Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تعديل متعدد مقياس من يزرع لامع مع التدرجات مسام، مركبات البولي الكتروليت والمراقبة غير المباشرة Published: July 1, 2013 doi: 10.3791/50533
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,3, 1,3, 1,3
1Biomatériaux et Bioingénieriee, INSERM, 2Service Oto-Rhino-Laryngologie, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg, 3Faculté de Chirurgie Dentaire, Université de Strasbourg

Summary

في هذا الفيديو، ونحن سوف تظهر تقنيات التغيير لزراعة المعدنية التي يسهل اختراقها لتحسين وظائفها والسيطرة على الهجرة الخلية. وتشمل تقنيات تطوير التدرجات المسام للسيطرة على حركة الخلية في 3D، وإنتاج الغشاء القاعدي يقلد للسيطرة على حركة الخلية في 2-D. أيضا، يتم وصف طريقة تعتمد على HPLC لرصد التكامل زرع في الجسم الحي عن طريق تحليل البروتينات في الدم.

Abstract

وتستخدم على نطاق واسع يزرع لامع، خاصة يزرع التيتانيوم، في التطبيقات السريرية. الأنسجة في النمو والتكامل لهذه الغرسات في الأنسجة هي المعالم الهامة لنتائج سريرية ناجحة. من أجل تحسين التكامل الأنسجة، والتي يجري وضعها يزرع المعدنية التي يسهل اختراقها. فتح المسامية من الرغاوي المعدني هو مفيد جدا، لأن المناطق المسام يمكن functionalized دون المساس الخواص الميكانيكية للهيكل كله. نحن هنا وصف هذه التعديلات باستخدام غرسات التيتانيوم التي يسهل اختراقها على أساس بلي التيتانيوم. باستخدام الخصائص الفيزيائية الكامنة مثل hydrophobicity من التيتانيوم، فمن الممكن الحصول على التدرجات المسام مسعور يزرع داخل microbead معدني مقرها، وفي الوقت نفسه لدينا تقليد الغشاء القاعدي يعتمد على ماء، والبوليمرات الطبيعية. تتشكل التدرجات المسام 3D بواسطة البوليمرات الاصطناعية مثل حمض بولي-L-اللبنيك (PLLA) من خلال طريقة تجميد استخراج. 2D nanofibrillar سورتتشكل الوجوه باستخدام الكولاجين / الجينات تليها خطوة يشابك مع crosslinker الطبيعية (genipin). تم بناء هذا الفيلم nanofibrillar من قبل طبقة بعد طبقة (LBL) طريقة ترسب اثنين من الجزيئات المشحونة معاكس، والكولاجين والجينات. وأخيرا، زرع حيث يمكن استيعاب مناطق مختلفة أنواع مختلفة من الخلايا، وهذا أمر ضروري بالنسبة لكثير من الأنسجة المتعددة الخلايا، يمكن الحصول عليها. من قبل، هذه الحركة الخلوية الطريق في اتجاهات مختلفة حسب أنواع مختلفة من الخلايا يمكن السيطرة عليها. يوصف مثل هذا النظام لحالة معينة من القصبة الهوائية التجديد، ولكن يمكن تعديلها للأجهزة المستهدفة الأخرى. وضعت تحليل للهجرة الخلية والطرق الممكنة لخلق التدرجات المسام مختلفة. الخطوة التالية في تحليل مثل هذه الغرسات هو التوصيف الخاصة بهم بعد الزرع. ومع ذلك، التحليل النسيجي من يزرع المعدني هو عملية طويلة ومرهقة، وبالتالي لرصد رد فعل المضيف ليزرع المعدنية في الجسم الحي على إعطاءكما يتم وصف أسلوب lternative يعتمد على رصد بروتينات الدم CGA ومختلفة. هذه الطرق يمكن استخدامها لتطوير في المختبر الهجرة حسب الطلب والاختبارات الاستعمار ويمكن استخدامها أيضا لتحليل يزرع معدني functionalized في الجسم الحي دون علم الأنسجة.

Introduction

حاليا يزرع المعدنية المتوفرة هي مناسبة للتطبيقات الحاملة، ولكن من غير تحلل يتطلب التصاميم التي تضمن واجهة قوية مع الأنسجة المحيطة بهم 1. من خلال توفير البنى التي تسهل الخلوية في النمو والاستعمار في الجسم الحي، عمر يزرع معدني يمكن رفعه 2. يزرع المعدنية التي يسهل اختراقها بشكل علني والمواد اللازمة لهندسة الأنسجة واجهة واعدة وأيضا لضمان الاستعمار جيدة من يزرع. وقد تم استخدامها بنشاط كما زرع العظام وكذلك زرع القصبة الهوائية 3-5. ومع ذلك، لا تزال هناك مشاكل التي تحتاج إلى حلها مثل دقة السيطرة على حركة الخلية في مناطق المسام. فشل في السيطرة على هذه العملية قد تؤدي إلى استعمار غير مكتملة في نهاية واحدة وعودة التضيق في الآخر. أيضا المزيد من functionalization من هذه الغرسات هو ضروري لتحقيق وظائف أعلى مثل، والتسليم من عوامل النمو،الأوعية الدموية وجهت وحركة في وقت واحد من أنواع مختلفة من الخلايا 6-8. لزراعة القصبة الهوائية، وهذا أمر بالغ الأهمية لأن استعمار زرع من قبل الأنسجة أوعية دموية أمر مرغوب فيه. ومع ذلك، فإن الأنسجة غير المنضبط في نمو إلى تجويف القصبة الهوائية غير مرغوب فيه لأنه يقلل المباح الزرع.

احتمال واحد للسيطرة على حركة الخلية هو حجم الاستبعاد. من خلال معرفة حجم الخلايا المستهدفة وقدرتها على التفاعل مع البوليمر الاصطناعية نظرا لأنها من الممكن تطوير التدرجات من المسامات التي يمكن أن تحدد على نحو فعال عمق حركة الخلية. على سبيل المثال عن طريق إنشاء بنية المسام التي هي كبيرة بما يكفي لدخول خلايا النسيج الضام مثل الخلايا الليفية extraluminally، ولكن صغيرة بما فيه الكفاية (أقل من 10 ميكرون) لمنع حركتهم intraluminally والرقابة الفعالة على الاستعمار من زرع أنبوبي يمكن تحقيقه.

من الأساليب المتاحة خلق المسام مثل تجميد dryiنانوغرام، الرشح الجسيمات والغاز رغوة 9،10، وأسهل طريقة للتكيف لتشكيل سريع من التدرجات المسام مع الحد الأدنى من المعدات اللازمة لتجميد استخراج 11. في هذه الطريقة، يتم تجميد حل البوليمر في خليط ثنائي من مذيب عضوي والمياه. بعد ذلك، يتم تبادل المذيب عن طريق الاستخراج عن طريق السائل قبل المبردة غير قابلة للامتزاج مثل الايثانول. تجميد وشروط استخراج تحديد شكل وحجم المسام وإذا تم استخراج بطريقة حيث يمكن التحكم في حركة الحل استخراج، يمكن أن حجم المسام والشكل يكون التضمين إتجاهي.

الخطوة الثانية لأنسجة متعددة الخلايا هو تشكيل الحواجز التي يسهل اختراقها بين أنواع مختلفة من الخلايا للسيطرة على تفاعلها. وهذا أمر ضروري لمعرفة مدى توافر microenvironments مختلفة لأنواع مختلفة من الخلايا اعتمادا على متطلباتهم 12،13 أيضا. القصبة الهوائية هي جهاز أنبوبي الذي يربط الحنجرة مع الشعبة الهوائيةط. أنه يحتوي على بطانة الداخلية كاذب ظهارة الهدبية مع الخلايا الكأسية interdispersed التي تنتج المخاط. يتم الحفاظ على هيكل 3D والاستقرار من القصبة الهوائية بواسطة غضروف على شكل C-حلقات. وهكذا، في القصبة الهوائية الاصطناعية ينبغي أن يكون هناك تقاطع المعرفة بين النسيج الضام والطبقة الظهارية الهدبية. في حين أن هيكل 3D من الضروري بالنسبة للجزء النسيج الضام، وهجرة الخلايا الظهارية يتطلب غشاء مثل الطابق السفلي سطح لتحقيق حركة الاتجاه وإغلاق الجرح. متضاعف الكتروليتي أفلام متعددة الطبقات (PEMs) هي خيار واحد يمكن الآن الحصول يقلد الغشاء القاعدي. طريقة طبقة تلو طبقة (LBL) هو عملية متعددة الجوانب للحصول على طلاء سطح رقيقة وظيفية. لأنه يقوم على التفاعلات كهرباء من اثنين من مركبات البولي الكتروليت اتهم معاكس وعلى تراكم بطريقة متسلسلة للحصول على طلاء سطح النانو التي يمكن أن تختلف ببساطة عن طريق تغيير المتغيرات مثل الأنواع متضاعف الكتروليتي، ودرجة الحموضة خصائص،عدد طبقة، إضافة طبقة متوجا، الخ يشابك واحدة من المزايا الرئيسية لأسلوب LBL هو قدرته على مطابقة للتضاريس الركيزة الأساسية. وهكذا، تحت ظروف خاضعة للرقابة هذه الطريقة يمكن أن تستخدم أيضا للحصول على تغطية سطح الهياكل التي يسهل اختراقها. إذا تم استخدام الكولاجين باعتبارها واحدة من مركبات البولي الكتروليت أنه من الممكن الحصول على هياكل nanofibrillar التي يمكن أن تحاكي سطح الغشاء القاعدي. وhydrophobicity من التيتانيوم يمكن تطوير مثل هذه الهياكل وfibrillarity يمكن الحفاظ عليها في طبقات سميكة 14. ويمكن أيضا بهذه الطريقة يمكن التحكم المرفق وحركة الخلية على السطح. باستخدام تجميد استخراج وLBL طلاء الفيلم بالتتابع، هيكل حيث حركة الخلية يمكن التحكم أفقيا، طوليا ومحيطي ويمكن الحصول على 15.

نحن هنا وصف طريقتين تعديل رواية لزراعة التيتانيوم باستخدام سلوكهم مسعور التي يمكن أن تكونمدد لتعديل مختلف يزرع التي يسهل اختراقها: ط) تشكيل التدرجات من micropores داخل يزرع التيتانيوم ماكروبوروس مع مسعور، والبوليمرات الاصطناعية الثاني) تشكيل طبقة فيلم البوليمرية سميكة على سطح الزرع التي تدعم نمو الخلايا وتشكيل بطانة بواسطة متضاعف الكتروليتي متعددة الطبقات. هذه الأساليب يمكن استخدامها بشكل تسلسلي أو بشكل منفصل. أنها توفر الهياكل التي تضمن الهجرة الخاضعة للرقابة والتنظيم المكاني للأنواع مختلفة من الخلايا في الأنسجة المتعددة الخلايا 16،17. لحالة معينة من القصبة الهوائية، فإن النتيجة المرجوة لعملية الزرع تكون الاستعمار من قبل الأنسجة ليفي وعائي داخل التدرجات مسم مكروي دون عودة التضيق وتشكيل البطانة الداخلية للخلايا الظهارية مهدبة على متضاعف الكتروليتي متعددة الطبقات.

طريقة واحدة للسيطرة على التكامل من يزرع هو أن تفعل التدخلات الجراحية الصغيرة خلال الفترة من اندماجهم مع المضيف في الموقع. من أجل أن تكون قادرة رس اتخاذ قرار بشأن توقيت التدخلات، من المهم الحصول على معلومات بشأن الآثار النظامية للزرع. بروتين سي التفاعلي (CRP) قد استخدمت لرصد العدوى والاستجابة الالتهابية في المرافق الصحية. كروموغرانين A (CGA) يمكن أن تستخدم أيضا بطريقة مماثلة، ويمكن أن توفر نتائج أكثر دقة للاطلاع على مستوى من التهاب 18. كوسيلة ممكنة للمراقبة التكامل زرع المعدنية في الجسم الحي، فإننا نقدم إجراء الرصد المستمر لآثار جهازية زرع من قبل توصيف عينات دم الحيوان يعانون من ارتفاع ضغط اللوني السائل (HPLC) وتسلسل البروتين اللاحقة. وضع هذه الطريقة يمكن استخدامها للتهرب من التحليل النسيجي نقطة النهاية العادية. القطع النسيجية من يزرع المعدني هو، عملية مرهقة ومكلفة وطويلة لا يمكن إجراؤها إلا في نقطة زمنية محددة. نظرا لهذا السبب، مصممة تصميما جيدا اختبارات الدم توفر معلومات قوية حول صحة زرع سوفتكون الطرق الممكنة لتقليل التجارب على الحيوانات وفقا لما قررته قواعد الاتحاد الأوروبي الأخيرة بشأن التجارب على الحيوانات.

الأساليب المقدمة هنا يمكن استخدامها لتحسين أداء يزرع المعدنية عبر functionalization أو أن يكون وسيلة بديلة للرصد يزرع القائمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد التدرجات مسم مكروي في يزرع لامع ماكروبوروس

  1. تنظيف يزرع (مثل يزرع مصنوعة من التيتانيوم الطبي الخرز الصف مع مجموعة من حجم ميكرون 400-500، Neyco SAS، فرنسا) مع الإيثانول وثم يصوتن في الأسيتون لمدة 15 دقيقة.
  2. تصميم وتصنيع قوالب تفلون وفقا لحجم وشكل زرع (للتجارب القياسية، وتستخدم قوالب اسطوانية من 1.5 سم القطر مع ارتفاع 2 سم). يجب أن تكون قوالب وحدات، بحيث أجزاء معينة يمكن إزالتها أثناء الاستخراج. مثل هذا التصميم العفن يضمن السيطرة على عملية الاستخراج عن طريق إجبار حركة السوائل استخراج بطريقة موجهة.
  3. لزراعة أنبوبي صممت لتحل محل القصبة الهوائية، وينبغي أن تتألف بنية من ثلاث قطع: ط) والجزء السفلي لتحديد حجم الغرسة والثاني) مغزل والثالث) واللب الخارجي الذي هو قابل للنقل. بهذه الطريقة، يمكن تشكيل التدرج حجم المسام من الخارج نحو الداخل.
    4. <لى> تحضير البوليمر الاصطناعية (PLLA) الحل: لذوي الاحتياجات تجميد / استخراج حل PLLA أن تكون مستعدة في خليط ثنائي من ديوكسان والماء (87:13٪، والخامس: ت).
  4. تسخين الخليط إلى 60 درجة مئوية وذلك للحصول على حل متجانسة. 60 ° C اختيارها كما هو حد أعلى للمقاومة لدرجات الحرارة والمحاقن الزجاج الدقة التي لابد من استخدامها لإدخال الحل في يزرع.
  5. إذا تم استخدام تركيز عالية (≥ 6٪)، وارتفاع الجزيئية حلول PLLA الوزن، ويعرض الحل في زرع بعد التسخين على الفور. وإلا دبق من الحل يحدث دون الانغماس الكامل.
  6. حساب حجم حل البوليمر اللازمة فيما يتعلق المسامية من عملية الزرع، لتغيير دقة في حجم الحل المجمدة يمكن أن تؤخذ بعين الاعتبار.
  7. أعرض الحل في يزرع مع المحاقن الزجاج الدقة مع دقة 0.1 ميكرولتر. الحد الأدنى لتركيز البوليمر هو3٪ لاستنساخه تشكيل التدرج المسام حين يصبح من الصعب الحصول على توزيع متجانس في عينات سميكة فوق 6٪. ومع ذلك، بالنسبة لتطبيقات معينة تركيزات أخرى يمكن استخدامها.
  8. تجميد العينات إما مباشرة في -80 درجة مئوية أو مع فترة حضانة مسبقة من 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. شروط تجميد تحديد جزئيا تشكيل المسام، وبالتالي فإن ظروف التجميد يمكن تعديلها وفقا لالمسامية الهادفة. الحفاظ على العينات ليلة وضحاها في -80 درجة مئوية.
  9. استخراج: تزج يزرع في 80٪ ETOH قبل المبردة. تنفيذ استخراج عند درجة حرارة -20 درجة مئوية خلال الليل. للحصول على المسامية التدرجات، إزالة كافة أجزاء القالب باستثناء مغزل ليزرع أنبوبي وجميع الأجزاء ما عدا الجزء السفلي للقرص يزرع على شكل. استخدام مشرط قبل المبردة لفصل أسهل من القالب.
  10. بعد استخراج عند درجة حرارة -20 درجة مئوية خلال الليل 19، إزالة الأجزاء المتبقية العفن والهواء الجاف ويزرع. لتوصيفالمسامية العامة للبنية تحليل porosimeter الزئبق هو ضروري. وأظهرت قياسات الزئبق Porosimeter قمم المتميزة التي تتوافق مع المسام على كلا الجانبين من زرع والمسام interdispersed أصغر. ومع ذلك فإن البيانات أكثر أهمية هو الفرق بين مسامية الأسطح داخل اللمعة وextraluminal، والتي يمكن تحليلها بواسطة J صورة لتوزيع حجم المسام مع المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) 20. للتحقق من التدرج المسام، وتجميد كسر العينات ومراقبة المقطع العرضي مع SEM.
  11. نظرا لطبيعة المسامية المفتوحة للزراعة المستخدمة، وقدرة يعكس ضوء التيتانيوم، فمن الممكن أن تفعل Z-أكوام من الخلايا المسمى داخل يزرع التي يسهل اختراقها. تسمية الخلايا مع PKH26 أو Calcein-AM وتصور يزرع مع المجهري ليزر متحد البؤر.

2. طلاء سطح لامع يزرع المليئة بالثغرات مع الكولاجين / الجينات متعددة الطبقات

  1. لتراكممن متعددة الطبقات، يتم الحصول على أعلى استنساخ مع غمس الروبوتات. ومع ذلك، إذا روبوت غمس غير متوفرة هذه الخطوات يمكن القيام بذلك يدويا.
  2. استخدام الطبي نوع الكولاجين الصف الأول والجينات الصوديوم. تركيزات الأمثل هي 0.5 جم / لتر لكل 150 ملي مول كلوريد الصوديوم في في المخزن سيترات في درجة الحموضة 3.8.
  3. حل الحل الكولاجين بين عشية وضحاها لضمان تجانس الحل. الرقم الهيدروجيني الحمضية من 3.8 هو ضروري لاستقرار تراكم طبقات كهيكل غير مستقر قبل يشابك في الرقم الهيدروجيني محايدة.
  4. إيداع الطبقات من خلال نظام الروبوت غمس بغمر يزرع في حلول الكولاجين والجينات بدلا من ذلك. الوقت ترسب هو 15 دقيقة لكل طبقة لاحقة. شطف هيكل في الخطوات بين ترسب مع 150 ملي مول كلوريد الصوديوم عند أس هيدروجيني 3.8 لمدة 5 دقائق.
  5. تصميم حامل محددة للاستخدام من يزرع مع غمس الروبوتات المستخدمة في إنتاج متعدد الطبقات متضاعف الكتروليتي. إيداع طبقات على سطح إما التيتانيوم impla فقطNTS أو يزرع تعديل كما هو موضح في القسم 1.
  6. استقرار الغشاء القاعدي تقليد مع genipin: إعداد الحل يشابك في Dimethylsulfoxide (DMSO) / العازلة سيترات (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 3.8) في 01:04 الخامس: نسبة الخامس. هناك مجموعة واسعة من تركيزات يمكن استخدامها و 100 ملي كافية ليشابك. حل genipin الأول في مكون DMSO وإضافة عنصر المياه في وقت لاحق لتجنب تراكمها.
  7. تشعبي العينات من قبل الانغماس في حل يشابك بين 12-24 ساعة. شطف بعد ذلك مع كمية وفيرة من العازلة سيترات (الرقم الهيدروجيني 3.8).
  8. بعد غسل الخطوات، تعقيم العينات إما مع العلاج بالأشعة فوق البنفسجية (30 دقيقة) أو حمام مضاد حيوي / مضاد للفطريات (البنسلين / الستربتوميسين، Fungizone).
  9. المعالم الرئيسية التي تحدد نوعية الغشاء القاعدي تقليد هي سماكة والقطر من الألياف. حساب أقطار الألياف باستخدام المجهر الذري (AFM) الصور التي تم الحصول عليها القوة في وضع الاتصال. تجفيف عينات معتدفق النيتروجين قبل التصوير. قياس سمك لا يقل عن 10 ألياف في الصورة لتحديد متوسط ​​سماكة ليفية مع صورة J البرمجيات.
  10. سمك من الأفلام يمكن تحديده من خلال الاختبارات الصفر باستخدام AFM. الجافة (COL / ALG) 24 أفلام متعددة الطبقات / COL. استخدام إبرة حقنة الى نقطة الصفر الفيلم. بعد توطين الصفر مع ضوء المجهر، الحصول على صور مع AFM في 10 × 10 ميكرون 2 السطوح على الحدود من نقطة الصفر. حساب مرتفعات من التشكيلات الجانبية التي تم الحصول عليها مع البرنامج AFM، الذي يوفر سماكة طبقة الفيلم.

3. الرصد غير المباشرة للتكامل زرع في الجسم الحي بواسطة تحليل بلازما الدم

  1. وينبغي اتخاذ جميع الموافقات اللازمة لجنة التجارب على الحيوانات وفقا للقواعد التي تنظم في كل بلد 21. في حالتنا تم اتباع دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (المجلس القومي للبحوث، 2010) والرابعةيتم الحصول على موافقة (ه) من جامعة لجنة أخلاقيات ستراسبورغ.
  2. تنفيذ غرس في الموقع المستهدف. تم استخدام بروتوكول مراقبة الدم تعطى هنا لاستبدال القصبة الهوائية في نيوزيلندا أرانب بيضاء 15 مم استئصال القصبة الهوائية.
  3. بعد الزرع والمتابعة اليومية أمر ضروري مثل montioring رفاه من الحيوانات (الشفاء حول المواقع الجراحية، ومعدل التنفس) العام وتسجيل من وزنهم.
  4. للتحقق من صحة اختبار الدم، واستخدام أسلوب راسخة مثل اختبارات ELISA لمستويات بروتين سي التفاعلي في الدم. اختبارات CRP لكثير من الحيوانات متوفرة ويتم سرد اختبار محددة تستخدم للأرانب في الجدول 1. وبالمثل، استخدم الغربية النشاف لتحديد مستويات CGA. واستخدمت الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للCGA (المضادة للCGA 47-68) في هذا البروتوكول.
  5. لتوصيف البلازما، والحصول على عينات الدم من الأوردة الأذنية من الأرانب. الطرد المركزي في 5000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة على 4 درجات؛ C. استخدام طاف الحصول عليها للتحليل. في إجراءاتنا، وتتم هذه الاختبارات على أساس أسبوعي، ولكن التجارب على نحو أكثر تواترا من الممكن أيضا.
  6. عكس المرحلة HPLC تنقية للمحتوى بروتين البلازما: استخراج البلازما أرنب مع 0.1٪ من حمض trifluoroacetic (1:1؛ V: V). تنقية استخراج باستخدام نظام HPLC DIONEX (في نهاية المطاف 3000؛ ساني فيل، كاليفورنيا الولايات المتحدة الأمريكية) على nucleosil عكس المرحلة 300-5C18-العمود (4 × 250 مم؛ حجم الجسيمات 5 ميكرون؛ المسامية، 300 أ).
  7. تسجيل الامتصاصية في 214 و 280 نانومتر. النظام المذيبات المستخدمة هي أنا) مذيب ج: 0.1٪ (V / V) حمض Trifluoroacetic (TFA) في الماء والثاني) المذيبات B: 0.09٪ (V / V) في TFA 70٪ (V / V) في المياه الأسيتونتريل.
  8. استخدام معدل تدفق 700 ميكرولتر / دقيقة باستخدام تدرجات لelutions. جمع الكسور الذروة. تركيز الكسور عن طريق التبخر من خلال تطبيق سرعة فراغ. فمن المهم لوقف سرعة فراغ قبل جفاف كاملة.
  9. ربط القمم التي تم الحصول عليها في مختلف الوقت نقطة خلال التعاونURSE من فترة الزرع. استخدام الببتيدات النقية التي تظهر اتجاهات متناسقة أثناء زرع لتحديد الهوية من جانب التلقائي Edman التسلسل.
  10. التلقائي Edman تسلسل الببتيدات: تحديد تسلسل N-محطة من الببتيدات تنقيته من خلال تدهور Edman التلقائي باستخدام microsequencer Procise. تحميل عينة لمرشحات الألياف الزجاجية المعالجة polybrene. الخطوة التالية هي تحديد الأحماض الأمينية Phenylthiohydantoin (PTH-XAA) بواسطة اللوني على عمود C 18 (PTH C-18، 2.1 × 200 مم) 22. بعد يتم الحصول على تسلسل، ويمكن التعرف عليه من قبل البرامج انفجار باستخدام قاعدة بيانات SWISS بروت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تشكيل التدرجات المسام

عن طريق تغيير تركيز المحلول PLLA، فمن الممكن السيطرة على حجم المسام على الجانب extraluminal من يزرع. وقد تأثر حجم المسام وشكل ملحوظ من خلال وجود عملية زرع التيتانيوم (أرقام 1A 1B و). وتراوحت أحجام المسام 40-100 ميكرون واستخدام تركيزات أقل أسفرت المسام أصغر. في حين، في داخل اللمعة الجانب حجم المسام كان يحكمها استخراج المقيدة وكان حوالي 9 ميكرون 23، أي أقل من متوسط ​​حجم الخلايا الليفية. بإضافة خطوة الحضانة في درجة حرارة الغرفة بنية مسامية مزدوجة، حيث مسام الجدران من مسام أكبر ديك ويمكن الحصول على المسامية الخاصة بهم. هذه الميزة مهمة لزراعة سميكة، كما من شأنه أن يسهل حركة المواد الغذائية والغاز (الشكل 1C).

Nanofibrillar الغشاء القاعدي-تحاكي تشكيل

= "jove_content"> بعد تشكيل التدرج المسام، فمن الممكن لإضافة الكولاجين / طبقة فيلم ملح الجيني على الجزء العلوي من هيكل (الشكل 2). هذا الفيلم هو طبقة مستقرة على رأس رغوة PLLA ويمكن أيضا أن يتم الحفاظ على السطح في غياب رغوة (أرقام 3A و3B). ألياف الكولاجين النانو تشكل مع نمو طبقة فيلم (الشكل 3C). نمو الفيلم هو الأسي، وبالتالي فيلم سميكة من عدة مئات من نانومتر ويمكن الحصول على (الشكل 3D).

تحليل بلازما الدم مع HPLC والتسلسل اللاحق بعد الزرع

يزرع التيتانيوم التي يسهل اختراقها الاندماج مع الأنسجة المضيفة وتمتلئ تماما بين 4-6 أسابيع في الجسم الحي (الشكل 4). ومع ذلك، يمكن استمرار هذه العملية تؤدي إلى عودة التضيق وبحضور من التدرج المسام نظرا لهيكل PLLA، لم يلاحظ أي وجود الخلايا الليفية علىأي fter 6 أسابيع من زرع 20. خلال هذه الفترة أظهر تحليل HPLC قمم المتميزة التي تتقلب خلال وقت الزرع. والتسلسل الكسور ذروة الفائدة ومصممة على أن تكون ألفا وبيتا الهيموجلوبين ½ السلاسل (الشكل 5)، والتي أظهرت اتجاها مماثلا مع قراءات CRP.

الشكل 1
الشكل 1. طريقة تشكيل التدرج المسام. إعداد الرغاوي PLLA التي يسهل اختراقها عبر طريقة تجميد استخراج. الميكروسكوب SEM (A) دون زرع التيتانيوم ماكروبوروس (الخارجي) (B) مع زرع التيتانيوم ماكروبوروس (الخارجي) (C) مع زرع التيتانيوم ماكروبوروس (الداخلية). بحضور يزرع تغيير التشكل المسام. (C، D) نفس العملية يمكن أن تكون APPL العبوات الناسفة لتركيبات أنبوبية للحصول التدرجات في المسام يزرع أنبوبي. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. مخطط تطوير زرع متعدد الوظائف. ابتداء من microbead يزرع التي يسهل اختراقها مقرها، من خلال إضافة البوليمر المستندة رغوة الاصطناعية ويمكن الحصول على تدرج لوني حجم المسام. يتم التحكم شكل التدرج المسام جزئيا هيكل قوالب. على رأس هذا الهيكل قبو يشبه غشاء هيكل يمكن أن تضاف، الذي من شأنه أن يوفر سطح مناسب لمرفق الخلية وتكوين بطانة في 2D.

pload/50533/50533fig3highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50533/50533fig3.jpg "/>
الشكل (3). Nanofibrillar تشكيل متعدد الطبقات على غرسات التيتانيوم وميميك الغشاء القاعدي. سميكة الكولاجين / الجينات متعددة الطبقات يمكن تشكيلها على وجه التحديد على سطح (A) التيتانيوم يزرع فقط (بمتوسط ​​حجم حبة من ميكرون 400-500) (B) التيتانيوم / PLLA الهجينة رغوة. هذا السطح (~ 1 ميكرون سميكة) يوفر ركيزة للمرفق وانتشار الخلايا البطانية (C) وتتميز طبيعة nanofibrillar من متعددة الطبقات بواسطة AFM تحليل (منطقة المسح الضوئي: 30 ميكرومتر × 30 ميكرون) (D) سمك يتم تحديد متعددة الطبقات بواسطة اختبار نقطة الصفر. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

JPG "/>
الشكل 4. التكامل من يزرع التيتانيوم التي يسهل اختراقها في الجسم الحي في الأرانب. Haemotoxylin ويوزين تلطيخ من زرع المقاطع العرضية explanted (أ) المناطق التي يسهل اختراقها ويمكن ملء تماما في غضون فترة من 4-6 أسابيع في الجسم الحي (ب) الأنسجة داخل المسام هو النسيج الضام ناضجة مع مستوى جيد من الأوعية الدموية .

الرقم 5
الشكل 5. رصد محتوى البروتين من البلازما على مدى لغرس بواسطة HPLC والتسلسل اللاحقة. تظهر منحنيات HPLC ممثل القمم التي تم الحصول عليها من عينات دم من الحيوانات بعد 3 و 4 و 6 أسابيع من الزرع على التوالي (أعلى اليسار، أعلى اليمين، أسفل اليسار ). كل الذروة يتوافق مع بروتين معين. الخلافاتفي ذروة تتوافق مع الوفرة النسبية للبروتين معين، والذي يمكن تحديده عن طريق التسلسل (مثل α و SS-الهيموغلوبين ½ السلاسل). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التدرجات المسام هي أدوات هامة في هندسة الأنسجة واجهة والنظام الموصوف هنا يمكن استخدامها وحدها أو بالاشتراك مع يزرع المعدنية لتشكيل التدرج المسام لدراسة الهجرة الخلية. النظام لا يتطلب أي إعداد إضافية أو إضافات إلا غطاء الدخان الكيميائية لمعالجة المذيبات العضوية، وبالتالي فإنه يمكن تطبيقها في مختبرات البيولوجيا. البوليمرات مماثلة مثل بولي (حمض الجليكوليك) (PGA)، بولي (اللبنيك-CO-الجليكوليك) حمض (PLGA) وبولي (caprolactone) (PCL) يمكن استخدامها مع تعديلات طفيفة. ويمكن أيضا هياكل ماكروبوروس الأخرى التي لن تذوب في المذيبات العضوية يتم استخدامها. للحصول على أحجام المسام أصغر (في النانو) على سطح واحد، وهي رقيقة نانوية مسامية تشكيل طبقة إضافية الفيلم هو ممكن أيضا. ويمكن الحصول على ذلك عن طريق وضع أول محلول مخفف (1٪) من البوليمر على الجزء العلوي من هيكل في مذيب شديدة التقلب (مثل الكلوروفورم) ومن ثم تسبب على الفور مرحلة فصل بغمر في APلدى عودتهم حل الإيثانول. بهذه الطريقة نظام الثقافة المشتركة التي تقوم مادة واحدة فقط يمكن الحصول عليها.

تصميم قالب تفلون أمر بالغ الأهمية من أجل السيطرة على حجم المسام كما يتم تحديد حركة السوائل الاستخراج عن طريق هذه. حركة السوائل الاستخراج وسعر الصرف بين السائل واستخراج المذيب تؤثر على تشكيل المسام. يمكن السيطرة تحسينها من خلال تطبيق تدفق الصفحي من السائل استخراج من خلال زرع. كمية السائل المستخلص هو معلمة هامة وينبغي ترتيب ذلك مع الاحترام لكمية من البوليمر المستخدمة وأيضا فيما يتعلق حجم الزرع. لزراعة أسطواني مع سمك 2mm و 11 مم تتكون من 500 ميكرون الطبية الخرز التيتانيوم الصف حمام استخراج 200 مل هو ضروري. لدراسة الهجرة الخلية، PKH26 هو الخيار الأفضل لدراسات الهجرة على المدى الطويل في حين Calcein-AM يوفر مراقبة أفضل للمورفولوجيا الخلايا. غنى عنهntification من حركة الخلية في اتجاه Z-هو غير المباشرة في قياس المختبر من السيطرة على الحركة الخلوية. أيضا هذا النظام يمكن استخدامه مع الخلايا البطانية لتقدير حجم الأوعية الدموية في المختبر من يزرع، إما عن طريق البذر المباشر أو باستخدام فحوصات الأوعية الدموية قياسي باستخدام هلام التغليف 24.

هناك عدة طرق تشكيل nanofiber المتاحة مثل electrospinning أو مرحلة الانفصال، ولكن electrospinning من الكولاجين يعتبر عموما أن تفسد ييفات الكولاجين. الاستفادة من بنية القائمة متضاعف الكتروليتي يضمن الوقاية من تمسخ مع توفير البنية اللازمة لييفي مع مستوى عال من الدقة. أيضا أساليب LBL هي أسهل على التكيف لزرع الأشكال المعقدة. طبقات الفيلم على الهياكل التي يسهل اختراقها هي أساليب بسيطة لتطوير transwell مثل المقايسات مع المزيد من السيطرة على التفاعلات بين المكونات الخلوية. فمن الممكن أن نلاحظ مع confocaL المجهري الطبقة العليا على الزرع. هذا يمكن استخدامها لمراقبة التفاعل بين الخلايا الأولية ذات الصلة مع متعددة الطبقات في اتصال مع زرع مثل الخلايا الظهارية أو الخلايا البطانية. الخلايا إما معزولة أو 25 المتاحة تجاريا يمكن استخدامها. يقدم هذا الفيلم طبقة سطح حيث يمكن تطويرها على البطانة الداخلية للجهاز أنبوبي. على سبيل المثال، كان في هذه الحالة المحددة بهدف وضع غشاء القصبة الهوائية الاصطناعية ل، وتبين هذا الهيكل لتكون مناسبة للظهارة التنفسية 23.

تم تعيين سمك طبقة على مستوى حيث أن الفيلم هو سميكة بما فيه الكفاية ليكون بمثابة حاجز (24 ثنائية الطبقات). في كل من التيتانيوم فقط والتيتانيوم / PLLA يزرع، ويرجع ذلك إلى hydrophobicity من الركيزة طبقة فيلم مسطحة نسبيا يمكن تشكيلها على يزرع، حيث تسهم المسام لاستقرار العلاقة بين هيكل وطبقة الفيلم التي شكلت حديثا. بين يشابك المتاحة ليthods، genipin يشابك هو الأكثر مناسبة لالتجريب الحيوان. طرق يشابك أخرى مثل غلوتارالدهيد، EDC / NHS يمكن أن تستخدم أيضا، لكنها تؤدي عموما في أقل مرفق الخلية. والاحتمال الآخر هو استخدام الكولاجين photocrosslinkable 26.

تسلسل البروتين هو وسيلة واعدة لرصد زرع، كما قد تزود أكثر في فهم متعمق. وفقا لطبيعة البروتينات التي تم الحصول عليها، فمن الممكن أن نستنتج الآثار النظامية من غرس وأيضا تراقب عن كثب العدوى المحتملة والتي هي ذات أهمية خاصة في الحالات التي زرع ليس في منطقة مغلقة، مثل في حالة زرع القصبة الهوائية . الكشف المبكر عن الإصابات يمكن أن يؤدي إلى الوقاية من مضاعفات العدوى ذات الصلة في الوقت المناسب. يمكن الملف الشخصى HPLC تقديم المزيد من المعلومات مقارنة توصيف واحد من بروتين معين مثل CRP أو CGA عن العديد من القمم مع العديد من البروتينات من الفائدة يمكن أن يكون الحصول علىإد مع هذا الأسلوب. على سبيل المثال، أظهرت ألفا وبيتا السلاسل ½ الهيموجلوبين للأرانب مع يزرع القصبة الهوائية اتجاهات مماثلة مع قراءات CRP في دعمنا الكامل نموذج استبدال القصبة الهوائية. ومن شأن هذا التنوع يوفر مكانا لتحديد تأثير النظامية دقيقة مع دقة كبيرة مع تحسين الأساليب المذكورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

NE فرانا هو موظف من Protip SAS.

Acknowledgments

والكتاب أود أن أشكر الدكتور اندريه Walder ونيكولا بيرين لصناعة التيتانيوم يزرع، K. Benmlih لتراكم القوالب تفلون والدكتور G. بريفوست لمساعدته مع التجارب على الحيوانات. ونحن نعترف أيضا منطقة الألزاس وPMNA (القطب MATÉRIAUX آخرون العلوم النانوية D'الألزاس) للمساهمة مالية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Dioxane Sigma-Aldrich 360481 Toxic material, Strictly under chemical hood
PLLA
i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g
ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g 		Sigma-Aldrich 94829, 81273 The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent.
PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) Novamatrix 4200006 Low viscosity(20-200 mPa.s)
Collagen type I (Bovine) Symatese CBPE2US100
Pen/Strep, Fungizone Promocell C42020
Genipin Wako 0703021
Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. Bruker MSCT
Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% Sigma-Aldrich 302031 Hazardous Material, Please follow MSDS carefully
Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% Sigma-Aldrich 34998
Calcein-AM Invitrogen C3100MP
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma-Aldrich PKH26GL
Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit Genway Bio GWB-9BF960
DMSO, Bioreagent, ≥99.7% Sigma-Aldrich D2650
Equipment
Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope Bruker
Procise microsequencer Applied Biosystems
Ultima 3000 HPLC system Dionex
Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 Hitachi
Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 Zeiss

Table 1. List of Materials and Reagents.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).
  2. Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications. Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).
  3. Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).
  4. Janssen, L. M., et al. Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).
  5. Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28, 2810-2820 (2007).
  6. Schultz, P., et al. Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis. Biomaterials. 26, 2621-2630 (2005).
  7. Müller, S., et al. VEGF-Functionalized Polyelectrolyte Multilayers as Proangiogenic Prosthetic Coatings. Advanced Functional Materials. 18, 1767-1775 (2008).
  8. Mills, R. J., Frith, J. E., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J. Effect of Geometric Challenges on Cell Migration. Tissue Engineering Part C-Methods. 17, 999-1010 (2011).
  9. O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26, 433-441 (2005).
  10. Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26, 5474-5491 (2005).
  11. Budyanto, L., Goh, Y. Q., Ooi, C. P. Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid - liquid phase separation and freeze extraction. J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).
  12. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
  13. Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
  14. Chaubaroux, C., et al. Collagen-Based Fibrillar Multilayer Films Cross-Linked by a Natural Agent. Biomacromolecules. 13, 2128-2135 (2012).
  15. Huang, Y., Siewe, M., Madihally, S. V. Effect of spatial architecture on cellular colonization. Biotechnology and Bioengineering. 93, 64-75 (2006).
  16. Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Unger, R. E. Co-culture systems for vascularization - Learning from nature. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, 291-299 (2011).
  17. Lavalle, P., et al. Dynamic Aspects of Films Prepared by a Sequential Deposition of Species: Perspectives for Smart and Responsive Materials. Advanced Materials. 23, 1191-1221 (2011).
  18. Zhang, D., et al. Serum concentration of chromogranin A at admission: An early biomarker of severity in critically ill patients. Annals of Medicine. 41, 38-44 (2009).
  19. Goh, Y., Ooi, C. Fabrication and characterization of porous poly(l -lactide) scaffolds using solid - liquid phase separation. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2445-2452 (2008).
  20. Vrana, N. E., et al. Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions. Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).
  21. Dupret-Bories, A., et al. Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep. J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).
  22. Gasnier, C. Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules. Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).
  23. Vrana, N. E. Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement. PLoS ONE. 6, e20480 (2011).
  24. Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
  25. Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032 (2012).
  26. Dong, C. -M., et al. Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen. Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).

Tags

الهندسة الطبية الحيوية، العدد 77، الهندسة الحيوية، الطب، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، الفيزياء الحيوية، علم الأحياء الخلوية والبيولوجيا الجزيئية وعلوم المواد، المواد الطبية الحيوية والأسنان، المواد المركبة، والمعادن والمواد المعدنية، الهندسة عموما، والتيتانيوم، والتدرج المسام، زرع،
تعديل متعدد مقياس من يزرع لامع مع التدرجات مسام، مركبات البولي الكتروليت والمراقبة غير المباشرة<em&gt; في الجسم الحي</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vrana, N. E., Dupret-Bories, A.,… More

Vrana, N. E., Dupret-Bories, A., Chaubaroux, C., Rieger, E., Debry, C., Vautier, D., Metz-Boutigue, M. H., Lavalle, P. Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50533, doi:10.3791/50533 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter