Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Metabole Labeling van leucine rich repeat Kinasen 1 en 2 met radioactieve fosfaat

Published: September 18, 2013 doi: 10.3791/50523
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven and Leuven Institute for Neuroscience and Disease (LIND)

Summary

Leucine rich repeat kinases 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn multidomain eiwitten die zowel GTPase en kinase domeinen coderen en die gefosforyleerd zijn in cellen. Hier presenteren we een protocol om LRRK1 en LRRK2 label in cellen met 32p orthofosfaat, waardoor een middel om hun algemene cellulaire fosforylering te meten.

Abstract

Leucine rich repeat kinases 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn paralogen die eenzelfde domein organisatie delen, waaronder een serine-threonine kinase domein, een Ras van complexe eiwitten domein (ROC), een C-terminale domein van ROC (COR), en leucine-rijke en ankyrine-achtige herhalingen in de N-terminus. De precieze cellulaire rol van LRRK2 LRRK1 en moeten nog worden opgehelderd, maar LRRK1 is betrokken bij tyrosine kinase receptor signalisatie 1,2, terwijl LRRK2 is betrokken bij de pathogenese van de ziekte van Parkinson 3,4. In dit rapport presenteren we een protocol bij de LRRK1 en LRRK2 eiwitten te labelen in cellen met 32p orthofosfaat, waardoor een middel om de algemene fosforylering niveaus van deze 2 eiwitten in cellen te meten. Kortom, affiniteit gelabeld LRRK eiwitten worden uitgedrukt in HEK293T cellen die zijn blootgesteld aan medium met 32P-orthofosfaat. De 32P-orthofosfaat wordt opgenomen door de cellen na enkeleuur incubatie en alle moleculen in de cel met fosfaten daardoor radioactief gelabeld. Via de affiniteit tag (3xflag) de LRRK eiwitten worden geïsoleerd van andere cellulaire componenten door immunoprecipitatie. Immunoprecipitaten worden dan gescheiden via SDS-PAGE, geblot op PVDF membranen en analyse van de opgenomen fosfaten wordt uitgevoerd door autoradiografie (32 P-signaal) en Western detectie (eiwit-signaal) van de eiwitten op de blots. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan fosforylering van andere eiwitten die tot expressie worden gebracht in cellen en geïsoleerd door immunoprecipitatie controleren.

Introduction

Leucine rich repeat kinasen 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn multidomein paralogen die een soortgelijke domeinnaam organisatie delen. Beide eiwitten coderen een GTPase sequentie verwant aan de familie van Ras GTPases (Ras van complexe eiwitten, of ROC) en een C-terminale domein van ROC (COR), effectief classificeren beide eiwitten aan de ROCO eiwitfamilie 5,6. N-terminus van de ROC-COR domein tandem, beide eiwitten coderen een leucine-rich repeat domein en een ankyrine-achtige domein, terwijl slechts LRRK2 codeert extra armadillo domein 6-8. C-terminus van ROC-COR, beide eiwitten delen een serine-threonine kinase domein terwijl slechts LRRK2 codeert voor een WD40 domein in het C-terminale gebied 8. De precieze cellulaire rol van LRRK2 LRRK1 en moeten nog worden opgehelderd, maar LRRK1 is betrokken bij tyrosine kinase receptor signalisatie 1,2, terwijl genetische gegevens wijzen op een rol voor LRRK2 in de pathogenese van de ziekte van Parkinson 3,4.

9-11. Hoewel LRRK1 cellulaire fosforyleringsplaatsen zijn nog niet in kaart gebracht, gegevens uit studies met fosfoproteïne kleuring van blots van immunologisch LRRK1 eiwit van COS7 cellen suggereert dat LRRK1 eiwit is gefosforyleerd in cellen 12.

Dit document biedt een fundamentele protocol voor het testen van algemene fosforylering niveau van LRRK1 en LRRK2 in cellijnen met behulp van metabole labeling met 32 P-orthofosfaat. De algemene strategie is eenvoudig. Affiniteit tagged LRRK proteins worden uitgedrukt in HEK293T cellen die blootgesteld aan medium met 32P-orthofosfaat. De 32P-orthofosfaat wordt opgenomen door de cellen na enkele uren incubatie en alle moleculen in de cel met fosfaten daardoor radioactief gelabeld. De affiniteit tag (3xflag) wordt vervolgens gebruikt om de LRRK eiwitten van andere cellulaire componenten te isoleren door immunoprecipitatie. Immunoprecipitaten worden dan gescheiden via SDS-PAGE, geblot op PVDF membranen en analyse van de opgenomen fosfaten wordt uitgevoerd door autoradiografie (32 P-signaal) en Western detectie (eiwit-signaal) van de eiwitten op de blots.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het huidige protocol gebruikt radioactieve 32P gemerkt orthofosfaat om cellulaire fosforylering van LRRK2 volgen. Het is belangrijk om in gedachten te houden dat alle handelingen met radioactieve reagentia moeten worden uitgevoerd met behulp van adequate beschermende maatregelen om blootstelling van radioactieve straling aan de exploitant en het milieu te minimaliseren. Verbindingen die isotopen die ioniserende straling uitzenden kan schadelijk zijn voor de menselijke gezondheid en strenge regels van toestemming en regelgeving op institutioneel en nationaal niveau controle het gebruik ervan. De experimenten in dit protocol werden uitgevoerd na een opleiding in de open gebruik stralingsbron aan de Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven) en na de goede richtlijnen van de gezondheid, veiligheid en milieu-afdeling van het universitair laboratorium praktijk. Verschillende stappen in ons protocol worden op grote schaal ingezet, zoals celkweek, SDS-PAGE, western blotting en gezien hier zijn de details van het protocol zoals toegepast in ons laboratorium. Het ishould worden opgemerkt dat de precieze experimentele omstandigheden variëren van laboratorium tot laboratorium, daarom specifieke maatregelen om de correcte afhandeling van de radioactieve stof moeten worden aangepast aan elke nieuwe laboratorium setting.

Gebruik van open source-straling is de voorafgaande goedkeuring van de regelgevende instantie die verantwoordelijk is voor open source-straling in het laboratorium onderzoek varieert van land tot land. Gebruikers moeten hun institutionele straling veiligheidsfunctionaris te raadplegen om ervoor te zorgen dat de procedure voldoen aan de plaatselijke regels en voorschriften. Informatie over regelgevende instanties kan worden gevonden: in België, het Federaal Agentschap voor Nucleaire Controle ( http://www.fanc.fgov.be , website in het Frans of Nederlands), in het Verenigd Koninkrijk, de Health and Safety Executive ( http: / / www.hse.gov.uk / straling / ioniserende / index.htm ), in de Verenigde Staten de NucLear Regulatory Commission ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ), in Canada de Canadese Commissie voor nucleaire veiligheid ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), en in Duitsland Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Veiligheidsmaatregelen om dit protocol relevant zijn opgemerkt in de tekst gemarkeerd met de radioactieve klaversymbool ( Rad Symbool ).

1. Metabole Labeling van Cellen

  1. Bereid cellen voor etikettering.
    1. Cultuur HEK293T cellijnen volgens standaard kweekcondities (37 ° C, 5% CO2) in DMEM met 8% foetaal kalfsserum en gentamycine.
    2. Expand cellen voldoende omverkrijgen van ten minste 1 x 10 6 cellen per monster te testen.
    3. Trypsinize cellen en plaat uit in 6 well platen (35 mm diameter) op 10 6 cellen / well.
    4. 24 uur na plating cellen, brengen 3xflag-LRRK2 eiwit via transfectie of lentivirale vector bemiddelde transductie.
      1. Voor transfectie mix per monster 4 ug DNA (pCHMWS-3xflag-LRRK2 plasmide 13-15 of pCHMWS-3xflag-LRRK1 plasmide 15) en 8 pi lineair polyethyleenimine (PEI lineair, 1 mg / ml) in 80 pl DMEM (zonder toevoegingen ). Laat complexe 15-30 min voeg complex aan cellen door goed mengen in medium aanwezig.
      2. Voor lentivirale vector bemiddelde transductie, verdunnen lentivirale vector die codeert 3xflag-LRRK1 of -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, als vuistregel, transduceren met twee keer zoveel overdrachtselement eenheden, dwz het aantal functionele vector deeltjes, van lentivector aangezien er cellen) in het kweekmedium. Een beschrijving van het product ion van LV-3xflag-LRRK1 / 2 is eerder beschreven 15.
    5. Wanneer cellen 80-100% confluent (ongeveer 48 uur na transfectie of transductie), spoel cellen met voorverwarmde (37 ° C) DMEM zonder fosfaten.
  2. Label cellen met 32P-ortho-fosfaat.
    1. Houd in gedachten algemene beginselen van de veiligheid bij het werken met straling.
      1. Rad Symbool Voer alle handelingen met 32p in een aangewezen gebied straling.
      2. Rad Symbool Geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen te worden gedragen - onder standaard procedure in ons laboratorium omvatten deze laboratoriumjas, dubbele handschoenen en een veiligheidsbril.
      3. g "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Alle werkzaamheden met 32P moet worden afgeschermd van gebruikers met 6 mm Perspex schermen om blootstelling te minimaliseren.
      4. Rad Symbool Persoonlijke monitoring devices moet altijd worden gebruikt - binnen KUL alle gecertificeerde open source straling gebruiker een film badge bevestigd aan de borstzak van de laboratoriumjas aan blootstelling aan straling te controleren tijdens experimenten draagt.
      5. Rad Symbool Alle experimentele oppervlakken worden gecontroleerd op radioactiviteit voor en na gebruik met een geigerteller.
      6. Rad Symbool Alle mogelijk besmet verbruiksartikelen dienen te worden vernietigd in strikte naleving van de institutionele richtlijnen voor ratief afval.
    2. Onder een laminaire stroming, bereid een Falcon buis met 2,1 ml DMEM zonder fosfaten (voorverwarmd tot 37 ° C) per 6-wells plaat van cellen te labelen.
      1. Bijvoorbeeld, om label cellen in ieder putje van een 6-well plaat, bereiden 12,6 ml medium (= 6 x 2.1). Dit is te voorzien in 2 ml medium wordt gebruikt per 6-wells plaat putje van cellen met een overmaat 5% in volume.
    3. Rad Symbool Bereid de bank waarmee de experimenten met ioniserende straling worden uitgevoerd. De werkruimte wordt gedekt door een lekkage mat waarop een beschermende voering van absorberend materiaal wordt geplaatst. In het geval u gebruik maakt van een liner met een waterdicht oppervlak, te plaatsen met de absorberende kant naar boven.
    4. Rad Symbool Ook voorzien ineen Perspex pot op de werkruimte en plaats de binnenband van fosfaatvrije medium in.
    5. Rad Symbool Neem de leiding gevoerd container met de flacon van 32 P gelabelde orthofosfaat uit de koelkast en breng het naar de radioactiviteit bank. Bewaken van de container voor uitwendige radioactieve besmetting met behulp van een geigerteller.
    6. Rad Symbool Verdun 32 P gemerkt orthofosfaat in de buis DMEM zonder fosfaat bij een concentratie van 24 uCi / ml.
      1. Opmerking: bij 2 ml per 6-wells plaat putje van cellen, komt dit overeen met 5 uCi 32P gemerkt orthofosfaat / cm2 van gekweekte cellen.
      2. Rad Symbool Houdende buis in de Perspex pot.
    7. Rad Symbool Sluit de kolf met de rest van de 32 gemerkte orthofosfaat en vervangen in de koelkast.
    8. Rad Symbool De 6-well platen met cellen uit de incubator en plaats op de radioactiviteit bank te worden aangebracht.
    9. Rad Symbool Verwijder medium supernatant af en gooi. Voeg 2 ml fosfaatvrije medium dat 32 P gemerkt orthofosfaat / putje.
    10. Rad Symbool Plaats de cultuur platen in een plexiglas doos vervolgens de container fo bewakenr uitwendige radioactieve besmetting met behulp van een geigerteller.
    11. Rad Symbool Breng de perspex doos met cellen van een eukaryotische cel incubator gewijd aan isotopische metabolisch merken.
    12. Rad Symbool Incubeer gedurende 1-20 uur bij 37 ° C in 5% CO2.
      1. In het algemeen wordt een opname van 3 uur of meer geadviseerd. De optimale incubatietijd kan worden beoordeeld door de tijd natuurlijk experimenten voor elke specifieke eiwit zoals gewenst.
    13. Rad Symbool Optioneel: cellen te behandelen met verbinding.
      1. In experimenten met behandeling met verbinding (bijvoorbeeld een kinase remmer), is een verbinding behandelingsstap opgenomen, na eenvrijwaart de oorspronkelijke incubatietijd zonder verbinding te houden met de etikettering. Na de gewenste incubatietijd, het vak Perspex met de kweekplaten worden uit de incubator verwijderd en de radioactiviteit bank gebracht.
      2. Rad Symbool Labeling medium verwijderd en vervangen door voorverwarmd fosfaat vrij medium waarin de verbinding wordt verdund tot de gewenste concentratie. Gooi medium in een 50 ml buis voor afvalinzameling die wordt geplaatst in de Perspex pot.
      3. Rad Symbool Cellen worden vervangen in het vak perspex en geplaatst in de cel incubator voor de gewenste contacttijd.
  3. Rad Symbool Verzamel lysaten van Labeled cellen.
    1. Rad Symbool Verwijder medium uit cellen en gooi in de afvalinzameling buis die is geplaatst in de Perspex pot.
    2. Rad Symbool Rinse cellen 2x met ijskoude TBS (Tris 50 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4, 2 ml / spoelen), waarbij spoeling oplossing in een verzameling afval buis in de Perspex pot.
    3. Rad Symbool Voeg 0,5 ml ijskoud immunoprecipitatie (IP) lysebuffer aan elk putje en verzamel lysaat door pipetteren lysaat op en neer om alle gelyseerde cellen los te maken.
      1. Bereid de vereiste volume IP lysebuffer (0,5 ml / monster plus 5% overmaat) van tevoren, het toevoegen van de proteaseremmercocktail en fosfataseremmer cocktail verse vlak voor gebruik.
      2. De samenstelling van de lysis buffer Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton 1%, glycerol 10%, proteaseremmer cocktail en fosfatase-inhibitor cocktail.
    4. Rad Symbool Breng het lysaat naar een microcentrifugebuis en incubeer op ijs gedurende ten minste 10 minuten.
    5. Rad Symbool Centrifugeer de lysaten in een microcentrifuge bij> 5000 xg gedurende 10 minuten.
    6. Rad Symbool Afvoeren van radioactief afval in daarvoor bestemde bakken die achter plexiglas schilden worden opgeslagen.

2. Analyseer Labeling van eiwitten van belang

  1. Rad Symbool Isoleer eiwit van belang door immuunzuivering (IP).
    1. Rad Symbool Breng de microcentrifugebuizen met gecentrifugeerd lysaten terug naar ijs en pipet de bovenstaande vloeistof in een microcentrifugebuis met 10 pl bed volume van evenwicht gebracht vlag-M2 agaroseparels.
      1. Bereid de buizen met geëquilibreerde vlag-M2 agaroseparels van tevoren.
      2. Hiervoor pipet een volume van vlag-M2 agarose slurry overeenkomt met 10 pl bed volume per monster plus een overmaat van 5%.
        1. Algemeen een 10 gl bedvolume van parels overeen met 20 pl suspensie. Raadpleeg de product data sheet voor meer informatie.
      3. Equilibreer de kralen door spoelen 3x in 10 volumes (ten opzichte van bed volume) van IP lysebuffer.
      4. Verdeel in evenwicht kralen gelijkmatig op 10 pl bed volume / buis in evenveel buizen als er monsters. Label de buizen met een identifier voor elk monster.
    2. Rad Symbool Breng de microcentrifugebuizen tot 50 ml buizen (ongeveer 6 microcentrifugebuisje tubes/50 ml tube) gelabeld met een radioactieve klaversymbool en blijf op ijs.
    3. Rad Symbool Transfer monsters naar een roterend apparaat achter een perspex schild in het aangewezen gebied van een koude ruimte voor over de kop mengen bij 4 ° C gedurende 1-20 uur.
    4. Rad Symbool Breng de monsters naar een aangewezen werkruimte op ijs.
    5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Spin down van het eiwit gebonden vlag-M2 agaroseparels in een microcentrifuge (1000 xg, 1 min) en de bovenstaande vloeistof in een verzameling afval buis.
    6. Rad Symbool Was de eiwitgebonden vlag-M2 agaroseparels door resuspenderen in 1 ml IP wasbuffer.
      1. Samenstelling van IP wasbuffer: Tris 25 mM pH 7,5, NaCl 400 mM, Triton 1%. Aanbevolen wordt ook protease en fosfatase remmers omvatten in wasbuffer voor eiwitten gevoelig zijn voor afbraak door proteasen medezuiverende of defosforylering door medezuiverende fosfatasen.
      2. Rad Symbool Spin down de eiwitgebonden vlag-M2 agaroseparels in een microcentrifuge (1000 xg, 1 min) en de bovenstaande vloeistof in een verspilling collectietie buis.
      3. Rad Symbool Herhaal de wasstap 3x.
    7. Rad Symbool Na het wassen, resuspendeer de kralen in 1 ml IP spoelbuffer (Tris 25 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM dithiothreitol (DTT) 2 mM, Triton 0.02%, beta-glycerofosfaat 5 mM, Na VO 3 4 0,1 mM).
    8. Rad Symbool Spin down het eiwit gebonden vlag-M2 agaroseparels in een microcentrifuge (1000 xg, 1 min) en de bovenstaande vloeistof in een verzameling afval buis. Verwijder alle overtollige buffer.
    9. Rad Symbool Resuspendeer kralen in 40 & mU, l IP monster SDS laadbuffer (Tris-HCl 160 mM pH 6,8, 2% SDS, 0,2 M DTT, 40% glycerol, broomfenolblauw 2 mg / ml).
      1. Monsters kunnen direct worden geanalyseerd of opgeslagen in een -20 ° C vriezer gedurende latere analyse.
        1. Rad Symbool Voor de opslag van monsters bij -20 ° C, plaats monsters buishouders of dozen in een perspex doos in een radioactief gemerkte klaversymbool diepvriezer bestemd voor opslag van radioactieve monsters.
    10. Rad Symbool Afvoeren van radioactief afval in daarvoor bestemde bakken die achter plexiglas schilden worden opgeslagen.
  2. Rad Symbool Resolve IP monsters via SDS-PAGE en blot op PVDF membraan.
    1. Rad Symbool Warmte monsters laadbuffer tot 95 ° C gedurende 2 minuten en centrifugeer gedurende 1 minuut bij> 1000 xg om de kralen pellet.
    2. Rad Symbool Bereid de eiwit gelelektroforese module op de radioactiviteit bankje achter een perspex scherm.
    3. Rad Symbool Samples op een 3-8% tris-acetaat SDS-PAGE gels.
      1. Dit type gel geschikt voor het oplossen van hoog molecuulgewicht (HMW) eiwitten. Andere gel vormen kunnen eveneens geschikt, zoals een 4-20% Bis-Tricine gel of Tris-glycine 4-20% gels.
      2. Voeg een molecuulgewicht merker die geschikt is om de grootte van HMW proteïnen herkennen.
      4. <li> Rad Symbool Voer elektroforese bij 150 V gedurende 1 uur.
    4. Rad Symbool Na elektroforese, verwijdert u de gel uit de plastic behuizing en breng de gel om een ​​container met Western blotting overdracht buffer.
      1. Samenstelling van Western blotting overdracht buffer: Tris 50 mM, 40 mM glycine, 0,04% SDS, 20% methanol.
      2. Rad Symbool Knip de delen van de gel die uitsteken zoals ook scheiders en onderste gedeelte van de gel die uitsteekt.
    5. Bereid een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan per gel door dompelen in methanol gedurende 1 min, daarna in transferbuffer.
      1. Membranen worden gesneden om de s ame grootte als de gel plus een marge van 3 mm.
    6. Plaats een semi-droge blotting module op de radioactiviteit bank en verwijder het deksel en de bovenste elektrode plaat.
    7. Rad Symbool Bereid de blotting sandwich op het oppervlak van de semi-droge blotting module.
      1. Bevochtig een extra dik (2,5 mm dik, 7,5 x 10 cm groot) deppen filter in overdrachtbuffer en plaats op bodemplaat van de blotting module.
      2. Rad Symbool Plaats het pre-natte PVDF membraan aan de blotting filter.
      3. Rad Symbool Plaats voorzichtig de gel op de PVDF-membraan en verwijder eventuele luchtbellen.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Maak de vlek sandwich door het bevochtigen van een extra dikke blotting filter in overdrachtbuffer en plaats op de bodemplaat van de blotting module. Verwijder alle lucht bubbels uiteindelijk in de blotting sandwich.
        Merk op dat de hier gegeven beschrijving is verenigbaar met de BioRad trans-blot SD systeem waarbij elektroden zodanig dat eiwitten migreren naar beneden op het membraan. Andere blotting systemen zijn ook compatibel met deze stappen met kleine aanpassingen zoals die uiteindelijk nodig om rekening te houden met andere blotting richting of, bij tank blotting, extra vloeibaar afval worden verwijderd op dezelfde wijze als de elektroforese buffer kiezen.
    8. Rad Symbool Verwijder alle overtollige buffer met een absorberende tissue en plaats de bovenplaat en de cover van de semi-d ry blotting module.
    9. Rad Symbool Transfer eiwitgehalte bij 15 V gedurende 1-2 uur.
    10. Rad Symbool Gedurende deze tijd, het schoonmaken van de elektroforese-module.
      1. Rad Symbool Afvoeren van radioactief afval in daarvoor bestemde bakken die achter plexiglas schilden worden opgeslagen.
      2. Rad Symbool Spoel de elektroforese-module met gedestilleerd water (AD) en het spoelwater weggooien in de vloeibaar radioactief afval container.
    11. 0523/50523rad1.jpg "/> Na overdracht, verwijder het PVDF membraan met geblotte eiwitten uit de blotting module.
    12. Rad Symbool Optioneel: voer een Ponceau S kleuring van uitgewist eiwitten om eiwitten te visualiseren.
      1. Rad Symbool Breng de vlek naar een ondiepe vlek incubatie vat met Ponceau S oplossing en incubeer gedurende 5 minuten.
      2. Rad Symbool Snel spoelen 2x in het jaar.
    13. Rad Symbool Droog het membraan.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Uitvoeren autoradiografie.
    1. Rad Symbool Expose de membraan een fosforescentie plaat voor 1-5 dagen.
    2. Rad Symbool Lees de 32P off van de blootgestelde fosforescentie plaat met behulp van een Storm 840 fosforescentie scanner of gelijkwaardig en het beeld opslaan als een hoge resolutie tiff.
  4. Rad Symbool Detecteren eiwit niveaus via immunodetectie.
    1. Rad Symbool Rehydrateren de membranen door dompelen ze kort in methanol en vervolgens over te dragen aan een ondiepe vlek incubatievaatje met PBS. Rad Symbool Blokkeer de membranen in PBS-T (PBS met 0,1% Triton) met 5% melk.
    2. Rad Symbool Incubeer de blots met anti-LRRK2 antilichaam 13,16 of anti vlag antilichaam en proces verder met de juiste wassen stappen en secundair antilichaam incubatie.
    3. Rad Symbool Voer chemiluminescentie detectie om de relatieve eiwitniveaus van LRRK2 bevestigen.
  5. Kwantificeren incorporatie van 32P in LRRK2.
    1. Voer densitometrische analyse van de banden op de vlek autoradiogrammen en immunologische met behulp van geschikte software zoals ImageJ software, een freeware programma beschikbaar op de National Instnotulen van Volksgezondheid website ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. Bereken fosfaatgehalte oprichting als de verhouding van de autoradiografische signaal over de immunologische niveau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om de algemene fosforylering niveaus van LRRK1 en LRRK2 vergelijken in cellen, 3xflag gelabeld LRRK1 en LRRK2 werden uitgedrukt in HEK293T cellen 15. Cellen werden gekweekt in 6-well platen en gemerkt met 32P en geanalyseerd zoals hiervoor in de tekst beschreven protocol. Figuur 1 geeft representatieve resultaten voor metabolisch merken van LRRK1 en LRRK2 in HEK293T cellen. Radioactief fosfaat opname wordt waargenomen voor zowel LRRK1 en LRRK2. Bij kwantificering van de 32 P niveaus genormaliseerd om het eiwitgehalte gemeten door densitometrische analyse van de immunodetectie met anti-flag-antilichaam werd vastgesteld dat LRRK1 een gemiddelde fosforylering niveau dat lager is dan LRRK2 onder de geteste omstandigheden, hoewel statistische significantie is niet bereikte (P> 0,05).

1.jpg "/>
Figuur 1. Metabole etikettering van LRRK1 en LRRK2. A. LRRK1 en LRRK2 uitgedrukt in HEK293T cellen werden metabolisch gemerkt met 32P, zoals beschreven in het protocol en de resultaten delen. Hier afgeschilderd zijn representatief autoradiogrammen (bovenste paneel) van de 32 P statuten evenals vertegenwoordiger Western blots (onderste panel) van LRRK1 en LRRK2 opsporen via hun 3xflag tags. B. Kwantificering van de vergelijkende metabolisch merken van LRRK1 en LRRK2 (N = 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit document biedt een fundamentele protocol voor het testen van algemene fosforylering niveau van LRRK1 en LRRK2 in cellijnen met behulp van metabole labeling met 32 P-orthofosfaat. De algemene strategie is eenvoudig. Affinity LRRK tagged eiwitten worden uitgedrukt in HEK293T cellen die zijn blootgesteld aan medium met 32P-orthofosfaat. De 32P-orthofosfaat wordt opgenomen door de cellen na enkele uren incubatie en alle moleculen in de cel met fosfaten daardoor radioactief gelabeld. De affiniteit tag (3xflag) wordt vervolgens gebruikt om de LRRK eiwitten van andere cellulaire componenten te isoleren door immunoprecipitatie. Immunoprecipitaten worden dan gescheiden via SDS-PAGE, geblot op PVDF membranen en analyse van de opgenomen fosfaten wordt uitgevoerd door autoradiografie (32 P-signaal) en Western detectie (eiwit-signaal) van de eiwitten op de blots. Dit protocol dient te worden onderscheiden van het protocol tot LRRK2 au metentophosphorylation 17 op het kenmerken van LRRK1 of LRRK2 uitgevoerd in celkweek in plaats van in een in vitro fosforylering reactie met gezuiverde eiwitten.

Opgemerkt wordt dat de hier gepresenteerde gedetailleerd protocol kan worden aangepast om geschikt voor meerdere variaties afhankelijk experimentele behoeften. Bijvoorbeeld, als etikettering efficiënt meest laboratorium cellijnen Dit protocol is niet beperkt tot het gebruik van de HEK293T cellijn. Ook kunnen andere affiniteitsmerkers worden gebruikt als alternatief voor 3xflag zoals HA, myc, V5, GFP of andere markeringen 18 als meerdere tags kunnen worden gebruikt om efficiënt immunologisch LRRK1 of LRRK2. Indien een eiwit-specifiek antilichaam beschikbaar is voor het eiwit dat geschikt is voor immunoprecipitatie, zoals het geval is voor LRRK2 11, kan deze ook worden toegepast. Met een immunoprecipitatie rang eiwit-specifiek antilichaam, is het ook mogelijk om metabolisch merken van LRRK voereneiwitten die endogeen tot expressie gebracht in cellijnen. Bij LRRK2 zijn verschillende monoklonale antilichamen beschreven die kan immunoprecipitatie van endogene LRRK2 19. Tenslotte kan de metabolische labeling protocol beschreven voor LRRK1 en LRRK2 ook worden aangepast aan andere eiwitten die kunnen worden geïmmunoprecipiteerd van cellijnen met de algemene hierboven beschreven strategie.

Een belangrijke overweging voor het uitvoeren van metabole kenmerken van eiwitten in celkweek is hoe deze techniek zich verhoudt tot andere methoden om een ​​cellulair eiwit fosforylering bepalen. Zo kan fosforylatie op specifieke locaties worden gevolgd door immunoblotting met een fosfo-specifiek antilichaam. Deze werkwijze volgt soortgelijke stappen die hier beschreven, zonder de isotopische labeling stappen, en daarom wordt deze techniek vaak de voorkeur boven metabolisch merken met 32P-orthofosfaat wanneer deze beschikbaar is. Metabolisch merken met 32P-orthofosfaat een signaal dat representatief is voor de totale fosforylatietoestand van het eiwit kan dus geen informatie over de fosforylatie van specifieke websites te leveren. Voor eiwitten met meerdere fosforyleringsplaatsen, zoals het geval is voor LRRK2 10,11, de metabolische labeling techniek geeft een stap beoordeling van de algemene fosforyleringsniveau die vastgesteld met fosfo-specifieke antilichamen alleen hangende immunodetectie meerdere stappen. Zo LRRK2 zeer gefosforyleerd in zijn ANK-LRR interdomein, nl. in de S910/S935/S955/S973 11,20 sites en in andere gebieden 10 waaronder de recentelijk kenmerk S1292 plaats 21. Om te ontleden uit de rol van individuele phosphosites, is het raadzaam om experimenten liever met phosphosite specifieke antilichamen. Bijvoorbeeld phosphosite specifieke antilichamen hebben toegestaan ​​om te onderscheiden dat de S910/S935/S955/S973 phosphosites zijn defosforylerend in verschillende pathogene mutanten zoals R1441C / G, Y1699C, I2020T, maar niet in de G2019S 11,22, terwijl ziekte LRRK2 mutante vormen vertonen algemeen hoger fosfo-S1292 niveau 21. Echter, metabolisch merken zijn nuttig voor een aantal andere studies van cellulaire fosforylering. Metabolisch merken is altijd een toepasbare techniek bijvoorbeeld in geval van onbekende fosforylatieplaatsen of als fosfo-antilichamen beschikbaar zijn, of van geringe gevoeligheid. Tenslotte metabolisch merken kan vergelijken algemeen fosforylering niveaus van verschillende eiwitten (zoals hier het vergelijken cellulaire fosforylering niveaus van LRRK1 en LRRK2, figuur 1), een vergelijking die een uitdaging om met phosphosite antilichamen gegeven verschillende gevoeligheden ve antilichaam aan elkaar .

Kortom, de onderhavige protocol maakt een efficiënte evaluatie van het algehele niveau van fosforylering LRRK proteïnen in cellen. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast bewakenfosforylering van andere eiwitten die tot expressie worden gebracht in cellen en geïsoleerd door immunoprecipitatie. Het gebruik van deze protocol wordt aangeraden als phosphosite-specifieke antilichamen zijn niet beschikbaar voor het eiwit in studie of als een stap in de validatie. Dit protocol is vooral nuttig wanneer het experimentele doel is het totale fosforylatie van 2 of meer verschillende eiwitten vergelijken als zodanig vergelijkingen via metabolisch merken worden niet beïnvloed door verschillen in gevoeligheid van detectie van fosforylatie van het ene naar het andere eiwit. Specifiek voor LRRK1 en LRRK2, kan deze techniek worden gebruikt om de activiteit afhankelijke veranderingen in de fosforylering van LRRK1 en LRRK2, gezien het feit dat dergelijke veranderingen zijn begonnen te worden beschreven voor LRRK2 11,13,23, terwijl LRRK1 fosforylering regelgeving slecht wordt begrepen relatief bewaken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We zijn ook dankbaar voor de Michael J. Fox Foundation ter ondersteuning van deze studie. Wij danken het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek - Vlaanderen FWO (FWO-project G.0666.09, senior onderzoeker fellowship aan JMT), het IWT SBO/80020 project Neuro-TARGET, de KU Leuven (OT/08/052A en IOF-KP/07 / 001) voor hun steun. Dit onderzoek werd mede ondersteund door het Fonds Druwe-Eerdekens beheerd door de Koning Boudewijnstichting om JMT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water Perkin Elmer NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11971-025 This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel Sigma A2220 For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter Bio-Rad 1703965
Ponceau S solution Sigma P7170

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158 (2011).
  2. Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
  3. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
  4. Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
  5. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
  6. Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
  7. Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
  8. Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
  9. Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
  10. Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
  11. Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
  12. Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
  13. Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
  14. Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
  15. Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472 (2012).
  16. Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
  17. Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. , (2012).
  18. Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).
  19. Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. , (2013).
  20. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
  21. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).
  22. Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease. PLoS One. 6, e17153 (2011).
  23. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).

Tags

Cellular Biology biologie (algemeen) biochemie bio-ingenieur (algemeen) LRRK1 LRRK2 metabole etikettering 32P orthofosfaat immunoprecipitatie autoradiografie
Metabole Labeling van leucine rich repeat Kinasen 1 en 2 met radioactieve fosfaat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, … More

Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, V. Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate. J. Vis. Exp. (79), e50523, doi:10.3791/50523 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter