר ותקנות בשליטה ברמה מוסדית ולאומית את השימוש בם. הניסויים בפרוטוקול זה בוצעו לאחר אימון בשימוש בקרינת קוד פתוח מהאוניברסיטה הקתולית של לובן (KU Leuven) ובהתאם להנחיות לתרגול במעבדה טובות הניתנות על ידי מחלקת בריאות, הבטיחות והסביבה באוניברסיטה. מספר צעדים בפרוטוקול שלנו בפריסה רחבה כמו תרבות תאים, SDS-PAGE, מערבי סופג ונתנו כאן פירוט של הפרוטוקול כפי שהוחל במעבדה שלנו. זה זהלציין hould שתנאי ניסוי מדויקים משתנים ממעבדה למעבדה, ולכן צעדים מסוימים על מנת להבטיח טיפול נאות של חומר רדיואקטיבי צריכים להיות מותאמים לכל מעבדה הגדרה חדשה.

שימוש בקרינת קוד פתוח כפופה לאישור רגולטורים לפני והגוף הרגולטורי האחראי על קרינת קוד פתוח במחקר מעבדה משתנה ממדינה למדינה. משתמשים צריכים להתייעץ עם קצין הבטיחות שלהם מוסדי קרינה על מנת להבטיח הליך שמתאימים לכללים ותקנות מקומיים. ניתן למצוא מידע על גופים רגולטוריים: בבלגיה, הסוכנות הפדרלית לפיקוח גרעיני (http://www.fanc.fgov.be, אתר בצרפתית או הולנדי), בבריטניה, הבריאות ובטיחות ההנהלה (http: / / Www.hse.gov.uk / קרינה / מייננת / index.htm), בארצות הברית Nucועדת ליר תקינה (http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html), בקנדה הוועדה הקנדית לבטיחות גרעינית (http://nuclearsafety.gc.ca/eng/), ו בגרמניה דאס Bundesamt für Strahlenschutz (http://www.bfs.de/de/bfs). אמצעי בטיחות רלוונטי לפרוטוקול זה כבר ציין בטקסט, מודגש עם סמל תלתן רדיואקטיבי ( רד סמל ).

1. תיוג המטבולית של תאים

  1. הכן את התאים לתיוג.
    1. שורות תאי HEK293T התרבות בהתאם לתנאי תרבות סטנדרטיים (37 ° C CO, 2 5%) בDMEM עם 8% עוברי עגל בסרום וgentamycin.
    2. הרחב את התאים מספיק כדילהשיג לפחות x 1 10 6 תאים לדגימה לבדיקה.
    3. Trypsinize תאים וצלחת החוצה אל 6 צלחות היטב (35 מ"מ קוטר) ב10 6 תאים / היטב.
    4. 24 שעות לאחר ציפוי את תאים, להביע את חלבון 3xflag-LRRK2 באמצעות transfection או התמרה בתיווך וקטור lentiviral.
      1. עבור transfection, לערבב לדגימה ה-DNA 4 מיקרוגרם (pCHMWS-3xflag-LRRK2 פלסמיד 13-15 או pCHMWS-3xflag-LRRK1 פלסמיד 15) ו -8 μl של polyethyleneimine יניארי (PEI ליניארי, 1 מ"ג / מיליליטר) ל80 DMEM μl (בלי תוספות ). לאפשר למורכב עבור 15-30 דקות לאחר מכן להוסיף את המתחם לתאים על ידי ערבוב גם לתוך הווה בינוני.
      2. לתמרת וקטור בתיווך lentiviral, לדלל וקטור קידוד 3xflag-LRRK1 lentiviral או -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, ככלל אצבע, transduce עם פי שתיים יחידות transducing רבות, דהיינו מספר חלקיקי וקטור הפונקציונליים, של Lentivector כפי שיש תאים) לתוך מדיום התרבות. תיאור של המוצר יון של LV-3xflag-LRRK1 / 2 כבר בעבר תאר 15.
    5. כאשר תאי מחוברות 80-100% (כ 48 שעות לאחר transfection או התמרה), לשטוף תאים עם DMEM prewarmed (37 מעלות צלזיוס) בלי פוספטים.
  2. תאי תווית עם 32 P-Ortho-פוספט.
    1. שמור בעקרונות כלליים את הדעה של בטיחות בעבודה עם קרינה.
      1. רד סמל לבצע את כל הפעולות עם 32 P באזור קרינה מיועד לכך.
      2. רד סמל ציוד מגן אישי מתאים צריך להיות משוחק - פי נוהל עבודה רגיל במעבדה שלנו אלה כוללים חלוק מעבדה, כפפות כפולות ומשקפי מגן.
      3. "Src =" g / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> כל העבודה עם 32 P צריכה להיות מוגן ממשתמשים ב -6 מסכי פרספקס מ"מ כדי לצמצם את החשיפה.
      4. רד סמל תמיד צריכים להיות בשימוש מכשירי ניטור אישי - בתוך KUL כל המשתמשים קרינת הקוד פתוח מוסמכים לובש תג סרט המצורף לכיס החזה של חלוק המעבדה כדי לפקח על חשיפה לקרינה במהלך ניסויים.
      5. רד סמל כל המשטחים הניסיוניים יש לבחון לרדיואקטיביות לפני ואחרי השימוש במונה גייגר.
      6. רד סמל כל החומרים המתכלים שעשוי להיות נגועים צריכים להיות מסולקים בהקפדה על הנחיות מוסדיות לraסילוק פסולת dioactive.
    2. תחת זרימה למינרית, להכין צינור פלקון עם 2.1 מיליליטר של DMEM ללא פוספטים (prewarmed ל37 ° C) לכל צלחת 6 היטב של תאים לתווית.
      1. לדוגמא, לתאי תווית בכל הבארות של צלחת 6 היטב, להכין 12.6 מיליליטר בינוני (= 6 x 2.1). זה הוא לספק ל2 בינוני מיליליטר כדי לשמש לכל גם צלחת 6 היטב של תאים עם עודף של 5% בנפח.
    3. רד סמל הכן את הספסל שבניסויים בקרינה מייננת יבוצעו. מקום העבודה הוא מכוסה על ידי מחצלת לשפוך עליו אניה המגנה של חומר סופג ממוקמת. במקרה שאתם משתמשים בתוחם עם משטח אחד עמיד למים, למקם אותו בצד עד הסופג.
    4. רד סמל גם לספק לצנצנת פרספקס במקום העבודה ובמקום הצינור של מדיום נטול פוספט בזה.
    5. רד סמל קח את המכל מרופד ההובלה בבקבוקון של 32 orthophosphate P שכותרתו מהמקרר ולהביא אותו לספסל הרדיואקטיביות. לפקח על המכל לזיהום רדיואקטיבי חיצוני באמצעות מונה גייגר.
    6. רד סמל לדלל 32 orthophosphate P שכותרתו לתוך הצינור של DMEM ללא פוספטים בריכוז של 24 μCi / מיליליטר.
      1. הערה: ב2 מיליליטר לכל צלחת 6 היטב היטב של תאים, הדבר מקביל ל 5 μCi 32 P כותרת orthophosphate / 2 סנטימטר של תאים בתרבית.
      2. רד סמל לשמורהצינור בצנצנת פרספקס.
    7. רד סמל סגור את המכל עם שארית orthophosphate P כותרת 32 ולהחליף במקרר.
    8. רד סמל הסר את 6 צלחות היטב עם תאים שכותרתו מהחממה והמקום על ספסל הרדיואקטיביות.
    9. רד סמל הסר supernatant הבינוני וזורק. הוסף 2 מיליליטר של המדיום נטול פוספט המכיל 32 P הכותרת / טוב orthophosphate.
    10. רד סמל מקם את צלחות התרבות לתוך תיבת פרספקס לאחר מכן לעקוב אחר מיכל עבורr זיהום רדיואקטיבי חיצוני באמצעות מונה גייגר.
    11. רד סמל העבר את תיבת פרספקס עם תאים לתא חממת אוקריוטים מוקדשת לתיוג מטבולית איזוטופי.
    12. רד סמל דגירה של 1-20 שעות ב 37 ° C ב 5% CO 2.
      1. באופן כללי, זמן שילוב של 3 שעות או יותר מומלץ. זמן הדגירה האופטימלי ניתן להעריך באמצעות ניסויים כמובן זמן לכל חלבון מסוים בהתאם לצורך.
    13. רד סמל אופציונאלי: טיפול בתאים עם מתחם.
      1. בניסויים עם טיפול מורכב (כגון מעכבי קינאז), צעד טיפול מתחם כלול לאחר בitial זמן דגירה מבלי מתחם כדי לאפשר לתיוג. לאחר זמן דגירה הרצוי, תיבת פרספקס המכילה את צלחות התרבות יוסרו מן החממה, והביאה לספסל הרדיואקטיביות.
      2. רד סמל בינוני תיוג יוסר והוחלף על ידי בינוני פוספט prewarmed החופשי לתוך שהמתחם הוא מדולל בריכוז הרצוי. בטל בינוני בצינור 50 מיליליטר לאיסוף פסולת אשר ממוקם בצנצנת פרספקס.
      3. רד סמל תאים מוחלפים בתיבת פרספקס והניחו בתא החממה בפעם איש הקשר הרצוי.
  3. רד סמל לאסוף lysates של Labeתאים הובילו.
    1. רד סמל הסר בינוני מהתאים וזורקים לתוך צינור האיסוף פסולת אשר ממוקם בצנצנת פרספקס.
    2. רד סמל יש לשטוף את תאי 2X עם TBS הקר כקרח (טריס 50 מ"מ, NaCl 150 מ"מ, pH 7.4, 2 מיליליטר / שטיפה), השלכת פתרון שטיפה לתוך צינור איסוף פסולת הוצב בצנצנת פרספקס.
    3. רד סמל הוסף 0.5 מיליליטר של immunoprecipitation הקרח הקרה מאגר תמוגה (IP) זה טוב ולאסוף lysate ידי pipetting lysate למעלה ולמטה על מנת לשחרר את כל תאי lysed.
      1. הכן את הנפח הנדרש של חיץ תמוגה IP (0.5 מיליליטר / מדגם בתוספת עודף של 5%) מבעוד מועד, והוסיף קוקטייל מעכב פרוטאז ו phosphataseקוקטייל מעכב טרי רק לפני השימוש.
      2. הרכב מאגר תמוגה הוא טריס pH 20 מ"מ 7.5, NaCl 150 מ"מ, EDTA 1 מ"מ, טריטון 1%, גליצרול 10%, מעכבי פרוטאז קוקטייל וקוקטייל מעכב phosphatase.
    4. רד סמל העבר את lysate לצינור microcentrifuge ולדגור על קרח במשך לפחות 10 דקות.
    5. רד סמל צנטריפוגה lysates microcentrifuge ב> XG 5,000 10 דקות.
    6. רד סמל השלך פסולת רדיואקטיבית בפחי אשפה ייעודית אשר מאוחסנים מאחורי מגיני פרספקס.

2. נתח את התיוג של חלבונים של עניין

  1. רד סמל בודד חלבון של עניין על ידי immunopurification (IP).
    1. רד סמל העברת צינורות microcentrifuge עם lysates centrifuged חזרה לקרח ופיפטה את supernatant לתוך צינור המכיל microcentrifuge 10 μl מיטת נפח של חרוזים agarose הדגל-M2 equilibrated.
      1. הכן את הצינורות עם חרוזים agarose הדגל-M2 equilibrated לפני הזמן.
      2. לשם כך, פיפטה בנפח של slurry agarose הדגל-M2 המתאים ל10 μl מיטת נפח לדגימה בתוספת עודפת של 5%.
        1. באופן כללי, 10 μl מיטת נפח של חרוזים מתאים ל20 slurry μl. עיין בגיליון הנתונים של המוצר לקבלת פרטים נוספים.
      3. לאזן את חרוזים על ידי שטיפת 3x ב10 כרכים (יחסית למיטה נפח) של חיץ תמוגה ה-IP.
      4. הפיצו חרוזים equilibrated באופן שווה ב10 מיטת נפח / צינור μl לתוך צינורות רבים כמו שיש דוגמאות. תווית הצינורות עם מזהה עבור כל דגימה.
    2. רד סמל העברת צינורות microcentrifuge 50 צינורות מיליליטר (כ -6 צינור מיליליטר tubes/50 microcentrifuge) שכותרתו עם סמל תלתן רדיואקטיבי ולשמור על קרח.
    3. רד סמל העברת דגימות למכשיר מסתובב מאחורי מגן פרספקס באזור המיועד של חדר קר מקצה אל קצה ערבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך 1-20 שעות.
    4. רד סמל העברת הדגימות למקום עבודה ייעודית על קרח.
    5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> ספין למטה החלבון קשור חרוזים agarose הדגל-M2 בmicrocentrifuge (XG 1,000, 1 דקות) וזורקים supernatant לתוך צינור איסוף פסולת.
    6. רד סמל שטוף את חרוזי agarose חלבון קשור הדגל-M2 על ידי resuspending במאגר לשטוף מיליליטר IP 1.
      1. הרכב של חיץ לשטוף IP: טריס 25 pH מ"מ 7.5, NaCl 400 מ"מ, טריטון 1%. מומלץ לכלול גם מעכבי פרוטאז ו phosphatase בחיץ לשטוף לחלבונים רגישים לפירוק על ידי פרוטאזות שיתוף טיהור או לdephosphorylation ידי phosphatases שיתוף טיהור.
      2. רד סמל ספין למטה חרוזים החלבון קשור הדגל-M2 agarose בmicrocentrifuge (XG 1,000, 1 דקות) וזורקים supernatant לתוך קולקטיבית פסולתצינור tion.
      3. רד סמל חזור על השלב לשטוף 3x.
    7. רד סמל לאחר שטיפה, resuspend את החרוזים לחיץ לשטוף מיליליטר IP 1 (טריס 25 pH מ"מ 7.5, MgCl 2 10 מ"מ, dithiothreitol (DTT) 2 מ"מ, טריטון 0.02%, בטא glycerophosphate 5 מ"מ, Na 3 VO 4 0.1 מ"מ).
    8. רד סמל ספין למטה חרוזים החלבון קשורים הדגל-M2 agarose בmicrocentrifuge (XG 1,000, 1 דקות) וזורקים supernatant לתוך צינור איסוף פסולת. הסר את כל החיץ העודף.
    9. רד סמל חרוזים resuspend ל40 & mu; ליטר של חיץ מדגם SDS טעינת ה-IP (טריס-HCl 160 מ"מ pH 6.8, SDS 2%, DTT 0.2 M, 40% גליצרול, 2 מ"ג / מיליליטר כחול bromophenol).
      1. ניתן לנתח דגימות באופן מיידי או מאוחסנות ב-20 ° C מקפיא לניתוח נסתר.
        1. רד סמל לאחסון של דגימות ב -20 דגימות C °, מקום במחזיקי צינור או תיבות בקופסא של פרספקס במקפיא שכותרתו רדיואקטיבית סמל תלתן המוקדש לאחסון של דגימות רדיואקטיבי.
    10. רד סמל השלך פסולת רדיואקטיבית בפחי אשפה ייעודית אשר מאוחסנים מאחורי מגיני פרספקס.
  2. רד סמל לפתור דגימות ה-IP באמצעות SDS-PAGE וbloלא קרום PVDF.
    1. רד סמל דגימות מחמם בחיץ טעינה ל-C ° 95 למשך 2 דקות ו צנטריפוגות 1 דקות ב> 1,000 XG כדי גלולה את החרוזים.
    2. רד סמל הכן את מודול ג'ל אלקטרופורזה החלבון על ספסל הרדיואקטיביות מאחורי מסך פרספקס.
    3. רד סמל דגימות עומס על ג'לי-SDS טריס יצטט 3-8%.
      1. סוג זה של ג'ל מתאים לפתרון במשקל מולקולרי גבוה (HMW) חלבונים. סוגים אחרים ג'ל גם יכולים להיות מתאימים, כגון 4-20% ג'ל Bis-tricine או ג'לי 4-20% טריס-גליצין.
      2. כולל סמן משקל מולקולרי אשר מתאים להבחין בגדלים של חלבוני HMW.
      4. <li> רד סמל לבצע אלקטרופורזה ב150 V במשך שעה 1.
    4. רד סמל לאחר אלקטרופורזה, להסיר את הג'ל ממעטפת הפלסטיק שלה ולהעביר את הג'ל למכל עם חיץ העברה מערבי סופג.
      1. הרכב של חיץ העברה מערבי סופג: טריס 50 מ"מ, גליצין 40 מ"מ, SDS 0.04%, מתנול 20%.
      2. רד סמל חותכים את החלקים של ג'ל שיבלוט כגון מפרידים היטב וחלק תחתון של ג'ל שבולט.
    5. קרום להכין פלואוריד polyvinylidene אחד (PVDF) לג'ל על ידי הטבילה במתנול דקות 1, ואז למקם את חיץ העברה.
      1. קרומים נחתכים לים גודל Ame כמו ג'ל בתוספת מרווח של 3 מ"מ.
    6. הנח מודול סופג חצי יבש על ספסל הרדיואקטיביות ולהסיר את הכיסוי וצלחת אלקטרודה עליונה.
    7. רד סמל הכן את הכריך סופג על פני השטח של המודול סופג חצי היבש.
      1. הרטב עבה במיוחד (2.5 מ"מ עובי, 7.5 x 10 סנטימטר גדול) סופג מסנן במאגר העברה ומניחים על צלחת תחתונה של מודול הסופג.
      2. רד סמל מניחים את קרום PVDF מראש רטוב על המסנן הסופג.
      3. רד סמל בזהירות להניח את הג'ל על קרום PVDF ולהסיר כל בועות אוויר.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> השלם את כריך הכתם על ידי הרטבת מסנן סופג עבה נוסף במאגר העברה ומניחים על הצלחת התחתונה של מודול הסופג. הסר את כל האוויר בועות סופו של דבר בהווה בכריך הסופג.
        שים לב שהתיאור שניתן כאן הוא תואם את מערכת SD טרנס כתם BioRad בי אלקטרודות הן כאלה שחלבונים נודדים כלפי מטה על הממברנה. מערכות סופגות אחרות הן גם תואמים את השלבים הבאים בעיבודים קלים כגון אלו הנדרשים סופו של דבר לקחת בחשבון עוד כיוון סופג או, במקרה של סופג טנק, פסולת נוזלית נוספת כדי להיות מסולקים באותה הצורה כמו חיץ אלקטרופורזה לעיל.
    8. רד סמל הסר את כל עודפי החיץ עם רקמה סופגת ומניח את הצלחת העליונה וכיסוי של חצי ד ר"י סופג מודול.
    9. רד סמל העבר את החלבונים ב15 V עבור 1-2 שעות.
    10. רד סמל במהלך הזמן הזה, לנקות את מודול אלקטרופורזה.
      1. רד סמל השלך פסולת רדיואקטיבית בפחי אשפה ייעודית אשר מאוחסנים מאחורי מגיני פרספקס.
      2. רד סמל יש לשטוף את מודול אלקטרופורזה עם מים מזוקקים (לספירה) וזורקים את מי שטיפה במכל פסולת הנוזלי רדיואקטיבי.
    11. 0523/50523rad1.jpg "/> לאחר העברה, להסיר את קרום PVDF עם חלבונים מוספגים ממודול הסופג.
    12. רד סמל אופציונאלי: לבצע צביעת Ponceau S של חלבונים מחקו לדמיין חלבונים.
      1. רד סמל העבר את הכתם לכלי דגירה כתם רדוד המכיל פתרון Ponceau S ו דגירה במשך 5 דקות.
      2. רד סמל יש לשטוף 2x במהירות בספירה.
    13. רד סמל ייבש את הממברנה.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> בצע autoradiography.
    1. רד סמל לחשוף את הקרום לצלחת זרחנית ל1-5 ימים.
    2. רד סמל קראו 32P הנחה של הצלחת זרחנית נחשפה באמצעות סורק זרחני סטורם 840 או שווה ערך ולשמור את התמונה כקובץ TIFF ברזולוציה גבוהה.
  4. רד סמל זיהוי רמות חלבון באמצעות immunodetection.
    1. רד סמל רעננותם ממברנות על ידי טבילתם בקצרה למתנול, ולאחר מכן להעביר לכלי דגירה כתם רדוד עם PBS. רד סמל לחסום את הקרומים ב-PBS-T (PBS עם 0.1% Triton) המכיל 5% חלב.
    2. רד סמל דגירה הכתמים עם 13,16 אנטי LRRK2 נוגדנים או נוגדני דגל אנטי ותהליך נוסף עם צעדים לשטוף מתאימים ודגירת נוגדנים משני.
    3. רד סמל לבצע זיהוי chemiluminescence כדי לאשר את רמות החלבון היחסית של LRRK2.
  5. לכמת שילוב של 32 P בLRRK2.
    1. ביצוע ניתוח densitometric של הלהקות בautoradiograms הכתם וimmunoreactivity באמצעות תוכנה מתאימה כמו תוכנת ImageJ, תכנית זמינה תוכנה חופשית במוסד 'הלאומיאוטי של אתר בריאות (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
    2. חישוב רמות התאגדות פוספט כיחס בין אות autoradiographic מעל רמת immunoreactivity.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

על מנת להשוות רמות זירחון הכוללות של LRRK1 וLRRK2 בתאים, 3xflag מתויג LRRK1 וLRRK2 בא לידי ביטוי בתאי HEK293T 15. תאים בתרבית 6 צלחות היטב ומסומן עם 32 P ונותחו כפי שתוארו לעיל בטקסט הפרוטוקול. איור 1 מציג תוצאות נציג לתיוג המטבולית של LRRK1 וLRRK2 בתאי HEK293T. התאגדות פוספט רדיואקטיבי הוא ציינה עבור שתי LRRK1 וLRRK2. על כימות של הרמות מנורמלות לרמות החלבון, כפי שנמדד על ידי ניתוח densitometric של immunodetection עם נוגדן אנטי דגל 32 P, נמצא כי הייתה לי LRRK1 רמת זירחון ממוצעת שהוא נמוך יותר LRRK2 בתנאים שנבדקו, אם כי מובהקות סטטיסטיות היא לא הגיע (P> 0.05).

"/> 1.jpg
איור 1. תיוג מטבולית של LRRK1 וLRRK2. א LRRK1 וLRRK2 מתבטאים בתאי HEK293T תויגו מטבולית עם 32 P כפי שתואר בפרוטוקול ותוצאות סעיפים. מתוארים כאן הם autoradiograms נציג (פנל עליון) של התאגדות 32 P כמו גם כתמי נציג מערביים (פנל תחתון) של LRRK1 וזיהוי LRRK2 באמצעות תגי 3xflag. ב כימות של תיוג מטבולית ההשוואתי של LRRK1 וLRRK2 (N = 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מספק פרוטוקול בסיסי למנסה לאמוד רמת זירחון הכללית של LRRK1 וLRRK2 בשורות תאים באמצעות תיוג חילוף חומרים עם 32 P-orthophosphate. האסטרטגיה הכוללת היא פשוטה. זיקה מתויגת חלבוני LRRK באים לידי ביטוי בתאי HEK293T החשופים למדיום המכיל 32 P-orthophosphate. 32 P-orthophosphate נטמע על ידי התאים רק לאחר כמה שעות של דגירה וכל המולקולות בתא המכיל פוספטים מסומנים ובכך רדיואקטיבית. תג הזיקה (3xflag) לאחר מכן נעשה שימוש כדי לבודד את חלבוני LRRK ממרכיבים תאיים אחרים על ידי immunoprecipitation. Immunoprecipitates אז מופרדים באמצעות SDS-PAGE, מחק לממברנות PVDF וניתוח של פוספטים המשולבים מתבצע על ידי autoradiography (אות 32 P) וזיהוי מערבי (אות חלבון) של החלבונים בכתמים. פרוטוקול זה הוא להבחין בין הפרוטוקול למדידת au LRRK2tophosphorylation 17 שבתיוג של LRRK1 או LRRK2 מתבצע בתרבית תאים ולא בתגובת זרחון במבחנה עם חלבונים מטוהרים.

יש לציין כי הפרוטוקול מפורט שהוצג כאן יכול להיות מותאם כדי להתאים למספר רב של וריאציות בהתאם לצרכי ניסוי. לדוגמא, כפי שהתיוג הוא יעיל במרבית שורות תאים במעבדה משותפות, פרוטוקול זה אינו מוגבל לשימוש בשורת תאי HEK293T. כמו כן, תגי זיקה אחרים עשויים לשמש כחלופה ל3xflag, כגון HA, myc, V5, GFP או תגים אחרים יכול לשמש 18 מספר תגיות כמו לLRRK1 יעילות immunoprecipitate או LRRK2. במקרה נוגדנים ספציפי לחלבון זמין לחלבון שהוא מתאים לimmunoprecipitation, כפי שקורה ל11 LRRK2, זה יכול להיות מיושם גם כן. עם נוגדנים ספציפיים לחלבון כיתה immunoprecipitation, זה גם אפשרי לבצע תיוג המטבולית של LRRKחלבונים המתבטאים באופן אנדוגני בשורות תאים. במקרה של LRRK2, כמה נוגדנים חד שבטיים תוארו בי immunoprecipitation פחית LRRK2 אנדוגני 19. לבסוף, פרוטוקול התיוג מטבולים, שתואר כאן לLRRK1 וLRRK2 יכול גם להיות מותאם לכל חלבון אחר אשר ניתן immunoprecipitated משורות תאים באמצעות האסטרטגיה הכללית שתוארה לעיל.

שיקול מרכזי לפני ביצוע תיוג חילוף חומרים של חלבונים בתא התרבות הוא איך טכניקה זו משווה לשיטות אחרות זמינות כדי לקבוע זירחון חלבון התאי. לדוגמא, זירחון באתרים ספציפיים יכול להיות פיקוח על ידי immunoblotting באמצעות נוגדן phospho הספציפי. שיטה זו כדלקמן צעדים דומים לאלה שתוארו כאן, למעט צעדי תיוג איזוטופי, ומסיבה זו, בטכניקה זו לעתים קרובות העדיפה על פני סימון מטבולים עם 32 P-orthophosphate כאשר הוא זמין. תיוג מטבולית עם 32 P-orthophosphate מספק אות שהוא נציג של מדינת זירחון הכוללת של החלבון, ולכן זה לא יכול לספק מידע על זירחון של אתרים ספציפיים. לחלבונים עם אתרי זרחון מרובים, כפי שהוא במקרה של LRRK2 10,11, טכניקת תיוג חילוף חומרים מספקת הערכת צעד אחד של רמת זירחון הכוללת אשר יכול הובררה עם נוגדני phospho הספציפי התלויים ועומדים רק צעדי immunodetection מרובים. לדוגמא, LRRK2 פוספורילציה מאוד באזור interdomain ANK-LRR, כלומר S910/S935/S955/S973 11,20 אתרים, כמו גם באזורים האחרים 10 כולל אתר S1292 מתאפיין לאחרונה 21. על מנת לנתח את התפקידים של phosphosites הבודד, מומלץ להעדיף ניסויים עם נוגדנים ספציפיים phosphosite. לדוגמא phosphosite נוגדנים ספציפיים אפשרו להבחין שphosphosites S910/S935/S955/S973 הוא dephosphorylateד בכמה מוטציות פתוגניים כגון R1441C / G, Y1699C, I2020T, אבל לא בG2019S 11,22, ואילו צורות מוטציה המחלה LRRK2 בדרך כלל מראות רמות phospho-S1292 גבוהות 21. עם זאת, תיוג חילוף חומרים שימושי למספר מחקרים האחרים של זירחון הסלולרי. תיוג מטבולית הוא תמיד טכניקה ישימה למשל במקרים של אתרי זירחון לא ידועים, או כאשר phospho-נוגדנים אינם זמינים או בעלי רגישות נמוכה. לבסוף, תיוג חילוף חומרים מאפשר השוואת רמות זירחון הכוללות של חלבונים שונים (כפי שמוצג כאן השוואת רמות זירחון הסלולריות של LRRK1 וLRRK2, איור 1), השוואה שהוא אתגר לעשות עם נוגדני phosphosite הספציפי נתון הבדלים ברגישות מנוגדן אחד למשנו .

לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי מאפשר הערכה יעילה של רמות זירחון הכוללות של חלבוני LRRK בתאים. הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם כדי לפקחזירחון של כל חלבון אחר שיכול לבוא לידי ביטוי בתאים ומבודד על ידי immunoprecipitation. שימוש בפרוטוקול זה מומלץ כאשר נוגדני phosphosite הספציפי אינם זמינים לחלבון במחקר או כצעד באימותיהם. פרוטוקול זה שימושי במיוחד כאשר מטרת הניסוי היא להשוות זירחון הכולל של 2 או יותר חלבונים שונים כמו השוואות כאלה באמצעות תיוג מטבולית אינם מוטים על ידי הבדלים ברגישות של זיהוי של זירחון מחלבון אחד למשנו. במיוחד עבור LRRK1 וLRRK2, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לפקח יחסית שינויים בפעילות תלויים בזירחון של LRRK1 וLRRK2, בהתחשב בכך ששינויים כאלה החלו להיות מתוארים לLRRK2 11,13,23, בעוד הרגולציה זירחון LRRK1 הוא הבין היטב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש מחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים גם למייקל ג'יי פוקס קרן תמיכה במחקר זה. אנו מודים לקרן המחקר - פלנדריה FWO (פרויקט FWO G.0666.09, מלגת חוקר בכירה לJMT), Neuro-TARGET פרויקט IWT SBO/80020, לובן KU (OT/08/052A וIOF-KP/07 / 001) על תמיכתם. מחקר זה נתמך גם בחלקו על ידי קרן Druwé-Eerdekens מנוהל על ידי קרן המלך בודואן לJMT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water Perkin Elmer NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11971-025 This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel Sigma A2220 For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter Bio-Rad 1703965
Ponceau S solution Sigma P7170

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158 (2011).
  2. Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
  3. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
  4. Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
  5. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
  6. Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
  7. Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
  8. Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
  9. Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
  10. Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
  11. Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
  12. Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
  13. Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
  14. Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
  15. Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472 (2012).
  16. Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
  17. Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. , (2012).
  18. Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).
  19. Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. , (2013).
  20. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
  21. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).
  22. Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease. PLoS One. 6, e17153 (2011).
  23. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 79 ביולוגיה (כללית) ביוכימיה הנדסה גנטית (כללית) LRRK1 LRRK2 תיוג מטבולית orthophosphate 32P immunoprecipitation autoradiography
מטבולית תיוג של אוצין עשיר חזור קינאזות 1 ו -2 עם רדיואקטיבי פוספט
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, … More

Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, V. Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate. J. Vis. Exp. (79), e50523, doi:10.3791/50523 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter