Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Metabolsk Merking av leucine Rich Gjenta Kinaser en og to med Radioaktiv Fosfat

Published: September 18, 2013 doi: 10.3791/50523
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven and Leuven Institute for Neuroscience and Disease (LIND)

Summary

Leucin-rik vend kinaser 1 og 2 (LRRK1 og LRRK2) er multidomain proteiner som koder både GTPase-og kinase-domener og som er fosforylert i celler. Her presenterer vi en protokoll for å merke LRRK1 og LRRK2 i celler med 32 P orthophosphate, og gir dermed et middel til å måle sine samlede mobil phophorylation nivåer.

Abstract

Leucin-rik vend kinaser 1 og 2 (LRRK1 og LRRK2) er paralogs som deler et lignende domene organisasjon, inkludert en serin-treonin-kinase-domene, et Ras av komplekse proteiner domene (ROC), et C-terminalt domene av ROC (COR), og leucin-rik og Ankyrin-lignende gjentagelser ved N-terminus. De nøyaktige cellulære roller LRRK1 og LRRK2 er ennå ikke klarlagt, men LRRK1 har vært innblandet i tyrosinkinasereseptor signale 1,2, mens LRRK2 er implisert i patogenesen av Parkinsons sykdom 3,4. I denne rapporten presenterer vi en protokoll for å merke LRRK1 og LRRK2 proteiner i celler med 32 P orthophosphate, og gir dermed et middel til å måle den samlede fosforylering nivåer av disse to proteiner i celler. I korte trekk, affinitet tagget LRRK proteiner er uttrykt i HEK293T celler som utsettes for medium som inneholder 32 P-orthophosphate. Den 32 P-orthophosphate er assimilert av cellene etter bare et fåtalltimers inkubering og alle molekyler i cellen inneholdende fosfater blir derved radioaktivt merket. Via den affinitet tag (3xflag) de LRRK proteiner er isolert fra andre cellulære komponenter av immunoprecipitation. Immunoutfellinger blir deretter separert via SDS-PAGE, blottet på PVDF-membraner og analyse av de inkorporerte fosfater utføres ved autoradiografi (32 P-signal) og western deteksjon (protein-signal) av proteinene på blots. Protokollen kan lett tilpasses for å overvåke fosforylering av ethvert annet protein som kan uttrykkes i celler, og isoleres ved immunoutfelling.

Introduction

Leucine rikt gjenta kinaser 1 og 2 (LRRK1 og LRRK2) er multidomain paralogs som deler en lignende domene organisasjon. Begge proteiner koder en GTPase-sekvens beslektet med Ras familien GTPases (RAS av komplekse proteiner, eller ROC) så vel som et C-terminalt domene av ROC (COR), en effektiv måte å klassifisere begge proteiner til ROCO protein familien 5,6. N-terminalen av ROC-COR domene tandem, begge proteiner koder en leucin-rik vendende domene, samt en Ankyrin-lignende domene, mens bare LRRK2 koder for et ekstra armadillo domein 6-8. C-terminal av ROC-COR, både proteiner dele en serin-treonin kinase domenet mens bare LRRK2 koder for et WD40 domene i C-terminal region 8. De nøyaktige cellulære roller LRRK1 og LRRK2 er ennå ikke klarlagt, men LRRK1 har vært innblandet i tyrosinkinasereseptor signale 1,2, mens genetisk bevis peker mot en rolle for LRRK2 i patogenesen av Parkinsons sykdom 3,4.

9-11. Selv LRRK1 cellular fosforylering nettsteder har ennå ikke kartlagt, bevis fra studier med fosfoprotein farging av blotter av immunoutfelt LRRK1 protein fra COS7 celler tyder på at LRRK1 protein er fosforylert i celler 12.

Denne artikkelen gir en grunnleggende protokollen for å analysere generelle fosforylering nivå LRRK1 og LRRK2 i cellelinjer ved hjelp av metabolsk merking med 32 P-orthophosphate. Den overordnede strategi er enkel. Affinity tagget LRRK proteins er uttrykt i HEK293T celler som utsettes for medium som inneholder 32 P-orthophosphate. Den 32 P-ortofosfat er assimilert av cellene etter bare noen få timer med inkubering, og alle molekyler i cellen inneholdende fosfater blir derved radioaktivt merket. Affiniteten tag (3xflag) blir så brukt til å isolere de LRRK proteiner fra andre cellulære komponenter ved immunoutfelling. Immunoutfellinger blir deretter separert via SDS-PAGE, blottet på PVDF-membraner og analyse av de inkorporerte fosfater utføres ved autoradiografi (32 P-signal) og western deteksjon (protein-signal) av proteinene på blots.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den nåværende protokollen bruker radioaktivt 32 P-merket orthophosphate å følge cellular fosforylering av LRRK2. Det er viktig å huske på at alle operasjoner med radioaktive reagenser bør utføres ved hjelp av egnede beskyttelsestiltak for å redusere eksponering for radioaktiv stråling for brukeren og miljøet. Forbindelser som inneholder isotoper som avgir ioniserende stråling kan være skadelig for menneskers helse og streng lisensiering og forskrifter på et institusjonelt og nasjonalt nivå kontroll deres bruk. Forsøkene i denne protokollen ble gjennomført etter trening i åpen kildekode strålebruk ved Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven) og følge god laboratoriepraksis retningslinjer gitt av helse-, miljø-og sikkerhetsavdelingen ved universitetet. Flere trinn i vår protokoll er vidt distribuert, for eksempel cellekultur, SDS-PAGE, Western blotting og gitt her er detaljer av protokoll som anvendt i vårt laboratorium. Det erhould bemerkes at nøyaktige eksperimentelle forhold varierer fra laboratorium til laboratorium, derfor konkrete tiltak for å sikre forsvarlig håndtering av radioaktivt materiale skal tilpasses hver nye laboratorium innstilling.

Bruk av åpen kildekode stråling er gjenstand for forutgående regulatorisk godkjenning og tilsynsorgan ansvarlig for open source stråling i laboratoriet forskning varierer fra land til land. Brukere bør rådføre seg med sin institusjonelle strålevernsansvarlig for å sikre at prosedyren i samsvar med lokale lover og regler. Informasjon om tilsynsorganer kan være funnet: i Belgia, Federal Agency for Nuclear Control ( http://www.fanc.fgov.be , nettside på fransk eller nederlandsk), i Storbritannia, Health and Safety Executive ( http: / / www.hse.gov.uk / stråling / ioniserende / index.htm ), i USA den Nuclear Regulatory Commission ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ), i Canada den kanadiske Nuclear Safety Commission ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), og i Tyskland Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Sikkerhetsforanstaltninger som er relevante for denne protokollen har blitt bemerket i teksten, uthevet med det radioaktive Trefoil symbol ( Rad Symbol ).

En. Metabolsk Merking av celler

  1. Forbered celler for merking.
    1. Kultur HEK293T cellelinjer i henhold til standard dyrkningsbetingelser (37 ° C, 5% CO2) i DMEM med 8% føtalt kalveserum og gentamycin.
    2. Utvid celler tilstrekkelig tilskaffe minst 1 x 10 6 celler pr prøve å teste.
    3. Trypsinize celler og plate ut i 6 brønners plater (mm diameter 35) på 10 6 celler / brønn.
    4. 24 timer etter plating ut celler, uttrykke 3xflag-LRRK2 protein via transfeksjon eller lentiviral vektor mediert transduksjon.
      1. For transfeksjon, bland per prøve 4 ug DNA (pCHMWS-3xflag-LRRK2 plasmid 13-15 eller pCHMWS-3xflag-LRRK1 plasmid 15) og 8 ul av lineær polyetylenimin (PEI lineær, 1 mg / ml) i 80 mL DMEM (uten tilsetninger ). La det komplisert for 15-30 min deretter legge kompleks til cellene ved å blande godt inn i medium til stede.
      2. For lentiviral vektor mediert transduksjon, fortynne lentiviral vektor koding 3xflag-LRRK1 eller -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, som en tommelfingerregel, transduce med dobbelt så mange transducing enheter, dvs. antall funksjonelle vektor partikler, av lentivector som det er celler) i kulturmediet. En beskrivelse av produktet ion av LV-3xflag-LRRK1 / 2 er tidligere blitt beskrevet 15.
    5. Når cellene er 80 til 100% sammenflytende (ca. 48 timer etter transfeksjon eller transduksjon), skylles cellene med forvarmet (37 ° C) DMEM uten fosfater.
  2. Etikett celler med 32 P-orto-fosfat.
    1. Huske på generelle prinsipper for sikkerhet ved arbeid med stråling.
      1. Rad Symbol Utføre alle operasjoner med 32 P i en utpekt stråling området.
      2. Rad Symbol Egnet personlig verneutstyr bør brukes - under standard prosedyre i vårt laboratorium disse inkluderer labfrakk, doble hansker og vernebriller.
      3. g "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Alt arbeid med 32 P bør være skjermet fra brukere av 6 mm pleksiglass-skjermer for å minimere eksponering.
      4. Rad Symbol Personlig overvåkingsutstyr bør alltid brukes - innenfor KUL alle sertifisert open source stråling brukeren bærer en film badge festet til brystlommen på den labfrakk å overvåke stråling under eksperimentene.
      5. Rad Symbol Alle eksperimentelle overflater bedømmes for radioaktivitet før og etter bruk med en geigerteller.
      6. Rad Symbol Skal avhendes i streng overholdelse av institusjonelle retningslinjer for ra alle potensielt forurensede forbruksvarerdioactive avfallshåndtering.
    2. Under en laminær strømning, forberede en Falcon rør med 2,1 ml DMEM uten fosfater (forvarmet til 37 ° C) pr 6-brønns plate av celler til etiketten.
      1. For eksempel, for å etikett celler i alle brønner i en 6-brønns plate, klar 12,6 ml medium (= 6 x 2,1). Dette er for å sørge for 2 ml medium til å bli brukt per 6-brønns plate brønn av celler med et 5% overskudd i volum.
    3. Rad Symbol Klargjør benken hvor forsøkene med ioniserende stråling vil bli utført. Arbeids mellomrom er dekket av et utslipp matte hvorpå en beskyttende foring av absorberende materiale er plassert. I tilfelle du bruker en liner med en vanntett overflate, plasser den med absorberende siden opp.
    4. Rad Symbol Også sørge foren pleksiglass krukke på arbeidsområdet og plasserer røret av fosfatfritt medium i den.
    5. Rad Symbol Ta ledelsen foret container med hetteglasset med 32 P-merket orthophosphate ut av kjøleskapet og ta den med til radioaktivitet benken. Overvåk beholder for ekstern radioaktiv forurensning ved hjelp av en geigerteller.
    6. Rad Symbol Fortynn 32 P-merket ortofosfat inn i røret av DMEM uten fosfat ved en konsentrasjon på 24 pCi / ml.
      1. Merk: 2 ml per 6-brønns plate godt med celler, tilsvarer dette 5 uCi 32P-merket ortofosfat / cm 2 av dyrkede celler.
      2. Rad Symbol Holdrøret i pleksiglass jar.
    7. Rad Symbol Lukkes beholderen med resten av 32 P-merket ortofosfat og sett i kjøleskapet.
    8. Rad Symbol Fjern de seks-brønns plater med cellene som skal merkes fra inkubatoren og sted på radioaktivitet benken.
    9. Rad Symbol Fjern medium supernatanten og kast. Tilsett 2 ml av fosfat-fritt medium som inneholder 32 P-merket ortofosfat / brønn.
    10. Rad Symbol Plasser kultur plater inn i en pleksiglass boks deretter overvåke beholderen for ekstern radioaktiv forurensning ved hjelp av en geigerteller.
    11. Rad Symbol Overfør pleksiglass boks med celler til en eukaryot celle inkubator dedikert til isotoper metabolsk merking.
    12. Rad Symbol Inkuber i 1-20 timer ved 37 ° C i 5% CO 2.
      1. Generelt er en inkorporering tid av 3 timer eller mer oppmerksom på. Den optimale Inkubasjonstiden kan vurderes gjennom tidsforløpet eksperimenter for hvert spesifikt protein som ønsket.
    13. Rad Symbol Valgfritt: behandle celler med sammensatte.
      1. I forsøk med forbindelsen behandling (slik som en kinase-inhibitor), blir en forbindelse behandlingstrinn følger etter en initial inkubasjonstid uten forbindelse for å muliggjøre merking. Etter den ønskede inkubasjonstiden, er Perspex boks som inneholder kulturplater fjernet fra inkubatoren og brakt til radioaktivitet benken.
      2. Rad Symbol Merking medium fjernet og erstattet med forvarmet fosfatfritt medium i hvilket forbindelsen er fortynnet til den ønskede konsentrasjon. Kast medium i et 50 ml rør for avfalls som er plassert i pleksiglass jar.
      3. Rad Symbol Celler blir erstattet i perspex-boksen og plassert i cellen inkubator for den ønskede kontakttid.
  3. Rad Symbol Samle lysates av labeledet celler.
    1. Rad Symbol Fjern mediet fra cellene og kastes inn i avfalls-rør som er plassert i pleksiglass jar.
    2. Rad Symbol Skyll celler 2x med iskald TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, 2 ml / skylling), forkaster skylleløsning i en avfallsinnsamling rør plassert i pleksiglass jar.
    3. Rad Symbol Tilsett 0,5 ml iskald immunoutfelling (IP) lyseringsbuffer til hver brønn og samle-lysat ved å pipettere lysat opp og ned for å løsne alle lyserte celler.
      1. Klargjør det nødvendige volum av IP-lyseringsbuffer (0,5 ml / prøve, pluss 5% overskudd) på forhånd, tilsetning av Protease-inhibitor cocktail og fosfataseinhibitor cocktail friskt like før bruk.
      2. Sammensetningen av lysis-buffer er 20 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton 1%, Glyserol 10% protease inhibitor cocktail og fosfatase-inhibitor cocktail.
    4. Rad Symbol Overfør lysatet til et mikrosentrifugerør og inkuber på is i minst 10 min.
    5. Rad Symbol Sentrifuger lysatene i en mikrosentrifuge ved> 5000 xg i 10 min.
    6. Rad Symbol Kast av radioaktivt avfall i egne avfallsbeholdere som er lagret bak pleksiglass skjold.

2. Analyser Merking av proteiner av interesse

  1. Rad Symbol Isoler proteinet av interesse ved å immunorensing (IP).
    1. Rad Symbol Overfør mikrosentrifugerør med sentrifugert lysates tilbake til is og pipetter supernatanten inn en mikrosentrifuge tube inneholder 10 mL seng volum av ekvilibrerte flagg-M2 agaroseperler.
      1. Forbered rørene med ekvilibrerte flagg-M2 agaroseperler forhånd.
      2. For dette, pipettere et volum på flagg-M2 agarose oppslemning tilsvarer 10 pl lagvolum pr prøven pluss et 5% overskudd.
        1. Vanligvis tilsvarer en 10 pl lagvolum av perler til 20 ul slurry. Se produktdatablad for flere detaljer.
      3. Stabil perlene ved å skylle 3x i 10 volumer (i forhold til bed-volum) av IP-lyseringsbuffer.
      4. Fordel ekvilibrert perler jevnt på 10 mL seng volum / rør inn så mange rør som det er prøver. Merk rørene med en identifikator for hver prøve.
    2. Rad Symbol Overfør mikrosentrifugerør til 50 ml rør (ca 6 mikro tubes/50 ml tube) merket med en radioaktiv Trefoil symbol og holde på is.
    3. Rad Symbol Overfør prøvene til en roterende enhet bak et Perspex skjold i det angitte område i et kaldt rom for ende-over-end blanding ved 4 ° C i 1-20 hr.
    4. Rad Symbol Overfør prøvene til en bestemt arbeidsplass på is.
    5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Spinn ned proteinet bundet flagg-M2 agaroseperler i en mikro (1000 xg, 1 min) og kast supernatanten til et avfallsbehandlings tube.
    6. Rad Symbol Vask protein bundet flag-M2 agarosekuler ved hjelp av resuspendering i 1 ml IP vaskebuffer.
      1. Sammensetning av IP vaskebuffer: Tris 25 mM pH 7,5, NaCl 400 mM, Triton 1%. Det anbefales å også inkludere protease og fosfatase hemmere i vaskebufferen for proteiner som er følsomme for nedbrytning av co-rensende proteaser eller til dephosphorylation av co-rensende fosfataser.
      2. Rad Symbol Spinn ned proteinbundne flagg-M2 agaroseperler i en mikrosentrifuge (1000 xg, 1 min) og kast supernatanten i en avfalls samsjon tube.
      3. Rad Symbol Gjenta vasketrinn 3x.
    7. Rad Symbol Etter vaskinger, resuspendere kulene til en IP ml skyllebuffer (Tris 25 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, ditiotreitol (DTT) 2 mM, Triton 0,02%, beta-glycerofosfat 5 mM, Na-3-VO 4 0,1 mM).
    8. Rad Symbol Spinn ned proteinbundet flagg-M2 agaroseperler i en mikrosentrifuge (1000 xg, 1 min) og kast supernatanten til et avfallsbehandlings tube. Fjern all overflødig buffer.
    9. Rad Symbol Suspender perler inn 40 & mu, l av IP prøve SDS loading buffer (Tris-HCl-160 mM pH 6,8, 2% SDS, 0,2 M DTT, 40% glycerol, bromfenolblå 2 mg / ml).
      1. Prøver kan bli analysert umiddelbart eller lagret i en -20 ° C fryser for bakt analyse.
        1. Rad Symbol For oppbevaring av prøver ved -20 ° C, sted prøvene i Rør holdere eller bokser i en pleksiglass boks i et radioaktivt Trefoil symbol merket fryser dedikert til lagring av radioaktive prøver.
    10. Rad Symbol Kast av radioaktivt avfall i egne avfallsbeholdere som er lagret bak pleksiglass skjold.
  2. Rad Symbol Løse IP prøver via SDS-PAGE og blot til PVDF-membran.
    1. Rad Symbol Varme prøvene i lastebuffer til 95 ° C i 2 min og sentrifuger i 1 minutt ved> 1000 xg til pellet perlene.
    2. Rad Symbol Klargjør protein gelelektroforese modul på radioaktivitet benken bak en pleksiglass-skjerm.
    3. Rad Symbol Lasteprøver på en 3-8% tris-acetat SDS-PAGE geler.
      1. Denne type gel er egnet for å løse med høy molekylvekt (HMW) proteiner. Andre gel typer kan også være egnet, for eksempel et 4-20% Bis-Tricine-gel-eller Tris-glysin 4-20% geler.
      2. Ved en molekylvekt markør som er egnet til å skjelne størrelser av HMW proteiner.
      4. <li> Rad Symbol Utfør-elektroforese ved 150 V i 1 time.
    4. Rad Symbol Etter elektroforese, fjern gel fra sin plast casing og overføre gel til en container med Western blotting overføring buffer.
      1. Sammensetning av Western blotting overføring buffer: Tris 50 mM, Glycine 40 mM, SDS 0,04%, Metanol 20%.
      2. Rad Symbol Skjær av deler av gelen som stikker ut slik som brønn separatorer og nedre delen av gelen som stikker ut.
    5. Forbered en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran per gel ved å dyppe i metanol i 1 min, deretter i overføring buffer.
      1. Membraner er kuttet til de s ame størrelse som gel pluss en margin på 3 mm.
    6. Plasser en semi-tørrblotting modul på radioaktivitet benken, og ta av dekslet og den øvre elektrodeplate.
    7. Rad Symbol Klargjør blotting sandwich på overflaten av det halvtørrblotting-modulen.
      1. Fukt en ekstra tykk (2,5 mm tykk, 7,5 x 10 cm store) blotting filter i overføring buffer og sted på bunnplaten av blotting modulen.
      2. Rad Symbol Plasser pre-vått PVDF membran på blotting filteret.
      3. Rad Symbol Plasser forsiktig gel på PVDF membran og fjerne eventuelle luftbobler.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Fullfør blot sandwich ved å fukte en ekstra tykk blotting filter i overføring buffer og sted på bunnplaten av blotting modulen. Fjern all luft bobler til slutt er til stede i den blotting sandwich.
        Merk at beskrivelsen gitt her er kompatibel med BioRad trans-blot SD system hvor elektrodene er slik at proteiner vandrer nedad på membranen. Andre blotting-systemer er også kompatible med fremgangsmåten med mindre tilpasninger slik som de som til slutt er nødvendig for å ta hensyn til en annen trekkretningen, eller, i tilfelle av tanken blotting, ekstra flytende avfall som skal avhendes på samme måte som den elektroforese buffer ovenfor.
    8. Rad Symbol Fjern all overflødig buffer med en absorberende vev og plasser topplaten og dekselet på semi-d ry blotting modul.
    9. Rad Symbol Overfør proteiner på 15 V for 1-2 hr.
    10. Rad Symbol I løpet av denne tiden, rydde opp i elektroforese modulen.
      1. Rad Symbol Kast av radioaktivt avfall i egne avfallsbeholdere som er lagret bak pleksiglass skjold.
      2. Rad Symbol Skyll elektroforese modul med destillert vann (AD) og kast skyllevannet i den radioaktivt flytende avfall container.
    11. 0523/50523rad1.jpg "/> Etter overføring, fjerne PVDF membran med utslettet proteiner fra blotting modulen.
    12. Rad Symbol Valgfritt: utføre en Ponceau S farging av blotted proteiner for å visualisere proteiner.
      1. Rad Symbol Overfør blot til et grunt blot inkubering beholder innehold Ponceau S-løsning og inkuberes i 5 min.
      2. Rad Symbol Skyll 2x raskt i AD.
    13. Rad Symbol Tørk membranen.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Utfør autoradiografi.
    1. Rad Symbol Expose membranen til en morilden plate for 1-5 dager.
    2. Rad Symbol Les 32P off av den eksponerte morilden platen med en Storm 840 morilden skanner eller tilsvarende, og lagre bildet som en høyoppløselig TIFF.
  4. Rad Symbol Oppdage protein nivåer via immunodeteksjonsprosedyren.
    1. Rad Symbol Rehydrere membraner ved å dyppe dem kort til metanol, og deretter overføre til et grunt blot inkubasjon fartøy med PBS. Rad Symbol Blokker av membranene i PBS-T (PBS med 0,1% Triton) inneholdende 5% melk.
    2. Rad Symbol Inkuber blotter med anti-LRRK2 antistoff 13,16 eller anti flagg antistoff og prosessen videre med riktige vasketrinn og sekundært antistoff inkubasjon.
    3. Rad Symbol Utfør chemiluminescence gjenkjenning for å bekrefte de relative protein nivåer av LRRK2.
  5. Kvantifisere inkorporering av 32 P i LRRK2.
    1. Utfør densitometrisk analyse av bandene på blot autoradiogram og immunoreaktivitets ved hjelp av egnet programvare som ImageJ programvare, et freeware program tilgjengelig på National Institter av Health nettsted ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. Beregn fosfatnivåene inkorporering som forholdet mellom den autoradiografisk signal over immunoreaktiviteten nivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å sammenligne samlede fosforylering nivåer av LRRK1 og LRRK2 i cellene, 3xflag tagget LRRK1 og LRRK2 ble uttrykt i HEK293T celler 15. Celler ble dyrket i 6-brønns plater og merket med 32P og analysert som beskrevet ovenfor i protokollen teksten. Figur 1 viser representative resultater for metabolsk merking av LRRK1 og LRRK2 i HEK293T celler. Radioaktivt fosfat inkorporering observert for både LRRK1 og LRRK2. Ved kvantifisering av de 32 P nivåene normalisert til proteinnivået, målt ved densitometrisk analyse av immuno-deteksjons med anti-flag-antistoff, ble det funnet at LRRK1 hadde en gjennomsnittlig fosforylering nivå som er lavere enn LRRK2 under de betingelser som ble testet, selv om statistisk signifikans er ikke nådd (P> 0,05).

1.jpg "/>
Figur 1. Metabolsk merking av LRRK1 og LRRK2. A. LRRK1 og LRRK2 uttrykt i HEK293T cellene ble metabolsk merket med 32P som beskrevet i protokollen og resulterer seksjoner. Avbildet her er representative autoradiogram (øvre panel) av 32 P innlemmelse samt representative vestlige blotter (nedre panel) av LRRK1 og LRRK2 deteksjon via sine 3xflag koder. B. Kvantifisering av den komparative metabolsk merking av LRRK1 og LRRK2 (N = 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikkelen gir en grunnleggende protokollen for å analysere generelle fosforylering nivå LRRK1 og LRRK2 i cellelinjer ved hjelp av metabolsk merking med 32 P-orthophosphate. Den overordnede strategi er enkel. Affinity tagget LRRK proteiner er uttrykt i HEK293T celler som er eksponert for medium inneholdende 32 P-ortofosfat. Den 32 P-ortofosfat er assimilert av cellene etter bare noen få timer med inkubering, og alle molekyler i cellen inneholdende fosfater blir derved radioaktivt merket. Affiniteten tag (3xflag) blir så brukt til å isolere de LRRK proteiner fra andre cellulære komponenter ved immunoutfelling. Immunoutfellinger blir deretter separert via SDS-PAGE, blottet på PVDF-membraner og analyse av de inkorporerte fosfater utføres ved autoradiografi (32 P-signal), og Vest-deteksjon (protein-signal) av proteinene på blots. Denne protokollen er å skilles fra protokollen som skal måle LRRK2 autophosphorylation 17 ved at merkingen av LRRK1 eller LRRK2 er utført i cellekultur i stedet for i en in vitro-fosforylering reaksjon med rensede proteiner.

Det bør bemerkes at den detaljerte protokoll er presentert her kan justeres for å ta høyde for flere variasjoner avhengig av eksperimentelle behov. For eksempel, som merking er effektive i de fleste vanlige laboratoriecellelinjer, denne protokollen er ikke begrenset til bruken av HEK293T cellelinje. Dessuten kan andre affinitet koder brukes som et alternativ til 3xflag, slik som HA, myc, V5, GFP eller andre koder 18 som flere koder kan brukes til å effektivt immunoprecipitatet LRRK1 eller LRRK2. Hvis et protein-spesifikt antistoff, er ​​tilgjengelig for protein som er egnet for immunoutfelling, slik tilfellet er for LRRK2 11, kan dette gjennomføres også. Med en immunoutfelling grade protein-spesifikt antistoff, det er også mulig å utføre metabolske merking av LRRKproteiner endogent uttrykt i cellelinjer. I tilfelle av LRRK2, har flere monoklonale antistoffer blitt beskrevet som kan immunoutfelling av endogent LRRK2 19.. Endelig kan den metabolske merking protokoll, som er beskrevet her for LRRK1 og LRRK2 også tilpasses en hvilken som helst annet protein som kan immunoutfelt fra cellelinjer ved bruk av den generelle strategi som er beskrevet ovenfor.

En viktig faktor før du utfører metabolsk merking av proteiner i cellekultur er hvordan denne teknikken sammenlignet med andre metoder tilgjengelig for å bestemme celle protein fosforylering. For eksempel kan fosforylering ved spesifikke seter bli overvåket ved immunoblotting ved bruk av et fosfo-spesifikt antistoff. Denne fremgangsmåten følger tilsvarende fremgangsmåte til det som er beskrevet her, med unntak av det isotop-merking trinn, og av denne grunn er denne teknikk som ofte foretrekkes fremfor metabolsk merking med 32P-ortofosfat når den er tilgjengelig. Metabolsk merking med 32 P-ortofosfat gir et signal som er representativt for den totale tilstanden fosforylering av proteinet, og derfor kan det ikke gi informasjon om fosforylering av spesifikke områder. For proteiner med flere fosforylering områder, som det er tilfelle for LRRK2 10,11, gir den metabolske merking teknikken en ett-trinns vurdering av den samlede fosforylering nivå som kan påvises med fosfor spesifikke antistoffer bare ventende flere immuno-deteksjons-trinn. For eksempel er LRRK2 svært fosforylert i sin ANK-LRR Interdomain regionen, dvs. S910/S935/S955/S973 11,20 områder så vel som i andre regioner 10 inkludert den nylig preget S1292 området 21. For å dissekere ut rollene til enkelt phosphosites, anbefales det å foret eksperimenter med phosphosite spesifikke antistoffer. For eksempel phosphosite spesifikke antistoffer har lov til å skjelne at S910/S935/S955/S973 phosphosites er dephosphorylated i flere sykdomsfremkallende mutanter som R1441C / G, Y1699C, I2020T, men ikke i de G2019S 11,22, mens LRRK2 sykdom mutante former generelt viser høyere fosfor-S1292 nivåer 21. Imidlertid, metabolsk merking er nyttige for en rekke andre studier av celle fosforylering. Metabolsk merking er alltid en anvendbar teknikk for eksempel i tilfeller av ukjente fosforylering områder, eller når fosfo-antistoffer ikke er tilgjengelig, eller av lav sensitivitet. Endelig tillater metabolsk merking sammenligne generelle fosforylering nivåer av forskjellige proteiner (som her vist å sammenligne fosforylering cellulære nivåer av LRRK1 og LRRK2, figur 1), en sammenligning som er vanskelig å gjøre med phosphosite-spesifikke antistoffer gitte forskjeller i sensitivitet fra ett antistoff til et annet .

Som konklusjon, tillater den foreliggende protokoll effektiv vurdering av den generelle fosforylering nivåer av LRRK proteiner i cellene. Protokollen kan lett tilpasses til å overvåkefosforylering av ethvert annet protein som kan uttrykkes i celler, og isoleres ved immunoutfelling. Bruk av denne protokollen er anbefalt når phosphosite spesifikke antistoffer er ikke tilgjengelige for protein i studien eller som et ledd i sin validering. Denne protokollen er spesielt nyttig når den eksperimentelle mål er å sammenligne generelle fosforylering av to eller flere ulike proteiner som slike sammenligninger via metabolsk merking ikke er forspent ved forskjeller i sensitivitet av påvisning av fosforylering fra ett protein til et annet. Spesielt for LRRK1 og LRRK2, kan denne teknikken brukes til forhold overvåke aktivitetsavhengige endringer i fosforylering av LRRK1 og LRRK2, gitt at slike endringer har begynt å bli beskrevet for LRRK2 11,13,23, mens LRRK1 fosforylering regulering er dårlig forstått.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Vi er også takknemlig til Michael J. Fox Foundation støtter denne studien. Vi takker Research Foundation - Flandern FWO (FWO prosjektet G.0666.09, senior forsker fellesskapet til JMT), den IWT SBO/80020 prosjektet Neuro-TARGET, KU Leuven (OT/08/052A og IOF-KP/07 / 001) for deres støtte. Denne forskningen ble også støttet delvis av fondet Druwé-EERDEKENS forvaltes av Kong Baudouin Foundation til JMT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water Perkin Elmer NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11971-025 This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel Sigma A2220 For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter Bio-Rad 1703965
Ponceau S solution Sigma P7170

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158 (2011).
  2. Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
  3. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
  4. Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
  5. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
  6. Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
  7. Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
  8. Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
  9. Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
  10. Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
  11. Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
  12. Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
  13. Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
  14. Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
  15. Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472 (2012).
  16. Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
  17. Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. , (2012).
  18. Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).
  19. Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. , (2013).
  20. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
  21. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).
  22. Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease. PLoS One. 6, e17153 (2011).
  23. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).

Tags

Cellular Biology biologi (generelt) biokjemi bioteknologi (generelt) LRRK1 LRRK2 metabolsk merking 32P orthophosphate immunoprecipitation autoradiografi
Metabolsk Merking av leucine Rich Gjenta Kinaser en og to med Radioaktiv Fosfat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, … More

Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, V. Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate. J. Vis. Exp. (79), e50523, doi:10.3791/50523 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter