Metabolisk Märkning av Leucin Rich Upprepa Kinaser 1 och 2 med radioaktivt fosfat
Summary
Leucin rika upprepnings kinaser 1 och 2 (LRRK1 och LRRK2) är multidomänproteiner som kodar både GTPas och kinasdomäner och som är fosforylerad i celler. Här presenterar vi ett protokoll för att märka LRRK1 och LRRK2 i celler med 32p ortofosfat, vilket ger en möjlighet att mäta sina övergripande cellulära phophorylation nivåer.
Abstract
Leucin rika upprepnings kinaser 1 och 2 (LRRK1 och LRRK2) är paraloger som delar en liknande organisation domän, inklusive ett serin-treonin-kinasdomän, en Ras av komplexa proteiner domän (ROC), en C-terminal av ROC-domänen (COR), och leucin-rika och ankyrin-liknande upprepningar vid N-terminus. De exakta cellulära roller LRRK1 och LRRK2 har ännu inte klarlagd, men LRRK1 har varit inblandad i tyrosinkinasreceptor signalering 1,2, medan LRRK2 är inblandad i patogenesen av Parkinsons sjukdom 3,4. I denna rapport presenterar vi ett protokoll för att märka LRRK1 och LRRK2 proteiner i celler med 32p ortofosfat, vilket ger ett medel för att mäta den totala fosforyleringsnivåer av dessa två proteiner i celler. I korthet tagged affinitet LRRK proteiner uttrycks i HEK293T-celler som exponeras för medium innehållande 32 P-ortofosfat. Den 32 P-ortofosfat assimileras av cellerna efter endast ett fåtaltimmars inkubering och alla molekyler i den cell som innehåller fosfater därigenom radioaktivt märkt. Via affinitetsmärkning (3xflag) de LRRK proteiner isolerade från andra cellkomponenter genom immunfällning. Immunoprecipitat separeras sedan genom SDS-PAGE, blottades till PVDF-membran och en analys av de införlivade fosfater utförs genom autoradiografi (32 P-signal) och western-detektion (protein-signal) av proteinerna på blotten. Protokollet kan lätt anpassas för övervakning av fosforylering av något annat protein som kan uttryckas i celler och isolerades genom immunfällning.
Introduction
Leucin rika upprepnings kinaser 1 och 2 (LRRK1 och LRRK2) är multidomain paraloger som delar en liknande organisation domän. Båda proteinerna koda ett GTPas-sekvens besläktad med Ras-familjen av GTPases (RAS av komplexa proteiner, eller ROC) såväl som en C-terminal av ROC-domänen (COR), vilket effektivt klassificera båda proteinerna till ROCO proteinfamiljen 5,6. N-terminalen av domänen tandem ROC-COR, båda proteinerna koda en leucinrik upprepningsdomän samt en ankyrin-liknande domän, medan endast LRRK2 kodar en extra bält Domein 6-8. C-terminal av ROC-COR, båda proteinerna delar ett serin-treonin-kinas-domänen medan endast LRRK2 kodar ett WD40 domänen i den C-terminala regionen 8. De exakta cellulära roller LRRK1 och LRRK2 har ännu inte klarlagd, men LRRK1 har varit inblandad i tyrosinkinasreceptor signalering 1,2, medan den genetiska bevisen pekar på en roll för LRRK2 i patogenesen av Parkinsons sjukdom 3,4.
<pclass = "jove_content"> Den fosforylering av proteiner är en gemensam rättslig mekanism i cellerna. Till exempel kan fosforylering vara avgörande för aktivering av enzymer eller för rekrytering av proteiner till en signaleringskomplex. Den cellulära fosforylering av LRRK2 har i stor utsträckning präglas och phosphosite kartläggning har visat en majoritet av cellulär fosforyleringssäten att inträffa i ett kluster mellan ankyrin repeat och leucin rika upprepa domäner 9-11. Även LRRK1 cellulära fosforyleringssäten har ännu inte kartläggas, tyder allt från studier med fosfoprotein färgning av blöts av immunoprecipiterade LRRK1 protein från COS7 celler som LRRK1 protein fosforyleras i cellerna 12.Detta dokument ger en grundläggande protokoll för analys av allmän fosforylering nivån LRRK1 och LRRK2 i cellinjer med hjälp av metabolisk märkning med 32 P-ortofosfat. Den övergripande strategin är okomplicerad. Affinity tagged LRRK proteins uttrycks i HEK293T-celler som exponeras för medium innehållande 32 P-ortofosfat. Den 32 P-ortofosfat assimileras av cellerna efter bara några timmars inkubation och alla molekyler i cellen som innehåller fosfater är därmed radioaktivt märkt. Den affinitetsmarkör (3xflag) används sedan för att isolera de LRRK proteiner från andra cellulära komponenter genom immunoutfällning. Immunoprecipitat separeras sedan genom SDS-PAGE, blottades till PVDF-membran och en analys av de införlivade fosfater utförs genom autoradiografi (32 P-signal) och western-detektion (protein-signal) av proteinerna på blotten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta dokument ger en grundläggande protokoll för analys av allmän fosforylering nivån LRRK1 och LRRK2 i cellinjer med hjälp av metabolisk märkning med 32 P-ortofosfat. Den övergripande strategin är okomplicerad. Affinity tagged LRRK proteiner uttrycks i HEK293T-celler som exponeras för medium innehållande 32 P-ortofosfat. Den 32 P-ortofosfat assimileras av cellerna efter bara några timmars inkubation och alla molekyler i cellen som innehåller fosfater är därmed radioaktivt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är också tacksamma för Michael J. Fox Foundation stödjer denna studie. Vi tackar Research Foundation – Flandern FWO (FWO projekt G.0666.09, senior forskare gemenskap till JMT), IWT SBO/80020 projekt Neuro-TARGET, KU Leuven (OT/08/052A och IOF-KP/07 / 001) för deras stöd. Denna forskning stöddes också delvis av fondens Druwé-Eerdekens förvaltas av King Baudouin Foundation till JMT.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
| Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
| Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 |
References
- Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158 (2011).
- Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
- Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson’s disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
- Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
- Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
- Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
- Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
- Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
- Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
- Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson’s disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
- Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
- Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
- Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
- Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472 (2012).
- Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
- Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. , (2012).
- Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).
- Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. , (2013).
- West, A. B. Parkinson’s disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).
- Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson’s disease. PLoS One. 6, e17153 (2011).
- Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).
