Summary
בסרטון הזה, נדגים טכניקות שינוי לשתלים מתכתיים נקבוביים כדי לשפר את הפונקציונליות שלהם ולשלוט בנדידת תאים. טכניקות כוללות פיתוח הדרגתיים נקבובית כדי לשלוט בתנועת תא ב3D וייצור של קרום במרתף מחקה כדי לשלוט בתנועת תא ב2-D. כמו כן, שיטה המבוססת על HPLC בשילוב שתל ניטור ב-vivo באמצעות ניתוח של חלבונים בדם מתוארת.
Abstract
שתלים מתכתיים, בעיקר שתלים טיטניום, נמצאים בשימוש נרחב ביישומים קליניים. רקמה בצמיחה ובאינטגרציה לשתלים אלו ברקמות הן פרמטרים חשובים לתוצאות קליניות מוצלחות. על מנת לשפר את שילוב רקמות, שתלים מתכתיים נקבוביים לי מפותחים. פתיחה הנקבוביות של קצף מתכתי הוא יתרון מאוד, שכן יכולים להיות פונקציונליות האזורים הנקבוביות מבלי להתפשר על התכונות מכאניות של המבנה כולו. כאן אנו מתארים שינויים כאלה בשימוש בשתלי טיטניום נקבוביים המבוססים על microbeads טיטניום. על ידי שימוש בתכונות הטבועות פיסיות כגון hydrophobicity של טיטניום, ניתן להשיג הדרגתיים נקבובית הידרופובי בתוך שתלים מתכתיים מבוסס microbead ובו בזמן יש קרום במרתף דומים המבוסס על פולימרים הידרופילי, טבעיים. הדרגתיים נקבובית 3D נוצרים על ידי פולימרים סינטטיים כגון חומצת פולי-L-לקטית (PLLA) על ידי שיטת הקפאת חילוץ. 2D nanofibrillar סורפרצופים נוצרים על ידי השימוש בקולגן / אלגינט ואחריו צעד crosslinking עם crosslinker טבעי (genipin). סרט nanofibrillar זה נבנה על ידי שכבה אחרת שכבה (LbL) שיטת תצהיר של שתי המולקולות הטעונות הפוך, קולגן ואלגינט. לבסוף, ניתן לקבל בו שתל אזורים שונים יכולים להכיל תאים מסוגים שונים, כפי שהדבר דרושים לרקמות תאיות רבות. על ידי, ניתן לשלוט בתנועת הסלולר בדרך זו בכיוונים שונים על ידי תאים מסוגים שונים. מערכת כזו מתוארת למקרה הספציפי של קנה הנשימה התחדשות, אבל זה יכול להיות שונה לאברי המטרה אחרים. ניתוח של נדידת תאים והשיטות האפשריות ליצירת שיפועים נקבוביות שונים פירט. השלב הבא בניתוח של שתלים כאלה הוא אפיונם לאחר השתלה. עם זאת, ניתוח היסטולוגית של שתלים מתכתיים הוא תהליך ארוך ומסורבל, ובכך לתגובת מארח ניטור לשתלים מתכתיים in vivoהשיטה מבוססת על ניטור lternative חלבוני דם CGA ושונים היא גם תאר. שיטות אלה יכולים לשמש לפיתוח בהגירת מחוייט מבחנה ובדיקות קולוניזציה ולשמש גם לניתוח של שתלי מתכת פונקציונליות in vivo ללא היסטולוגיה.
Introduction
נכון לעכשיו זמינים שתלים מתכתיים מתאימים ליישומי עומס נושאות, אבל שאינו מחייבים פריקותיהם עיצובים אשר להבטיח ממשק חזק עם הרקמה הסובבת אותם 1. על ידי מתן מבנים המאפשרים הסלולר בצמיחה והתישבות in vivo, חיים שלמים של שתלים מתכתיים יכולים להיות ממושך 2. שתלים מתכתיים בגלוי נקבובי מבטיחים חומרים להנדסת רקמות ממשק וגם להבטחת קולוניזציה טובה של השתלים. הם כבר השתמשו באופן פעיל כשתלים אורתופדיים וגם כשתלים קנו נשימת 3-5. עם זאת, עדיין יש בעיות שצריכות לפתור, כגון שליטה המדויקת תנועת תא באזורים הנקבוביות. אי שליטה בתהליך זה עלול להוביל להתישבות שלמה בקצה אחד וrestenosis בצד השני. גם functionalization נוסף של שתלים אלו הוא הכרחי להשגת פונקציות גבוהות יותר, כגון, מסירה של גורמי גדילה,כלי דם בבימויו ובתנועה בו זמנית של תאים מסוגים שונים 6-8. לשתלים בקנה נשימה, זה חיוני כמו קולוניזציה של השתל על ידי רקמת vascularized רצויה. עם זאת, בלתי מבוקרת של הרקמות בצמיחה ללומן של קנה הנשימה אינן רצויות משום שהיא מקטינה patency שתל.
אפשרות אחת כדי לשלוט בתנועת תא היא הדרת גודל. אם תדע את הגודל של תאי המטרה וביכולתם לקיים אינטראקציה עם פולימר סינטטי נתון זה אפשרי לפתח הדרגתיים של נקבוביות אשר יכול למעשה לקבוע את העומק של תנועת תא. למשל על ידי יצירת ארכיטקטורה נקבובית כי הוא גדול מספיק לכניסה של תאי רקמות חיבור, כגון fibroblasts extraluminally, אך קטן מספיק (פחות מ -10 מיקרומטר) כדי למנוע התנועה שלהם intraluminally שליטה אפקטיבית על קולוניזציה של שתל צינורי יכול להיות מושגת.
משיטות ליצירה נקבוביות זמינות, כגון הקפאת dryiנג, שטיפת חלקיקים, גז קצף 9,10; הקל ביותר כדי להתאים שיטה להיווצרות מהירה של מעברי צבע נקבוביות עם כמות מינימאלית של ציוד הדרוש הוא להקפיא מיצוי 11. בשיטה זו, פתרון פולימר הוא קפוא בתערובת בינארית של ממס אורגני ומים. לאחר מכן, החליף הממס באמצעות מיצוי בנוזל ליל מראש צונן כגון אתנול. הקפאה ותנאי חילוץ לקבוע את הצורה ואת הגודל של הנקבוביות ואם החילוץ נעשה באופן שבו ניתן לשלוט בתנועה של פתרון החילוץ, גודל וצורה נקבובית יכולים להיות directionally מווסת.
צעד שני לרקמות תאיות הוא היווצרות מחסומים נקבוביים בין סוגי תאים שונים לשליטה באינטראקציה ביניהם. זה גם הכרחי לזמינות של microenvironments שונה לסוגי תאים שונים, בהתאם לדרישות שלהם 12,13. קנה נשימה היא איבר צינורי שמחבר את הגרון עם bronchאני. יש לו בטנה פנימית pseudostratified אפיתל הריסים עם תאי גביע אשר מייצרים ריר interdispersed. מבנה 3D והיציבות של קנה הנשימה הוא מתוחזק על ידי סחוס בצורה של C-טבעות. כך, בקנה נשימה מלאכותית לא אמורה להיות צומת מוגדרת בין רקמת החיבור ושכבת אפיתל הריסים. בעוד מבנה 3D הוא הכרחי עבור חלק רקמת החיבור, ההגירה של תאי האפיתל מחייבת קרום דמוית מרתף פני השטח כדי להשיג תנועה כיוונית וסגירת הפצע. סרטים רבים שכבתיים polyelectrolyte (PEMs) הם אופציה אפשרית אחת להשיג מחקה קרום במרתף. שיטת שכבה אחר שכבה (LbL) היא תהליך תכליתי להשיג ציפוי פני שטח דק ופונקציונלי. היא מבוססת על אינטראקציות אלקטרוסטטיות של שתי polyelectrolytes הטעונים הפוך והצטברותם באופן רציף כדי לקבל קנה המידה ננומטרי ציפוי פני שטח שתכונותיו יכול להיות מגוונות על ידי משתנים פשוט משתנים כגון מיני polyelectrolyte, pH,מספר שכבה, תוספת של שכבת מכסת, אחד וכו 'crosslinking היתרונות העיקריים של שיטת LbL היא היכולת שלה להתאים את הטופוגרפיה של המצע הבסיסי. לכן, בתנאים מבוקרים בשיטה זו יכולה לשמש גם לקבלת משטח כיסוי של מבנים נקבוביים. אם הקולגן משמש כאחד מpolyelectrolytes זה אפשרי להשיג מבני nanofibrillar שיכול לחקות את פני השטח של קרום במרתף. Hydrophobicity של טיטניום מאפשר פיתוח של מבנים כאלה וfibrillarity ניתן לשמר בציפוי עבה 14. יכולים גם להיות נשלטו קובץ מצורף והתנועה של תאים על פני השטח בדרך זו. באמצעות הקפאת חילוץ וציפוי סרט LbL ברצף, ניתן להשיג מבנה שבו תנועת תא יכולה להיות נשלט רוחבי, אורכי circumferentially 15.
כאן אנו מתארים שתי שיטות חדשניות לשינוי שתלי טיטניום באמצעות ההתנהגות הידרופובי שלהם שיכולים להיותהוארך לשינוי של שתלים נקבוביים שונים: א) היווצרות הדרגתיים של micropores בתוך שתלי טיטניום macroporous עם הידרופובי, פולימרים סינטטיים ii) היווצרות של שכבת סרט פולימרים עבה על פני השטח השתל שתומך בגדילת תאים והיווצרות רירית ידי multilayers polyelectrolyte. ניתן להשתמש בשיטות אלה ברצף או בנפרד. הם מספקים מבנים המבטיחים הגירה מבוקרת וארגון המרחבי של תאים מסוגים שונים ברקמות תאיות 16,17. למקרה הספציפי של קנה הנשימה, את התוצאה הרצויה לשתל תהיה קולוניזציה על ידי רקמת fibrovascular בתוך הדרגתיים micropore ללא restenosis וההיווצרות של הציפוי הפנימי של תאי אפיתל ריסים על multilayers polyelectrolyte.
אחת דרכים לשליטה באינטגרציה של שתלים היא לעשות התערבויות כירורגיות קטנות בתקופת האינטגרציה שלהם עם המארח באתרו. על מנת להיות לא מסוגלo להחליט על העיתוי של ההתערבויות, חשוב לקבל מידע על ההשפעות המערכתיות של השתל. חלבון מגיב C (CRP) כבר משמש לניטור של זיהום ותגובה דלקתית במסגרות קליניות. Chromogranin (CGA) יכול לשמש גם באופן דומה ועשויים לספק תוצאות מדויקות יותר כדי לבחון את הרמה של דלקת 18. כדרך אפשרית של התבוננות אינטגרציה שתל מתכתית in vivo, אנו מציגים הליך ניטור רציף של תופעות מערכתיות שתל על ידי אפיון של דגימות דם של בעלי חיים עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) ורצף חלבון שלאחר מכן. שכלול של שיטה זו יכול לשמש גם כדי להתחמק מניתוח היסטולוגית נקודת סיום קבוע. חיתוך היסטולוגית של שתלים מתכתיים הוא תהליך ארוך, מסורבל ויקר, ויכול להתבצע רק בנקודות זמן ספציפיות. בגלל סיבה זו, בדיקות דם המספקים מידע חזק על בריאות השתל מתוכננת היטב, הייתייהיו מסלולים אפשריים כדי להקטין את הניסויים בבעלי חיים כפי שנקבע לפי כללי האיחוד האירופי האחרונים הנוגעים לניסויים בבעלי החיים.
השיטות שהוצגו כאן יכולות לשמש כדי לשפר את הביצועים של שתלים מתכתיים באמצעות functionalization או שיש דרך חלופית של ניטור את השתלים הקיימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מעברי צבע micropore בשתלים מתכתיים Macroporous
- נקה את השתלים (כמו שתלים העשויים מחרוזי טיטניום כיתה רפואיים עם מגוון גודל של מיקרומטר 400-500, Neyco SAS, צרפת) עם אתנול ולאחר מכן sonicate באצטון למשך 15 דקות.
- עיצוב ותבניות טפלון לייצר על פי גודל השתל והצורה (לניסויים סטנדרטיים, תבניות גליליות בקוטר 1.5 ס"מ בגובה של 2 ס"מ משמשות). תבניות צריכה להיות מודולרי, כך שניתן להסיר את החלקים מסוימים במהלך חילוץ. כגון עיצוב עובש מבטיח שליטה על תהליך החילוץ על ידי לאלץ את התנועה של נוזל המיצוי באופן מכוון.
- לשתלים צינורי שנועדו להחליף את קנה הנשימה, את המבנה צריך להיות מורכב משלושה חלקים: א) חלק תחתון כדי לקבוע את גודל השתל, II) mandrel וIII) ליבה חיצונית אשר ניתנת להסרה. בדרך זו, יכול להיווצר שיפוע הגודל הנקבובית מבחוץ כלפי פנימה. <li> הכן את פתרון הפולימר הסינטטי (PLLA): לפתרון PLLA הקפאה / חילוץ צריך להיות מוכן בתערובת בינארית של dioxane ומים (87:13%, V: V).
- מחממים את התערובת עד 60 ° C כדי להשיג פתרון הומוגני. 60 ° C שנבחר כפי שהוא המגבלה גבוהה יותר של ההתנגדות לטמפרטורת מזרקי זכוכית הדיוק שיש לו כדי לשמש לכניסתה של הפתרון לשתלים.
- אם נעשה שימוש בפתרוני ריכוז גבוה (≥ 6%), משקל מולקולריים גבוהים PLLA, להציג את הפתרון לתוך השתל לאחר החימום באופן מיידי. אחרת gelation של הפתרון מתרחש ללא טבילה מלאה.
- חשב את הנפח של תמיסת הפולימר נדרשה בגין הנקבוביות של השתל, לשינוי הדיוק בנפח של הפתרון הקפוא יכול להילקח בחשבון.
- להציג את הפתרון לשתלים עם מזרקים זכוכית דיוק עם 0.1 דיוק μl. הגבול התחתון לריכוז הפולימר הוא3% להיווצרות שיפוע נקבובית לשעתק ואילו הוא הופך להיות קשה להשיג הפצה הומוגני בדגימות העבות מעל 6%. עם זאת, עבור יישומים ספציפיים ניתן להשתמש בו ריכוזים אחרים.
- להקפיא את הדגימות באופן ישיר ב -80 ° C או עם תקופת דגירה מוקדמת של 30 דקות בטמפרטורת חדר. תנאי הקפאה לקבוע באופן חלקי את היווצרות הנקבובית, ובכך ניתן להתאים את תנאי ההקפאה לפי נקבוביות מטרה. לשמור את הדגימות למשך הלילה ב -80 ° C.
- הפקה: לטבול את השתלים ב80% EtOH מראש צונן. לבצע את החילוץ ב -20 ° C במשך לילה. כדי להשיג הדרגתיים נקבוביות, להסיר את כל חלקי עובש למעט mandrel לשתלי צינורי ואת כל החלקים מלבד חלק התחתון של שתלים בצורת דיסק. השתמש באזמל מראש צונן להפרדה קלה יותר של העובש.
- לאחר החילוץ ב -20 ° C למשך לילה 19, להסיר את החלקים הנותרים עובש ואוויר יבש את השתלים. לאפיון שלהנקבוביות הכולל של ניתוח מרקורי Porosimeter המבנה הוא הכרחי. מדידות הראו מרקורי Porosimeter שיאים ברורים שתואמים את הנקבוביות על שני הצדדים של השתל ואת הנקבוביות interdispersed הקטנות יותר. עם זאת את הנתונים חיוניים יותר הוא ההבדל בין porosities של משטחי intraluminal וextraluminal, אשר יכול להיות מנותח על ידי J תמונה להפצת גודל נקבובית עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) 20. לצורך האימות של השיפוע הנקבובית, להקפיא את השבר הדגימות ולבחון את החתך עם SEM.
- בשל אופייה הפתוח הנקבובי של השתלים בשימוש, ואת הקיבולת המשקפת אור של טיטניום, זה אפשרי לעשות את Z-ערימות של תאים שכותרתו בתוך השתלים נקבוביים. לתייג את התאים עם PKH26 או Calcein-AM ולדמיין את השתלים עם מיקרוסקופ לייזר confocal.
2. ציפוי פני השטח של שתלים מתכתיים נקבוביים עם multilayers קולגן / אלגינט
- להצטברותשל multilayers, שחזור הגבוה ביותר מתקבל עם רובוטים טבילה. עם זאת, אם רובוט טבילה אינו זמין ניתן לעשות את הפעולות הבאות באופן ידני.
- השתמש רפואי כיתה קולגן סוג ואלגינט הנתרן. הריכוזים האופטימליים הם 0.5 גר '/ ל' לכל 150 מ"מ NaCl בחיץ ציטרט ב-pH 3.8.
- ממיסים את פתרון קולגן הלילה על מנת להבטיח את ההומוגניות של הפתרון. ה-pH חומצי של 3.8 הכרחית ליציבות הצטברות של השכבות כמבנה אינו יציב לפני crosslinking בpH ניטראלי.
- להפקיד את השכבות על ידי מערכת רובוט טבילה על ידי טבילת השתלים לתוך פתרונות קולגן ואלגינט לחלופין. זמן הפקדת הוא 15 דקות לכל שכבה שלאחר מכן. יש לשטוף את המבנה בשלבים בין תצהיר עם 150 מ"מ NaCl ב-pH 3.8 למשך 5 דקות.
- בעל עיצוב ספציפי לניצול של השתלים עם רובוטים טבילה המשמשים בייצור רב שכבתי polyelectrolyte. להפקיד את השכבות על פני השטח של טיטניום או רק implaNTS או שתלים שונה כאמור בסעיף 1.
- התייצבות של הקרום במרתף לחקות עם genipin: הכן את פתרון crosslinking בחיץ ציטרט dimethylsulfoxide (DMSO) / (150 מ"מ NaCl, pH 3.8) בשעה 01:04 V: יחס V. מגוון רחב של ריכוזים יכול לשמש ו100 מ"מ הוא נאותים לcrosslinking. ממיסים genipin הראשונה ברכיב DMSO ולהוסיף רכיב המים מאוחר יותר, כדי למנוע יצירת גושים.
- Crosslink הדגימות על ידי הטבילה בפתרון crosslinking בין 12-24 שעות. לאחר מכן לשטוף עם כמות שפע של חיץ ציטרט (pH 3.8).
- לאחר שלבי כביסה, לעקר את הדגימות או עם טיפול בקרינת UV (30 דקות) או אמבטיה אנטיביוטיקה / פטריות (פניצילין / סטרפטומיצין, Fungizone).
- הפרמטרים העיקריים הקובעים את איכותו של הקרום במרתף הם לחקות את עוביו והקוטר של הסיבים. לחשב את קטרי הסיבים באמצעות מיקרוסקופית כוח אטומי (AFM) המתקבלות במצב קשר תמונות. לייבש את הדגימות עםזרימת חנקן לפני ההדמיה. לכמת את העובי של לפחות 10 סיבי לכל תמונה כדי לקבוע את העובי הממוצע יפון עם תוכנת J תמונה.
- העובי של הסרטים יכול להיקבע על ידי בדיקות התחלה באמצעות AFM. יבש (COL / ALG) 24 סרטים רבים שכבתיים / COL. שימוש במחט מזרק לגרד את הסרט. לאחר הלוקליזציה של השריטה עם מיקרוסקופ אור, להשיג תמונות עם AFM על 10 משטחים 2 מיקרומטר 10 x בגבול של השריטה. לחשב את הגבהים מהפרופילים שהושגו עם תוכנת AFM, המספק עובי שכבת הסרט.
3. ניטור עקיף של אינטגרציה שתל in vivo על ידי ניתוח של פלזמה דם
- כל האישורים הנדרשים הוועדה צריכים להיות מובן ניסויים בבעלי חיים בהתאם לכללים המסדירים עבור כל מדינה 21. במקרה שלנו המדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה (המועצה הלאומית למחקר, 2010) ואחריו והדואר אישור ועדת אתיקה של האוניברסיטה שטרסבורג מתקבל.
- לבצע את ההשתלה באתר היעד. פרוטוקול ניטור הדם ניתנו כאן שימש להחלפת קנה הנשימה בארנבים לבנים בניו זילנד של כריתת קנה הנשימה 15 מ"מ.
- בעקבות השתלת מעקב יומי הוא הכרחי כגון montioring רווחתם של בעלי החיים (ריפוי סביב אתרי הניתוח, קצב נשימה) הכללי ורישום המשקל שלהם.
- כדי לאמת את בדיקת הדם, להשתמש בשיטה מבוססת היטב כגון בדיקות ELISA לרמות ה-CRP בדם. בדיקות ה-CRP לבעלי חיים רבים זמינות והמבחן הספציפי המשמש לארנבונים מופיע בטבלה 1. כמו כן, השתמש המערבי סופג לקביעת רמות CGA. נוגדנים נגד CGA חד שבטיים (אנטי CGA 47-68) היו בשימוש בפרוטוקול זה.
- לאפיון פלזמה, להשיג דגימות דם מורידי האוזניים של הארנבים. צנטריפוגה ב 5000 סל"ד במשך 20 דקות ב 4 °, ג השתמש supernatant מתקבל לניתוח. בהליך שלנו, בדיקות אלה נעשות על בסיס שבועי, אבל בדיקות תכופות יותר גם אפשרית.
- היפוך שלב טיהור HPLC של תכולת חלבון פלזמה: חלץ את הפלזמה הארנב עם 0.1% של חומצת trifluoroacetic (1:1; V: V). לטהר את התמצית באמצעות HPLC מערכת Dionex (אולטימטיבי 3000; סאניווייל, קליפורניה ארצות הברית) בשלב הפוך 300-5C18-עמודת nucleosil (4 x 250 מ"מ; גודל חלקיקים 5 מיקרומטר, נקבוביות, 300 א).
- רשום את הספיגה ב 214 ו 280 ננומטר. מערכת הממס משמשת היא אני) מרכך: 0.1% (V / V) חומצת trifluoroacetic (TFA) במים ושניים) מרכך ב ': 0.09% (V / V) TFA ב70% (V / V) אצטוניטריל מים.
- השתמש בקצב זרימה של 700 μl / דקות שימוש הדרגתיים לelutions. לאסוף את שברי השיא. לרכז את השברים על ידי אידוי על ידי יישום מהיר ואקום. זה חשוב כדי לעצור את מהירות ואקום לפני היובש מוחלט.
- לתאם את הפסגות שהושגו בשלב נקודות שונות על פני שיתוףUrse תקופת ההשתלה. השתמש בפפטידים המטוהרים המראים מגמות עקביות במהלך ההשתלה לזיהוי אוטומטי על ידי Edman רצף.
- אוטומטי Edman רצף של פפטידים: קבע את רצף N-המסוף של פפטידים מטוהרים על ידי השפלה אוטומטית Edman באמצעות microsequencer Procise. טען את הדגימה למסננים מזכוכית polybrene שטופלו. השלב הבא הוא זיהוי של חומצות אמינו (Phenylthiohydantoin-PTH-XAA) על ידי כרומטוגרפיה בעמודת C 18 (, 200 מ"מ C-18 x 2.1 PTH) 22. לאחר הרצף מתקבל, ניתן לזהות אותו על ידי שימוש בתוכנת מסד נתונים פיצוץ שוויצרי Prot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היווצרות הדרגתיים נקבובית
על ידי שינוי הריכוז של פתרון PLLA, אפשר לשלוט על הגודל של הנקבוביות בצד extraluminal של השתלים. גודל וצורה נקבוביות הושפע באופן משמעותי על ידי הנוכחות של שתלי טיטניום (1A ו-1B דמויות). גודל נקבובית נע 40-100 מיקרומטר וניצול של ריכוזים נמוכים הביאו לנקבוביות קטנות יותר. ואילו, בגודל הנקבובית צד intraluminal נשלט על ידי המיצוי המוגבל והיה בסביבות 9 מיקרומטר 23, פחות מהגודל הממוצע של fibroblasts. על ידי הוספת שלב דגירה בטמפרטורת חדר מבנה נקבובי כפול, שבו הקירות הנקבוביים של נקבוביות הגדולות יותר יש לי ניתן להשיג הנקבוביות שלהם. תכונה זו חשובה לשתלים עבים, כפי שהיא תאפשר את הגז ותנועה תזונתית (איור 1 ג').
היווצרות קרום מרתף Nanofibrillar לחקות
=> "Jove_content" אחרי השיפוע הנקבובית הוקם, אפשר להוסיף קולגן / שכבת סרט אלגינט בחלק העליון של המבנה (איור 2). שכבת הסרט הזה היא יציב על גבי קצף PLLA וזה גם יכול להישמר על פני השטח בהעדר הקצף (איורים 3 א ו 3 ב). סיבי קולגן ננומטריים יוצרים כמו שכבת הסרט גדלה (איור 3 ג). הצמיחה של הסרט היא מעריכי, ובכך ניתן לקבל סרט עבה של כמה מאה ננומטרים (איור 3D).
ניתוח של פלזמה דם עם HPLC ורצף לאחר מכן לאחר ההשתלה
שתלי טיטניום נקבוביים לשלב עם רקמת המארח והם מלאים לחלוטין בין 4-6 שבועות in vivo (איור 4). עם זאת, המשכו של תהליך זה יכול להוביל לrestenosis ובנוכחות של השיפוע הנקבובית בשל מבנה PLLA, אין נוכחות פיברובלסטים נצפתה6 שבועות חרו של השתלה 20. במהלך תקופה זו HPLC ניתוח הראה שיאים ברורים כי להשתנות במהלך זמן ההשתלה. שברי השיא של ריבית רצף ונחוש להיות אלפא ובטא המוגלובין ½ שרשרות (איור 5), שהראו מגמה דומה עם קריאות ה-CRP.
איור 1. שיטה של היווצרות שיפוע נקבובית. הכנת קצף PLLA נקבובי באמצעות שיטת הקפאת חילוץ. micrographs SEM (א) בלי שתלי טיטניום macroporous (חיצוני) (ב) עם שתלי טיטניום macroporous (חיצוני) (ג) עם שתלי טיטניום macroporous (פנימי). נוכחות של השתלים שינתה את המורפולוגיה הנקבובית. (ג', ד ') אותו התהליך יכול להיות Appl מטען חבלה למבנים צינוריים להשיג הדרגתיים נקבובית בשתלים צינורי. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. תכנית של פיתוח השתל הרב התכליתי. החל מ שתלים נקבוביים מבוסס microbead, על ידי תוספת של קצף המבוסס על פולימר סינטטי ניתן לקבל שיפוע גודל נקבובית. הצורה של השיפוע הנקבובית נשלטת באופן חלקי על ידי המבנה של התבניות. בחלק העליון של מבנה זה ניתן להוסיף מבנה דמוי קרום במרתף, שהיה מספק משטח מתאים לקובץ מצורף והיווצרות תאי רירית ב2D.
pload/50533/50533fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50533/50533fig3.jpg "/>
איור 3. היווצרות רב שכבתי Nanofibrillar בשתלי טיטניום כלחקות קולות קרום במרתף. יכול להיווצר multilayers קולגן / אלגינט העבה במיוחד על פני השטח של (A) טיטניום שתלים בלבד (עם גודל חרוז ממוצע של 400-500 מיקרומטר) (ב) כלאיים קצף טיטניום / PLLA. משטח זה (~ 1 מיקרומטר עבה) מספק מצע לקובץ המצורף והתפשטותם של תאי האנדותל (ג') טבע nanofibrillar של multilayers מאופיין AFM ניתוח (אזור סריקה: 30 x 30 מיקרומטר מיקרומטר) (ד) עובי של multilayers נקבע על ידי מבחן שריטה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
jpg "/>
איור 4. אינטגרציה של שתלי טיטניום נקבוביים ב- vivo בארנבים. מכתים Haemotoxylin & Eosin של שתל חתכי explanted () האזורים נקבוביים יכול להיות מלא לחלוטין בתוך תקופה של 4-6 שבועות in vivo (ב ') הרקמה בתוך הנקבובית היא רקמת חיבור בוגרת עם רמה טובה של כלי דם .
איור 5. ניטור של תכולת חלבון של פלזמה במהלך השתלה על ידי HPLC ורצף לאחר מכן. עקומות HPLC היציגים להראות פסגות המתקבלות מדגימות דם של בעלי חיים לאחר 3, 4 ו -6 שבועות של השתלת בהתאמה (למעלה משמאל, ימין למעלה, פינה השמאלית תחתון ). שיא כל מקבילה לחלבון מסוים. את ההבדליםבשיא מתאים לשפע יחסי של חלבון נתון, דבר שניתן לקבוע על ידי רצף (כגון α וSS-המוגלובין ½ רשתות). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדרגתיים נקבובית הם כלים חשובים בהנדסת רקמות ממשק והוא יכול לשמש את המערכת המתוארת כאן לבד או בשילוב עם שתלים מתכתיים כדי ליצור שיפוע נקבובית ללמוד נדידת תאים. המערכת אינה מחייבת כל הגדרה נוספת או ציוד נוסף מלבד מנדף כימי כדי לטפל בממסים אורגניים, ולכן זה יכול להיות מיושם במעבדות ביולוגיה. פולימרים דומים כגון פולי (חומצה גליקולית) (PGA), פולי (לקטית, שיתוף גליקולית) חומצה (PLGA) ופולי (caprolactone) (PCL) יכולים לשמש בשינויים קלים. מבני macroporous אחרים שלא הייתי מתמוססים בממסים אורגניים יכולים לשמש גם. לקבלת גודל נקבובית קטן יותר (בקנה המידה ננומטרי) על משטח אחד, היווצרות שכבת סרט דקה nanoporous נוסף היא גם אפשרית. זו יכולה להיות מושגת על ידי הצבת הראשונה תמיסה מהולה (1%) של הפולימר בחלק העליון של המבנה בתנודתיות גבוהה ממס (כגון כלורופורם) ולאחר מכן גורם להפרדת פאזות מייד על ידי הטבילה בAPפתרון אתנול יור. בדרך זו ניתן להשיג מערכת שיתוף תרבות אשר מבוססת רק חומר אחד.
עיצוב תבנית הטפלון הוא חיוני לשליטה על הגודל הנקבובית כתנועה של נוזל המיצוי נקבעת על ידי זה. התנועה של נוזל המיצוי ושער חליפין בין נוזל המיצוי והממס משפיע על היווצרות של הנקבוביות. השליטה ניתן לשפר עוד יותר על ידי יישום של זרימה למינרית של נוזל המיצוי באמצעות השתל. כמות נוזל מיצוי היא פרמטר חשוב וזה צריך להיות מסודר ביחס לכמות של פולימר בשימוש וגם ביחס לגודלו של השתל. לשתלים גליליים עם עובי 2 מ"מ וקוטר 11 מ"מ יצר של 500 חרוזים טיטניום כיתה רפואיים מיקרומטר אמבטיה חילוץ של 200 מ"ל היא הכרחית. לחקר נדידת תאים, PKH26 היא אפשרות טובה יותר ללימודי הגירה לטווח ארוכים ואילו Calcein-AM מספק תצפית טובה יותר של מורפולוגיה של תאים. קואהntification של תנועת תא בZ-כיוון הוא עקיף במדידה במבחנה של השליטה על תנועה סלולרית. גם מערכת זו יכולה לשמש גם עם תאי האנדותל לכימות של כלי דם במבחנה של השתלים, או על ידי זריעה ישירה או באמצעות מבחני סטנדרטיים באמצעות אנגיוגנזה אנקפסולציה ג'ל 24.
ישנן מספר שיטות היווצרות nanofiber זמינה, כגון electrospinning או הפרדת פאזות, אבל electrospinning של קולגן נחשב בדרך כלל ללפגל סיבי קולגן. ניצול של מבנה מבוסס polyelectrolyte מבטיח מניעת denaturation תוך מתן המבנה הסיבי ההכרחי עם רמה גבוהה של דיוק. גם שיטות LBL קלות יותר להסתגל לצורות שתל מורכבות. שכבות סרט על מבנים נקבוביים שיטות פשוטות כדי לפתח מבחני דמויי Transwell עם שליטה רבה יותר על האינטראקציות בין המרכיבים התאיים. אפשר להתבונן עם confocaמיקרוסקופיה L את השכבה העליונה בשתל. זה יכול לשמש כדי לבחון את האינטראקציה של תאים ראשוניים רלוונטיים עם multilayers במגע עם השתל כמו תאי אפיתל או תאי אנדותל. ניתן להשתמש בתאים מבודדים או 25 או זמינים מסחרי. שכבת הסרט הזה מספקת משטח שבו ניתן לפתח ציפוי פנימי לאיבר צינורי. לדוגמה, במקרה הספציפי הזה המטרה הייתה לפתח קרום מלאכותי לקנה נשימה, ומבנה זה הוצג להיות מתאים לאפיתל נשימה 23.
עובי השכבה מוגדר ברמה שבה הסרט הוא עבה מספיק כדי לפעול כמחסום (24 דו שכבות). בשני שתלי טיטניום טיטניום / PLLA ורק, בשל hydrophobicity של מצע שכבת סרט שטוח יחסית יכולים להיווצר על השתלים, שבו הנקבוביות תורמים ליציבות של הממשק שבין המבנה ושכבת סרט שזה עתה הוקם. בין crosslinking הזמינהthods, crosslinking genipin הוא מתאים ביותר עבור experimentations בעלי החיים. שיטות crosslinking אחרות כגון glutaraldehyde, יכולים לשמש גם EDC / שירותי הבריאות, אבל הם בדרך כלל תוצאה של פחות מצורף תא. אפשרות נוספת היא להשתמש בקולגן photocrosslinkable 26.
רצף חלבון הוא שיטה מבטיחה לניטור שתל, כפי שהוא עשוי לספק יותר בהבנה מעמיקה. בהתאם לאופי של החלבונים המתקבלים, אפשר להסיק את תופעות המערכתיות של ההשתלה וגם לעקוב מקרוב זיהומים אפשריים אשר חשובים במיוחד עבור מקרים בהם השתל הוא לא באזור סגור, כגון במקרה של שתלים קנו נשימה . גילוי מוקדם של זיהומים יכול להוביל למניעת סיבוכים הקשורים לזיהום במועד. פרופיל HPLC יכול לספק מידע נוסף בהשוואה לאפיון יחיד של חלבון נתון כמו CRP או CGA כמו כמה פסגות עם כמה חלבונים של עניין יכול להיות לךאד בשיטה זו. לדוגמה, אלפא ורשתות ½ המוגלובין בטא לארנבים עם שתלים קנו נשימה הראו מגמות דומות עם קריאות ה-CRP במודל החלפת קנה הנשימה המלא שלנו. צדדיות כזו יספק מקום לקביעת השפעה מערכתית דקות בדייקנות רבה עם השיפור של הטכניקות המתוארות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
NE Vrana הנו עובד Protip SAS.
Acknowledgments
מחברים מבקשים להודות לד"ר אנדרה ודר וניקולא פרין לשתלי טיטניום ייצור, ק Benmlih להצטברות של תבניות הטפלון וד"ר ג? ךבוסט על עזרתו עם ניסויים בבעלי החיים. כמו כן, אנו מכירים באזור אלזס וPMNA (קוטב MATERIAUX et d'Nanosciences אלזס) לתרומה כספית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss | ||
Table 1. List of Materials and Reagents. |
|||
References
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).
- Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications. Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).
- Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).
- Janssen, L. M., et al. Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).
- Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28, 2810-2820 (2007).
- Schultz, P., et al. Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis. Biomaterials. 26, 2621-2630 (2005).
- Müller, S., et al. VEGF-Functionalized Polyelectrolyte Multilayers as Proangiogenic Prosthetic Coatings. Advanced Functional Materials. 18, 1767-1775 (2008).
- Mills, R. J., Frith, J. E., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J. Effect of Geometric Challenges on Cell Migration. Tissue Engineering Part C-Methods. 17, 999-1010 (2011).
- O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26, 433-441 (2005).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26, 5474-5491 (2005).
- Budyanto, L., Goh, Y. Q., Ooi, C. P. Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid - liquid phase separation and freeze extraction. J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Chaubaroux, C., et al. Collagen-Based Fibrillar Multilayer Films Cross-Linked by a Natural Agent. Biomacromolecules. 13, 2128-2135 (2012).
- Huang, Y., Siewe, M., Madihally, S. V. Effect of spatial architecture on cellular colonization. Biotechnology and Bioengineering. 93, 64-75 (2006).
- Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Unger, R. E. Co-culture systems for vascularization - Learning from nature. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, 291-299 (2011).
- Lavalle, P., et al. Dynamic Aspects of Films Prepared by a Sequential Deposition of Species: Perspectives for Smart and Responsive Materials. Advanced Materials. 23, 1191-1221 (2011).
- Zhang, D., et al. Serum concentration of chromogranin A at admission: An early biomarker of severity in critically ill patients. Annals of Medicine. 41, 38-44 (2009).
- Goh, Y., Ooi, C. Fabrication and characterization of porous poly(l -lactide) scaffolds using solid - liquid phase separation. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2445-2452 (2008).
- Vrana, N. E., et al. Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions. Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).
- Dupret-Bories, A., et al. Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep. J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).
- Gasnier, C. Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules. Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).
- Vrana, N. E. Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement. PLoS ONE. 6, e20480 (2011).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032 (2012).
- Dong, C. -M., et al. Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen. Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).
