Summary
Inducerad pluripotent stamcell (iPSC)-härledda myogena stamceller är lovande kandidater för cellterapi strategier för att behandla muskulösa dystrophies. Detta protokoll beskriver transplantation och funktionella mätningar som krävs för att utvärdera engraftment och differentiering av iPSC-härledda mesoangioblaster (en typ av muskel avkomma) i mus modeller av akut och kronisk muskel regenerering.
Abstract
Patient-härledda iPSCs kan vara en ovärderlig källa till celler för framtida autolog cell terapi protokoll. iPSC-härledda myogena stam/stamceller som liknar pericyte-härledda mesoangioblaster (iPSC-härledda mesoangioblastliknande stam-/stamceller: IDEM) kan fastställas från iPSCs som genereras från patienter som drabbats av olika former av muskeldystrofi. Patientspecifika IDEMs kan korrigeras genetiskt med olika strategier(t.ex. lentivirala vektorer, mänskliga konstgjorda kromosomer) och förbättras i deras myogena differentiering potential vid överuttryck av myogenes regulator MyoD. Denna myogena potential utvärderas sedan in vitro med specifika differentieringsanalyser och analyseras av immunofluorescens. Den regenerativa potentialen hos IDEMs utvärderas ytterligare in vivo, vid intramuskulär och intra-arteriell transplantation i två representativa musmodeller som visar akut och kronisk muskelregenerering. IDEMs bidrag till värd skelettmuskeln bekräftas sedan av olika funktionella tester hos transplanterade möss. I synnerhet studeras förbättringen av djurens motoriska kapacitet med löpbandstester. Cellengraftment och differentiering bedöms sedan av ett antal histologiska och immunofluorescens analyser på transplanterade muskler. Sammantaget beskriver detta dokument de analyser och verktyg som för närvarande används för att utvärdera differentieringskapaciteten hos IDEMs, med fokus på transplantationsmetoder och efterföljande utfallsåtgärder för att analysera effekten av celltransplantation.
Introduction
Mesoangioblaster (MAB) är kärlrelaterade muskelavkompitorer som härrör från en delmängd av pericyter1-3. Den största fördelen med MABs över kanoniska muskel stamceller såsom satellitceller4 ligger i deras förmåga att korsa kärlväggen när de levereras intra-kranskärlen och därmed bidra till skelettmuskulatur regenerering i cellterapi protokoll. Denna funktion har utvärderats och bekräftats i både murin- och hundmodeller av muskeldystrofi1,5,6. Dessa prekliniska studier har byggt grunden för en första-i-man fas I/II klinisk studie baserad på intraartärtransplantation av donator HLA-identiska MABs hos barn med Duchenne muskeldystrofi (EudraCT nr 2011-000176-33; för närvarande pågår på San Raffaele sjukhus i Milano, Italien). Ett av de största hindren för cellterapimetoder, där miljarder celler behövs för att behandla muskeln i en hel kropp, är den begränsade proliferativa potentialen hos "läkemedlet" (cellerna). Dessutom har det nyligen visats att det inte är möjligt att få MAB från patienter som drabbats av vissa former av muskeldystroféer, eftersom det förekommer i muskeldystrofi 2D (LGMD2D; OMIM #608099)7.
För att övervinna dessa begränsningar har ett protokoll för härledande MAB-liknande stam-/stamceller från mänskliga och murin iPSCs nyligen upprättats7. Detta förfarande genererar lätt expanderbara cellpopulationer med en vaskulär gen signatur och immunophenotype mycket liknar vuxna muskel-härledda MABs. Vid uttryck av myogena reglerande faktorn MyoD genomgår både murin och mänskliga IDEMs (respektive MIDEMs och HIDEMs) terminal skelettmuskel differentiering. För att uppnå detta mål kan IDEMs transducera med vektorer som kan driva MyoD-uttryck, antingen konstitutivt eller på ett inducible sätt8-10. En lentiviral vektor som innehåller MyoD cDNA smält med östrogenreceptorn (MyoD-ER) används, vilket möjliggör dess nukleära flyttning vid tamoxifen (en östrogenanalog)administrering 11. Denna strategi resulterar i bildandet av hypertrofisk multinukleära myotuber, med hög effektivitet7. IDEMs är särskilt icke-tumorigena, kan inskriva och differentiera inuti värdmuskler vid transplantation och kan korrigeras genetiskt med olika vektorer(t.ex. lentivirus eller mänskliga konstgjorda kromosomer), vilket banar väg för framtida autologa terapeutiska strategier. Härledning, karakterisering och transplantation av IDEMs har beskrivits i ovanstående publikation7. Detta protokollpapper beskriver de analyser som utförts för att utvärdera in vitro myogen differentiering av IDEMs och efterföljande resultat mätningar för att testa effekten av deras transplantation i mus modeller av muskel regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bedömning av myogen och engraftmentpotential
-
In vitro:MyoD-inducerad differentiering
- Generera en stabil cellinje av IDEMs transduced med tamoxifen-inducerbara MyoD-ER lentiviral vektor, titrerar multiplicity av infektion (MOI; t.ex. 1, 5 och 50) med hjälp av den färgning som beskrivs i 1.1.9 (MyHC) som ett resultat av förfarandets effektivitet.
- Täck en 3,5 cm skål med 1 ml 1% Matrigel och inkubera i 30 min vid 37 °C.
- Tvätta plattan två gånger med medium, frö 1 x 105 MyoD-ER transduced IDEMs i 3,5 cm vävnad kultur skål och inkubera vid 37 °C i tillväxtmedium.
- Förvänta dig att cellerna når sammanflöde om en eller två dagar och tillsätt sedan 1 μM 4OH-tamoxifen i tillväxtmediet (1:a dosen).
- Efter 24 timmar, ersätt tillväxtmediet med differentieringsmedium kompletterat med 1 μM 4OH-tamoxifen (2:a och sista dosen).
- Byt ut halva mediet mot färskt differentieringsmedium varannan dag.
- Undersök dagligen kulturerna för myotube-formation.
- Efter en vecka (5 dagar i differentieringsmedium), tvätta plattorna försiktigt med PBS och fixera med 4 % paraformaldehyd i 5 minuter på RT.
- Utför en immunofluorescensfärgning med antikroppar mot myosin tung kedja (MyHC) för att bekräfta förekomsten av myotubes. Motstå med ett kärnfärgämne(t.ex. Hoechst).
Differentieringseffektiviteten utvärderas som procentandelen atomkärnor inuti MyHC-positiva celler: fortsätt till nästa steg om effektiviteten är >50%.
-
In vivo:engraftment i en modell av akut muskelregenerering
För att utvärdera in vivo-bidraget från MyoD-ER IDEMs till muskelregenerering, är cellerna tidigare märkta med en vektorkodning för det gröna fluorescerande proteinet (GFP) som gör det möjligt att spåra dem inuti vävnaden. MyoD-ER GFP IDEMs injiceras sedan i vuxna murinmuskler, tidigare skadade med ett myotoxin(t.ex. kardiotoxin). För att undvika immunavstötning mot xenogeneiska (såsom HUD) eller genetiskt manipulerade/korrigerade celler är det nödvändigt att använda antingen immunbrist eller immunsupprimerade möss.- Förbehandla djuren med en intraperitoneal injektion på 3,5 μl/g på 10 mg/ml tamoxifen (liposoluble form) 24 timmar före transplantation och förbehandling av celler som tillsätter 1 μM 4OH-tamoxifen (vattenhaltig form) i tillväxtmediet över natten före transplantationsdagen.
- Administrera anestesi och analgesi till musen enligt de specifika riktlinjer som reglerar kirurgiska ingrepp i djuranläggningen.
- Injicera 25 μl 100 μM karditoxin (CTX; från Naja mossambica mossambica; VARNING: potentiellt skadligt ämne) i tibialis främre (TA) musklerna.
- 24 timmar efter behandling av djuren med tamoxifen och CTX, lossa cellerna genom trypsinisering och antal.
- Centrifugera cellerna vid 232 x g i 5 min.
- Tvätta cellpelleten i Ca2+- och Mg2+-fri PBS, centrifug och sätt sedan försiktigt tillbaka cellpelleten i Ca2 +- och Mg2 +-fri PBS till en slutlig koncentration av 106 celler / 30 μl, vilket kommer att vara den slutliga volymen av varje injektion.
- Injicera 30 μl cellfjädring i de tidigare skadade musklerna med en spruta med 29 eller 30 G nål. Var särskilt uppmärksam när du tar bort nålen från muskeln. Gör det långsamt, undvik att spilla cellfjädringen genom nålens spår. Transplantera inte kontralateral TA och använd den som kontroll och injicera 30 μl Ca2 +- och Mg2 +-fri PBS för att replikera förhållandena hos den transplanterade.
- Behandla djuren med tamoxifen i ytterligare sex dagar och administrera analgesi(t.ex. Karprofen) i ytterligare två dagar.
- Explant musklerna från 14 dagar efter transplantation och framåt. Bearbeta och analysera proverna enligt protokollen 4 och 5.
2. Transplantation i musmodeller av muskeldystrofi
Denna transplantationsanalys gör det möjligt att utvärdera omfattningen av engraftment av IDEMs i musmodeller av muskeldystrofi. Djuren, som behandlas enligt följande, kan också bedömas för funktionell förbättring av sjukdomen fenotyp. Funktionella tester kan utföras från och med två veckor efter transplantation. För att förbättra engraftment överväga att utföra löpbandsövning före transplantation (enligt beskrivningen i protokoll 3) och/eller seriella cellinjektioner var tredje vecka för 3x (dvs. för totalt 3 injektioner/muskler).
- Intramuskulär transplantation
- Förbehandla djuren med en intraperitoneal injektion på 3,5 μl/g på 10 mg/ml tamoxifen (liposoluble formulering) 24 timmar före transplantation och förbehandling av celler som tillsätter 1 μM 4OH-tamoxifen (vattenhaltig formulering) i tillväxtmediet över natten före transplantationsdagen.
- Lossa genom trypsinisering, räkna och centrifugera cellerna vid 232 x g i 5 min.
- Tvätta cellpelleten i Ca2+- och Mg2+-fri PBS, centrifug och sätt sedan tillbaka pelleten i Ca2 +- och Mg2 +-fri PBS till en koncentration av 106 celler/30 μl.
- Administrera smärtstillande medel och desinficera djurets hud (valfritt) med ett povidonejod- eller klorexidinbaserat desinfektionsmedel. Detta kommer också att bidra till att lokalisera tibialis främre (TA), gastrocnemius (GC) och quadriceps femoris (QC; särskilt vastus intermedius) musklerna.
- Injicera 30 μl cellfjädring i musklerna med en spruta med 29 eller 30 G nål. För TA, sätt in 5 mm av nålen 2 mm under införandet av den proximala senan (kraniokaudal riktning) med en 15° lutning i förhållande till skenbenet och injicera långsamt cellfjädringen medan du drar tillbaka nålen (töm sprutan med 2 mm av nålen fortfarande inuti muskeln). För GC och QC, upprepa samma förfarande som anges för TA, med den största skillnaden är caudocranial insättning av nålen 2 mm ovanför den myotendinous korsningen av Achilles sena för GC och 2 mm ovanför den distala sena för QC (15° lutning med avseende på lårbenet). Var uppmärksam när du tar bort nålen från muskeln för att undvika att spilla cellfjädringen genom nålens spår.
FELSÖKNING: Vid låg engraftment överväga att injicera juvenila (1-2 veckor gamla) möss7 med 3 x 105 celler/10 μl (observera att tamoxifen i detta fall behöver administreras subkutant).
- Intraartärtransplantation
Denna del av protokollet gör det möjligt att utvärdera midems och HIDEMs förmåga att levereras i kranskärlens cirkulation, korsa kärlväggen och bidra till skelettmuskulaturregenerering i musklerna nedströms till injektionsstället.- Förbehandla djur och celler enligt beskrivningen ovan i steg 2.1.1.
- Lossa genom trypsinisering och filter med en 40 μm cellsil (för att ta bort kluster från cellupphängningen i det osannolika fallet att exponering över natten för tamoxifen kan driva fusion och bildandet av myotuber från angränsande celler) räkna och centrifugera cellerna vid 232 x g i 5 min
- Tvätta cellpelleten i Ca2+- och Mg2+-fri PBS, centrifug och sätt sedan tillbaka pelleten i Ca2 +- och Mg2 +- gratis PBS med 0,2 International
Enheter natrium heparin (frivillig uppgift) till en slutlig cellkoncentration på 106 celler/50 μl. Tillsätt 10% Patenterat blått färgämne (slutlig koncentration: 1,25 mg/ml i normal saltlösning eller Ca2+- och Mg2+-fri PBS) till lösningen för att visualisera fördelningen av cellupphängningen. - Administrera anestesi och analgesi till musen enligt de riktlinjer som reglerar kirurgiska ingrepp i den specifika institutionella djuranläggningen.
- Raka inguinalregionen (även känd som femoral eller Scarpas triangel) och desinficera huden med ett povidone jod- eller klorhexidinbaserat desinfektionsmedel.
- Gör ett 5-7 mm snitt och lokalisera lårbensbunten: ven, artär och nerv (nerven ligger i led och venen medialt).
- Ta försiktigt bort den bindväv som täcker bunten med tång.
- Separera lårbensvenen och nerven från artären genom att försiktigt införa spetsen på en tång (eller en 30 G nål) mellan dem och genom att gradvis förstora hålet.
FELSÖKNING: Lårbens venen är bräcklig: var uppmärksam på att inte nypa den med tången under dess avlossning från lårbensartären. Vid blödning, dränera blodet med steril gasväv och använd en mikro cauterizer för att underlätta hemostas. - Lyft artären med en spets av tången och kläm artären med den andra spetsen.
- Punktera artären med en spruta utrustad med en 30 G nål. Injicera 50 μl cellfjädring nedströms det fastklämda området, med en infusionshastighet på cirka 5 μl/sek.
FELSÖKNING: Återanvänd försiktigt cellerna i sprutan före injektionen: det är viktigt att undvika utfällning av celler och luftbubblabildning inuti sprutan. Lårartärens diameter är något mindre än en 30 G-nål: var försiktig så att du inte trunkerar artären medan du sätter in nålen. Patentblå färgämne gör det möjligt att känna igen injektionens effektivitet: om den injiceras korrekt kommer hela lemmen snabbt att bli ljusblå. - Ta långsamt bort nålen och tången från artären för att återställa blodomloppet i lemmen.
- Tryck med steril gasväv för att undvika blödning och/eller kauterize efter behov.
- Suturera såret och övervaka djuren tills de återhämtar sig från anestesi.
- Administrera analgesi i 3 dagar och inspektera såret dagligen (vid sårinfektion diskutera detta med djuranläggningens personal och administrera antibiotika efter behov).
3. Utfallsåtgärder på transplanterade dystrofa djur: Löpbandstest
Från och med två veckor efter celltransplantation är det möjligt att utvärdera funktionell förbättring av motorkapaciteten hos behandlade möss med löpbandstesterna. Detta test möjliggör utvärdering av träningstolerans/uthållighet hos behandlade möss. En mus anses trött när den ligger i viloområdet i mer än 5 sekunder, utan att försöka återkoppla löpbandet efter en serie av 3 på varandra följande mekaniska stimuli (en var 5: e sekund). Baslinjemätningar börjar ungefär en månad före behandlingen och används för att utvärdera förbättringen av varje enskilt testat djur. Detta test kan följas av ytterligare analyser för att övervaka fiberskörhet, kraftförbättring, transplantation, differentiering av transplanterade celler och morfologisk förbättring av de transplanterade musklerna (se Diskussion).
- Acklimatisera djuren (vanligtvis tre grupper: behandlade, obehandlade och vilda typ/icke-dystrofa kontroller) till övningen före den första mätningen: ställ löpbandet på en hastighet av 6 m/min i 10 min. Upprepa proceduren varannan dag i en vecka.
FELSÖKNING: Registrera alla mätningar vid samma timme på dagen för att undvika fördomar på grund av dygnsrytmcyklerna. - Placera djuren i löpbandet, som tidigare har satts upp med en lutning på 10°.
- Slå på löpbandet, med en starthastighet på 6 m/min (ge en mild mekanisk stimulans om djuren inte är villiga att starta övningen).
- Starta timern och öka hastigheten 2 m/min varannan minut.
- Så snart ett djur ligger i viloområdet i mer än 5 sekunder utan att försöka återkoppla löpbandet, rör det försiktigt med en pinne för att stimulera omstarten av träningen (se ovan).
- Registrera varje djurs prestanda (tid och avstånd).
- Upprepa mätningarna varje vecka eller var 10: e dag i minst 3x.
- Upprepa samma procedur efter transplantation.
- Analysera prestandadata som jämför mätningen av varje djur med dess baslinjeprestanda. Vi föreslår att du ritar värdena i ett diagram som en procentandel av den genomsnittliga motorkapaciteten i förhållande till baslinjen och analyserar dem med ett en- eller tvåvägs ANOVA-test följt av lämpligt eftertest för att jämföra grupperna.
FELSÖKNING: Använd minst 5 ålders-, genotyp- och könsmatchade djur/grupp och upprepa mätningarna för minst 3x efter transplantation.
4. Utvärdering av cellengraftment och differentiering i transplanterade muskler
Transplanterade och kontrollera muskler skördas vid lämplig tidpunkt (<2 dagar för kortsiktig engraftment analys, 2-3 veckor för halvtid och >1 månad för långtidsanalys). Om de transplanterade cellerna är märkta med GFP kan inskrivningen i nyisolerade muskler bedömas med direkt fluorescens under ett UV-utrustat stereomikroskop.
- Lägg och orientera längs den vertikala axeln nyisolerade muskler i tragachanth tuggummi (6% w/v)
- Dehydrera proverna i förförd isopentan i en minut, frys in dem i flytande kväve i minst 2 minuter och placera dem omedelbart på -80 °C för lagring.
- Bearbeta proverna med en kryostat för att få 7 μm tjocka sektioner på polariserade diabilder. Prova majoriteten av muskeln på bilderna och samla cirka 8-10 bilder med 30-40 sektioner / bild. Det är lämpligt att samla en serie sektioner i ett 1,5 ml rör för att utföra molekylärbiologi / biokemiska analyser.
- Utvärdera cellengraftment med olika immunofluorescerande färgning, beroende på den experimentella inställningen. Till exempel, vid HIDEM-transplantation hos Sgca-null/scid/bg möss, fläcksektioner med: a) en antikropp mot Lamin A/C för att upptäcka ympade mänskliga cellkärnor; b) En antikropp mot Laminin för att visualisera muskelens övergripande struktur. c) En antikropp mot Sgca för att påvisa donatorbaserad restaurering av det protein som saknas i det dystrofa djuret.
- Kvantifiera, med hjälp av ett fluorescensmikroskop, antalet donatorkärnor per muskelsektion inuti och utanför muskelfibrer och antalet donator-härledda skelettmustofibrar per avsnitt.
5. Muskel histopatologi
Histopatologiska analyser tillåter utvärdering av morfologiska strukturen i den transplanterade muskeln. Arkitektonisk förbättring av vävnadsstrukturen förväntas som ett resultat av cellterapimetoden.
- Fixera de nyisolerade musklerna med 4% paraformaldehyd i 1 timme vid 4 °C.
- Dehydrera proverna med en stigande sackarosgradient(t.ex. 7,5-15-30% w/v).
- Lämna musklerna över natten i den högsta sackaroslösningen.
- Bädda in proverna i Tissue Tek OCT, placera dem i förförd isopentan tills ULT blir fast (undvik fullständig nedsänkning av proverna), frys dem i flytande kväve i minst 2 minuter och placera dem omedelbart på -80 °C för lagring.
- Bearbeta proverna med en kryostat för att erhålla 7 μm tjocka sektioner enligt beskrivningen ovan.
- Färga sektionerna med hematoxylin och eosin eller Massons trichrom enligt standardtillverkarens protokoll.
Hematoxylin och eosinfärgning gör det möjligt att beräkna kännetecken för regenererande muskler, såsom: a) antalet myofibers; b) Tvärsnittsområde. c) Antalet myofibrar som innehåller en central kärna. Massons trichrome används för att beräkna det fibrösa indexet, som görs genom att subtrahera den totala ytan som upptas av skelettmyofibers från bildens totala yta: det resulterande området återspeglar huvudsakligen muskelns bindväv och fettinfiltration. Alla analyser på bilderna kan utföras med ImageJ-programvara (NIH) med mätverktyget och cellräknarplugin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De rapporterade representativa resultaten följer de viktigaste in vitro/in vivo-analyserna som beskrivs i arbetsflödet i figur 1. 48 timmar efter administrering av myoD-positiva kärnor efter administrering av 4OH-tamoxifen är identifierbara inom MyoD-ER-transduced IDEMs in culture(figur 2A). Cellerna smälter sedan samman och differentierar sig till flerkärniga myotuber (Figur 2B). När IDEMs transplanteras intramuskulärt till en murinmodell av akut muskelskada bidrar de till vävnadsregenerering (figur 3). Effekten av IDEMs i en gen- och cellterapiinställning för murinmodeller av muskeldystrofi bedömdes genom löpbandsträningstoleranstestet: Figur 4 visar de resultat som erhållits efter transplantation av midem av vildtyp till Sgca-null/scid/beige möss, som visar en förbättring av motorkapaciteten hos behandlade möss7. Ex vivo-analyser av transplanterade muskler visar GFP-positiva områden som representerar omfattningen av koloniseringen av IDEMs ivärdvävnaden ( figur 5A-C), vilket visar att donatorceller instärkar i dystrofisk muskel. Viktigt är att transplanterade celler kan skilja in vivo, bildar nya skelett myofibers. Figur 5 visar Sgca-uttryck från genetiskt korrigerade HUDM:er till Sgca-null/scid/beige möss(figurerna 5D och 5E). Strukturell förbättring i arkitekturen av transplanterade muskler kan bedömas genom Massons trichrome färgning: Figur 5F visar en minskning av mängden fibrotisk vävnad i behandlade muskler.
Figur 1. Protokollflödesschema. Systemet ger en översikt över den IDEM-baserade strategin, från preliminära in vitro-differentieringsanalyser (vänster) till de olika steg som krävs för att bedöma emaljering, myogen potential och funktionell förbättring in vivo och ex vivo (höger). Mörkgrå rutor innehåller de olika steg som beskrivs i protokollet. ljusgrå lådor innehåller delar av metoden som inte beskrivs i den här artikeln. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 2. Bedömning av myogen potential in vitro. (A) Immunofluorescens som visar kärn- MyoD-uttryck i 4 av 7 MyoD-ER transduced MIDEM-atomkärnor efter 48 timmars exponering för 4OH-tamoxifen. (B) Immunofluorescensfärgning för myosin tung kedja (MyHC) på 4OH-tamoxifen-inducerad HIDEM-härledda myotuber efter en vecka i differentiering medium (Scale bar, 200 μm). Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 3. In vivo bedömning av cellengraftment i en modell av akut muskel regenerering. (A) Stereomikroskopiska GFP fluorescens bilder av nyligen isolerade cardiotoxin-skadade tibialis främre muskler explanteras 2 veckor efter intramuskulär injektion av 106 GFP-HIDEMs (vänster) och GFP-MIDEMs (mitten). Skalstång, 2 mm. (B) Låg (överkant) och höga (nedre) förstoringsbilder av muskeln transplanterade med MIDEMs som visas i (A) som visar GFP-positiva myofibers. Skalstång, 200 μm. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 4. Toleranstest för löpbandsträning. Representativt löpbandstest för transplanterat (IM = intramuskulärt; IA = intraartär). Sgca-null/scid/ beige möss (106 cell/injektion) jämfört med icke-överförda dystrofa och nondystrofisk kontroll immunbrist möss. Tomten visar funktionell förbättring av dystrofa möss transplanterade med MIDEMs (12-22% mer än icke-överförda djur 35 dagar efter transplantation). Data visas som genomsnittlig motorisk kapacitet i förhållandetill utgångsprestanda ( dvs. 100 % representerar baslinjens prestanda för varje grupp och endast behandlade möss förbättrar den avsevärt vid upprepade mätningar). *P < 0,05; **P < 0,005, enkelvägs ANOVA. Från tidigare publicerat arbete av författarna7. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 5. In vivo bedömning av engraftment och myogen potential i mus modeller av muskeldystrofi. a) Stereomikroskopiska GFP fluorescensbilder av nyligen isolerade tibialis främre muskler av Sgca-null/scid/beige möss explanterade 3-4 veckor efter intramuskulär injektion av 106 humana (HIDEMs, vänster; transplantation hos unga möss) och murin (MIDEMs; höger) GFP-IDEMs. Skala bar, 2 mm. (B) Stereomicroscopic GFP fluorescens bild av en nyligen isolerade gastrocnemius muskel explanteras 3 veckor efter intra-kranskärlens injektion av 106 GFP-MIDEMs. Skalstång, 1 mm. (C) Färsk fryst tvärgående del av muskeln transplanterad med MIDEM visas i (A) visar ett kluster av GFP-positiva myofibrar. Skalstång, 200 μm. D) Immunofluorescensfärgning på delar av intramuskulärt transplanterade muskler (som i A)som visar kluster av genetiskt korrigerade fibrer, som härrör från ympade IDEM: er. Skalstång, 150 μm. e) Kvantifiering av α-sarkoglykan (Sgca)-positiva myofibers en månad efter intramuskulär transplantation av genetiskt korrigerade IDEMs till Sgca-null/scid/beige möss. (F) Masson trichrome färgning av tibialis främre muskler från transplanterade och kontroll Sgca-null/scid/beige möss (röd: muskelfibrer; blå: fibros) som belyser minskningen av fibrotic infiltrate i behandlade muskler. Skalstång, 200 μm. Klicka här om du vill visa större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
iPSCs kan utökas på obestämd tid samtidigt som deras självförnyelsepotential bevaras och därmed hänvisas till att differentiera till ett brett spektrum av cellinje12. Av denna och andra skäl anses iPSC-härledda stam/stamceller vara en lovande källa för autolog gen- och cellterapimetoder13. Ett tidigare publicerat verk från författarna rapporterade genereringen av mus och mänskliga myogena stamceller från iPSCs med en fenotyp som liknar pericyte-härledda MABs (IDEMs) och deras effektiva bidrag till muskelregenerering i en musmodell av muskeldystrofi7.
En förutsättning för att maximera IDEM myogen potential är uttrycket av myogen faktor MyoD i cellerna. Transduktionen med en tamoxifen-inducerbar MyoD-ER kassett gjorde det möjligt att ha en exakt temporal kontroll över sitt uttryck med fördelen att synkronisera dess aktivering i hela kulturen och därefter in vivo. En transplantation strategi baserat på en enda administrering av celler per muskel (eller per femorala gatan) har beskrivits i denna artikel. Upprepade cellinjektioner har dock visat sig vara effektiva vid ökning av MAB- inskrivning i olika cellterapiprotokoll8. Därför, i händelse av suboptimala resultat med IDEMs, Det är värt att utföra upprepade transplantationer för att öka celldoseringen och därmed bidra till värdmuskeln.
Utfallsmätningar möjliggör utvärdering av donatorcellernas bidrag till den funktionella förbättringen av fenotypen av behandlade djur. Förutom träningstolerans/uthållighetstest som utförs med löpbandet kan ytterligare tester för att analysera frivillig motorisk kapacitet(t.ex. frihjulstest), fiberskörhet(t.ex. Evans blå färgupptagsanalys) och specifik kraft(t.ex. enstaka fibrer eller hela muskelmekanik) betraktassom 8. Ytterligare metoder för att testa funktionell fenotypmelioration finns tillgängliga som standardrutiner på Treat-NMD-webbplatsen (http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/).
För att samla in viktig information från de transplanterade djuren måste den funktionella förbättringen följas och valideras av immunohistokemiska och histologiska analyser, för att utvärdera cellengraftment och vävnadsarkitektur/ombyggnad. I synnerhet är det viktigt att utvärdera den morfometriska strukturen hos de ympade musklerna för kännetecken för regenerering och fibros, såsom att bedöma antalet fibrer med en central kärna, myofibers tvärsnittsområdet och det fibrösa indexet. De senare analyserna, tillsammans med de funktionella resultaten, ger en uttömmande översikt över strategins effektivitet. Dessutom är övervakning av den härstamning som antagits av transplanterade celler i form av bidragtill vävnaden (dvs. myofibers) och underhåll av stamcellsutrymmet viktigt för den långsiktiga effekten av alla cellterapistrategier. I detta fall har det redan rapporterats att bidraget in vivo som härrör från donatorn har kommit in vivo till det pericyteområde från vilket mesoangioblaster härrörfrån 7. Dessutom indikerar preliminära resultat funktionellt bidrag från IDEMs också till satellitcellpoolen (Gerli och Tedesco, opublicerade resultat). Molekylära analyser för att påvisa engraftment och uttryckför den korrigerade genen (dvs. kvantitativ PCR och western blot) är också kritiska, men ligger utanför detta dokuments räckvidd och skulle kräva en dedikerad artikel.
Även om detta protokoll huvudsakligen har utvecklats med hjälp av Sgca-null/scid/beige möss7 (en nyligen publicerad immunodeficient modell av LGMD2D), förväntas det att det lätt kan tillämpas på andra modeller av muskelsjukdom. När det gäller Sgca-null/scid/beige, möss använde vi inte kardiotoxin, eftersom musklerna hos dessa djur är allvarligt komprometterade och kroniskt föremål för degeneration och regenereringscykler (därför är en ytterligare skada från kardiotoxin inte nödvändig). Vi kunde dock inte utesluta att en förbehandling med kardiotoxin kunde underlätta engraftment i mildare modeller av muskeldystrofi(t.ex. mdx möss). Förbättringar av vår strategi kan inkludera metoder för att förbättra immunbristen hos musvärden (som i de nuvarande modellerna fortfarande är suboptimala) och effekten av donatorcellstransplantation, särskilt vid intraartärtillförsel av xenogena celler. Även om multipelcellstransplantation och användning av unga möss bidrar till ökningen av cellengraftment7,8, kan musens vidhäftningsmolekyler som påträffas av mänskliga celler under extravasation och/eller migration utgöra ytterligare hinder för de nuvarande modellernas begränsade immunbrist. Framtida anvisningar för översättning av denna gen- och cellterapimetod i klinisk miljö kan omfatta farmakologiska strategier för att förbättra cellextravasation och användning av icke-integrerande vektorer(t.ex. plasmider, mRNAs, humana konstgjorda kromosomer eller icke-integrerande virusvektorer) för att omprogrammera och genetiskt korrigera cellerna, vilket undviker risken för infognings mutagenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
F.S.T. har lämnat in en internationell patentansökan (nr. PCT/GB2013/050112) inklusive en del av strategin som beskrivs i den här artikeln. Han fick finansiering av Promimetic och DWC Ltd. för sin forskning.
Acknowledgments
Författarna tackar Giulio Cossu, Martina Ragazzi och hela laboratoriet för hjälpsam diskussion och stöd, och Jeff Chamberlain för vänligt tillhandahållaNde MyoD-ER vektor. Alla försök med levande djur slutfördes i enlighet med och i enlighet med alla relevanta reglerings- och institutionella organ, förordningar och riktlinjer. Arbetet i författarnas laboratorium stöds av UK Medical Research Council, Europeiska gemenskapens sjunde ramprojekt Optistem and Biodesign och det italienska duchenne parent project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Nonessential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacterial suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G Needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
|
|||
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media. |
|||
References
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
- Sampaolesi, M., et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301, 487-492 (2003).
- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
- Kimura, E., et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
