Vi har udviklet en metode til at udføre krydser i Setaria viridis (S. viridis). Metoden indebærer beskæring panicle forud for et varmt vand behandling for at dræbe levedygtige pollen. Crosses udføres efter et godt kontrolleret vækst regime og typisk resultere i inddrivelse af 1 til 7 krydsbestøvede frø / s pr panicle.
Setaria viridis er en ny model for C 4 græsser. Det er tæt forbundet med bioenergi forrådsmaterialet præriegræs og kornhøsten rævehale hirse. For nylig, 510 Mb genomet af rævehale hirse, S. italica, er blevet sekventeret 1,2 og 25x dækning genom-sekvensen af skvattet relative S. viridis er i gang. S. viridis har en række karakteristika, der gør det en potentielt glimrende model genetisk system, herunder en hurtig generation tid, lille statur, simple vækst krav, frodig frøproduktion 3 og udviklet systemer til både forbigående og stabil transformation 4.. Men genetik S. viridis er stort set uudforsket, delvis på grund af mangel på detaljerede metoder til at udføre kors. Til dato har ingen standard-protokol vedtaget, der vil tillade hurtig produktion af frø fra kontrollerede krydsninger.
Protokollen presteret her er optimeret til at udføre genetiske krydser i S. viridis, tiltrædelsen A10.1. Vi har ansat en enkelt varmebehandling med varmt vand til kastrering efter beskæring panicle at beholde 20-30 buketter og mærkning af blomster til at fjerne frø som følge af nyudviklede blomster efter kastrering. Efter at have testet en række varmebehandlinger ved eftergivende temperaturer og varierende varighed dypning, har vi etableret en optimal temperatur og tidsinterval på 48 ° C i 3-6 min. Ved at bruge denne metode, kan mindst 15 krydser udføres af en enkelt arbejdstager per dag og et gennemsnit på 3-5 udkryds afkom pr panicle kan inddrives. Derfor kan et gennemsnit på 45-75 udkryds afkom blive produceret af en person på en enkelt dag. Bred gennemførelse af denne teknik vil lette udviklingen af rekombinante indavlede linje populationer af S. viridis X S. viridis eller S. viridis X S. Italica, kortlægning af mutationer gennem hovedparten segregant analyse og skabe højere orden mutanter til genetisk analyse.
S. viridis er en NADP-ME subtype C4 græs tæt knyttet til bioenergi-feed lager præriegræs (NAD-ME-undertype), kornhøsten rævehale hirse og landbrugets ukrudt guinea græs 5.. 510 Mb genomet af dyrkede form af Setaria, S. Italica, er for nylig blevet sekventeret 1,2 og 25x dækning genom sekvens af skvattet slægtning, S. viridis, er i gang (ikke offentliggjort). S. viridis har en række karakteristika, der gør det en potentielt glimrende model genetisk system, herunder en hurtig generation tid, lille statur, simple vækst krav og frodig frøproduktion 3. Vigtigere er det, er for nylig blevet udviklet metoder til både transient og stabil transformation af S. viridis som giver mulighed for at skabe transgene planter 4. Men en væsentlig flaskehals i udviklingen af genetiske værktøjer til S. viridis er dens Recalcitrance til indkrydsning. Til dato har ingen standard-protokol blevet offentliggjort, der vil tillade hurtig produktion af frø fra kontrollerede krydsninger.
Genetiske krydser i S. Italica er normalt udføres af kastrering gennem fjernelse af støvknapper fra blomster 6,7,8 eller ved varmebehandling af blomster af kvindelige forældre 9-11. Efter disse behandlinger, støvknapper eller toppe fra ikke-behandlede blomster / er mandlige forældre forsigtigt slibes mod støvfang frigive pollen. I kastrering er støvknapper fjernes med fine tænger umiddelbart efter floret åbnes og støvknap begynder at exsert, men har endnu ikke afgivet pollen 6-8. Blandt de udfordringer, denne sidstnævnte fremgangsmåde er vanskeligheden ved at udføre kastration i en smal tidsinterval mellem åbningen og pollen stald blomsten. Varigheden af åbning og lukning af en enkelt blomst vil variere afhængigt af tiltrædelsen og miljømæssig stand, og kan variere fra 7 min <sup> 6-2,5 hr 12 i S. Italica. Siden kaste af pollen forekommer som støvknapper exsert fra floret, behøver støvknapper fjernes omhyggeligt og hurtigt, og derfor er det svært at undgå forurening som følge af selvbestøvning. Hertil kommer, som bestøvninger udføres umiddelbart efter kastrering, antallet af krydsninger, der kan udføres pr person / dag er begrænset.
Som en alternativ metode kan modne toppe dyppes i varmt vand til at opvarme-kill udvikle pollenkorn 9,10,13,14 med fordel ved at udføre kors på et stort antal toppe. Men temperaturen og varigheden af varmebehandlingen varierer meget fra forskellige eksperimenter (fx 47 ° C i 10 minutter 14 og 42 ° C i 20 minutter 10). Desuden har ingen systematiske analyser af effekten af varme-medierede emasculations blevet offentliggjort. Således er en standard og enkel fremgangsmåde til udførelse af genetiske krydsninger i S. viridis ville i høj grad fremskynde udviklingen genetiske ressourcer og etablering af S. viridis som modelsystem i forskningsverdenen.
Vi rapporterer udvikling og optimering af en standard-protokol til at udføre genetiske krydser i S. viridis. Planter dyrkes under kontrollerede miljøer at synkronisere blomst udvikling og øger reproducerbarhed af proceduren. Krydsninger udføres ved hjælp af en transgen S. viridis linje som den mandlige forælder indeholder GUS-reportergenet 4 for at lette identifikationen af succesfulde kontrollerede genetiske kors. GUS-transgen er drevet af en ris ubiquitin promotor, som gør det muligt for scoring af F1 frø umiddelbart efter høst og tilvejebringer således en let kvalitativ analyse for at bestemme effektiviteten af kastrering og bestøvning. Vi har ansat en enkelt varmebehandling med varmt vand til kastrering ledsaget af mærkning af blomster, der har været emasculaTED at fjerne frø som følge af nyudviklede blomster efter kastrering. Efter at have testet en række varmebehandlinger ved eftergivende temperaturer og varierende varighed dyppe i varmt vand, har vi etableret en optimal temperatur og tid varigheder på 48 ° C 3-6 min. En præ-dawn kuldebehandling blev fundet at fremme synkron anthesis i begge forældre for at lette krydsbestøvning. Vi har også drøftet de vigtigste skridt i protokollen og den fremtidige anvendelse af denne metode til andre Setaria tiltrædelser.
Betydningen af pre-dawn behandling
For at opnå en høj frekvens af udkrydsning afkom er det vigtigt at have meget synkron anthesis af mandlige og kvindelige forældre. I første omgang, vi cyklede temperatur og lys regimer (31 ° C/22 ° C, dag / nat) og brugte S. viridis tiltrædelse A10.1 for alle bestøvninger. Under disse betingelser, de fleste blomster åbne tidligt om morgenen, før temperaturen stiger til 31 ° C, selv om et par blomster åben tilfældigt mellem 8:00 8: 12:00. Tidligere undersøgelser i S. Italica indikere, at tidspunktet på dagen, sted og årstid bidrager til variation i anthesis 7,15,16. Siles et al. 6 bemærkes, at anthesis var forbundet med hurtige ændringer i temperatur og fugtighed, men ikke med lav temperatur og høj luftfugtighed, per se, som konkluderet i tidligere undersøgelser 7,15. Derfor vi ansat en pre-dawn kuldebehandling på 15 ° C i 30 min (fra 8:30-9: 12:00) at efterligneden naturlige pre-dawn tilstand. Denne pre-dawn kuldebehandling hjulpet i synkronisering anthesis i forældrene. Vi observerede, at på trods af at sætte kammeret for relative luftfugtighed på 50%, den relative fugtighed inden i kammeret steg til et niveau på over 70%, idet temperaturen faldt fra 22 ° C til 15 ° C og fortsatte med at ligge over 70%, indtil temperaturen efterhånden steg til 31 ° C efter 9:30. På 9:00, kastreret kvindelige forældre og planter af mandlig forælder bringes til laboratoriet (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%). Blomster af de mandlige forældre begynde at åbne omkring 10:10, og bestøvning kan udføres kl 10:30-11: 12:00. En detaljeret liste over alle reagenser og udstyr er angivet i tabel 2.
Betydningen af forberedelse panicle for kastrering
Under kammeret forhold i denne undersøgelse (figur 1), varigheden af primære gren blomstrende varierede fra2-3 dage. Typisk blomster placeret på den distale midten af blomsterstanden (figur 2A) åben første og åbning forud proksimalt og distalt. Det ideelle antal af blomster, der skal lagres på panicle er 20-30. Der bør udvises forsigtighed under fjernelse af umodne blomster, så at der kun veludviklede blomster (den øverste blomst eller største på spikelet 17) tilbage. Mærkning med rød markør på begge sider af blomsterne er med til at skelne effektivt formodede outcross afkom fra frø fra nyudviklede blomster efter kastrering. Desuden er det vigtigt at lade børsterne på toppe før kastrering at beskytte buketter fra omfattende varme skader, men som en mulighed, at de kan fjernes efter kastrering hjælp foråret saks for at lette bestøvning, især når en gren bindende teknik er ansat (figur 2C og 2D).
Optimeret temperatur end behandlingsvarighed til varmt vand behandling
Grundlaget for kastration gennem varmt vand dypning at pollen er mere følsom over for varme end Stigmatiseredes overflade. Varighed og temperatur varmebehandlinger kan dog variere blandt Setaria arter og tiltrædelser. Generelt vil en højere temperatur med en kortere behandlingstid eller en lavere temperatur med en længere behandlingstid have samme effekt på kastrering. Det er blevet rapporteret, at en varmebehandling på 42 ° C i 20 minutter 10 eller 47 ° C i 10 minutter 14 afsmeltet S. italica pollen ikke-levedygtige, men effektiviteten af disse behandlinger blev ikke bestemt. Vi har udviklet vores protokol efter den hypotese, at under en optimeret temperatur og varighed af behandlingen, pollen af alle blomsterne tilbageholdes på den kvindelige forælder vil være ikke-levedygtige, mens støvfang vil være modtagelige. Men efter at sammenligne og analysere virkningen af flere temperaturer ogbehandlingsperioder (tabel 1), fandt vi, at følsomheden over for varmebehandling varierer blandt blomsterne tilbageholdt på hver gren, og dermed er det svært helt at eliminere frø som følge af selvbestøvning. Vi konkluderer, at effektiviteten af fremstilling af udkrydsning afkom, er størst, når behandlinger udføres ved 48 ° C i 3-6 minutter i S. viridis tiltrædelse A10.1.
Peak tid anthesis og krydsbestøvning
Når blomsterne nå modenhed og er ved at åbne, støvknapper er gullighvide og pollen er udgydt så snart støvknapper exsert fra blomsterne 8. Støvknapper gradvist blive brune efter pollen er udgydt som blomsterne begynder at lukke. Når frigivet, levedygtigheden af pollen er ukendt. Derfor er det vigtigt at anvende pollen fra åbning eller frisk åbnet blomster på hanindividet så hurtigt som muligt. Under vores kammer betingelser (figur 1), størstedelen af blomstrs af de mandlige forældre begynder at åbne ved 10:10 og de åbnede blomsterne kaste pollen på 10:30. Således ønskelig vindue for at udføre bestøvning er fra 10:30 til 11:00. Stoevfangenes forbliver uden avnerne efter blomster tæt og kan være modtagelig for pollen. Det er tidligere blevet observeret, og bekræftet i S. italica at støvfang er modtagelige for omkring 48 timer efter blomst åbning af Siles et al. 6, så det er vigtigt at posen toppe efter varmebehandling og efter udførelse af kontrollerede kors. Som diskuteret ovenfor, anbefaler vi præsterer bestøvninger på både Dag 2 og Dag 3 efter kastrering.
Metoder til bestøvning
Vi sammenlignede effektiviteten af tre bestøvning teknikker. Hvis blomstrende blomster ikke er begrænsende, panicle-til-panicle bestøvning er den mest effektive teknik og vil give et større antal udkryds afkom. Hvis blomstrende toppe er begrænsende, en højere frekvens af outcross afkom vil blive produceret, når støvknap-til-stigma metode anvendes. Vi har fået udkryds afkom fra begge metoder med succes. Den "bindende toppe" Metoden har været brugt i at krydse S. Italica 6, men vi fandt denne metode for at være den mindst effektive metode som tidsvindue for pollen udgydelse af den mandlige forælder er kort. Desuden er der mindre kontrol over bestøvning og børstehårene på S. viridis toppe kan også hindre bevægelsen af pollen på Stigmatiseredes overflade.
Seed høst, tørring og opbevaring
Efter høsten skal frø tørres ved 30-33 ° C i 2 dage. Anthecium bør fjernes for GUS-farvning, hvis det er nødvendigt. Frø skal opbevares på et tørt, køligt sted (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) for kortvarig opbevaring (mindre end to år) eller i et frø kammer (T: 4,0- 10 ° C ± 1,0 ° C, RH: 20% ± 1%) for langtidsopbevaring.Fattige opbevaringsforhold kan resultere i lav rentabilitet satser 8. Vi har observeret, at spiring sats på S. viridis A10.1 er cirka 5%, når sået 4 dage efter høst, men kan øges til 90-96% efter opbevaring i laboratoriet (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) til 110 dage efter høst, efterfulgt af en tre-dages lagdeling ved -80 ° C til at bryde frø hviletilstand. Til stratificering ved -80 ° C, kan tørre frø anbringes i en lufttæt beholder (fx mikro-centrifugeglas eller en mønt kuvert i en forseglet plastpose) og holdt ved -80 ° C i 3 dage før plantning. Efter 16 måneders opbevaring i laboratoriet (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%), kan stadig fås spiring procenter af 90-95%. Desuden, for at bryde hvileperioden frø kan tørres ved 30-33 ° C i 2 dage efter høst, og derefter givet tre dages lagdeling ved -80 ° C efterfulgt af fjernelse afanthecium før plantning. Efter disse behandlinger kan der opnås frøspiring på op til 33%.
Fordele, begrænsninger og eventuelle ændringer
Her giver vi den første standard-protokol til at udføre kors i S. viridis A10.1 ved hjælp af en varmebehandling til kastrering. I modsætning til fysisk kastrering, denne protokol er mindre invasiv og relativt let at etablere sig i et laboratorium. Det tager normalt omkring 15 minutter for at trimme en gren og omkring 15 toppe kan trimmes og krydsede / person / dag. Antages et gennemsnit på 3-5 udkryds afkom / panicle kan inddrives under optimerede betingelser, kan i alt 45-75 udkryds afkom blive produceret af en person på en enkelt dag. Endvidere kan denne teknik anvendes til sender i andre Setaria arter, selv om yderligere optimeringer vil være sandsynligt. Hvis væksten kammer pladsen er begrænset, kan planterne dyrkes i drivhus eller vækstkamre uden en pre-dawn treatment indtil panicle opstår, før de flyttes til de optimerede kammer forhold.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Sankalpi Warnasooriya og Amy Humboldt til kritisk læsning og redigering af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Department of Energy (DE-SC0008769) og National Science Foundation (IOS-1.127.017).
Name | Company | Cat. Number | |
Scissors, spring | World Precision Instruments, Inc | 14126 | |
Forceps, Dumostar Biology Polished | SPI Supplies | TD5BP-XD | |
Surgical Scissors | F.S.T (Fine Science Tools) | 14005-12 | |
Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6″x28″ | http://www.pjpmarketplace.com | 361001 | |
Flats | T.O. Plastics | 715401C | |
metro mix 360 | Hommert International | 10-0356-1 | |
Jack’s 15-16-17 | Hommert International | 07-5925-1 | |
Kimwipes | VWR International | 34120 | |
Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red | Staples | 37002 | |
Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4″ Focal Length | Amazon | DA-10, B0015IP380 | |
12″24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip | Amazon | N/A | |
water bath | VWR scientific | Model: 1166 | |
BDW walk in plant growth chamber | Conviron | BDW 40 |