Summary
Dans cette vidéo, nous allons démontrer les techniques de modification pour les implants métalliques poreux pour améliorer leur fonctionnalité et de contrôler la migration cellulaire. Les techniques comprennent le développement de gradients de pores pour commander le déplacement de la cellule en 3D et de la production de la membrane basale imite pour commander le mouvement de cellule à deux dimensions. En outre, une méthode HPLC pour la surveillance en intégration de l'implant in vivo via l'analyse des protéines du sang est décrit.
Abstract
Implants métalliques, notamment des implants en titane, sont largement utilisés dans des applications cliniques. La croissance tissulaire et l'intégration de ces implants dans les tissus sont des paramètres importants pour les résultats cliniques réussies. Afin d'améliorer l'intégration des tissus, des implants métalliques poreux sont en cours d'élaboration. La porosité ouverte de mousses métalliques est très avantageux, étant donné que les zones interstitielles peuvent être fonctionnalisés, sans compromettre les propriétés mécaniques de la structure entière. Nous décrivons ici les modifications à l'aide d'implants en titane poreux à base de microbilles de titane. En utilisant les propriétés physiques inhérentes telles que l'hydrophobie de titane, il est possible d'obtenir des gradients de pores hydrophobes à l'intérieur des implants métalliques à base de microbilles et en même temps, d'avoir une membrane basale imitateur, basée sur des polymères naturels hydrophiles. Gradients de pores 3D sont constitués par des polymères synthétiques tels que l'acide poly-L-lactique (PLLA) par la méthode de congélation-extraction. 2D nanofibrillar surles faces sont formées à l'aide de collagène / alginate suivie d'une étape de réticulation avec un agent de réticulation naturel (génipine). Ce film nanofibrillar a été construite par couche par couche (LBL) du procédé de dépôt des deux molécules de charge opposée, le collagène et l'alginate. Enfin, un implant où les différentes zones peuvent accueillir différents types de cellules, comme cela est nécessaire pour de nombreux tissus multicellulaires, peut être obtenue. Par ce moyen mouvement cellulaire dans des directions différentes en différents types de cellules peut être contrôlée. Un tel système est décrit dans le cas spécifique de la trachée régénération, mais il peut être modifié pour d'autres organes cibles. L'analyse de la migration cellulaire et les méthodes possibles pour créer différents gradients de pores sont élaborés. La prochaine étape dans l'analyse de ces implants est leur caractérisation après l'implantation. Cependant, l'analyse histologique des implants métalliques est un processus long et fastidieux, donc pour le suivi réaction de l'hôte à des implants métalliques in vivo une unelternative méthode basée sur le suivi de protéines sanguines CGA et différent est également décrite. Ces méthodes peuvent être utilisées pour le développement de la migration sur mesure vitro et des essais de colonisation dans et également être utilisés pour l'analyse des implants métalliques fonctionnalisés in vivo sans histologie.
Introduction
Actuellement implants métalliques disponibles conviennent aux applications porteurs, mais leur non-dégradabilité nécessitent conceptions qui garantissent une interface forte avec le tissu qui les entoure 1. En prévoyant des structures qui facilitent la croissance cellulaire et la colonisation in vivo, la durée de vie des implants métalliques peut être prolongée 2. Implants métalliques ouvertement poreux sont des matériaux pour l'ingénierie de l'interface tissu prometteurs et aussi pour assurer une bonne colonisation des implants. Ils ont été utilisés activement que les implants orthopédiques et implants aussi trachéales 3-5. Cependant, il ya encore des problèmes qui doivent être résolus tels que le contrôle précis sur le mouvement des cellules dans les zones interstitielles. L'incapacité à contrôler ce processus pourrait conduire à la colonisation incomplète dans une extrémité et de la resténose dans l'autre. Aussi fonctionnalisation supplémentaire de ces implants est nécessaire pour la réalisation de fonctions plus élevées telles que, la livraison de facteurs de croissance,vascularisation dirigé et un mouvement simultané de différents types de cellules 8.6. Pour les implants trachée, ce qui est crucial que la colonisation de l'implant par un tissu vascularisé est souhaitable. Cependant, le tissu incontrôlée en croissance à la lumière de la trachée n'est pas souhaitable, car elle diminue la perméabilité de l'implant.
Une possibilité de contrôler le mouvement des cellules est de taille exclusion. En connaissant la taille des cellules cibles et leur capacité à interagir avec un polymère synthétique étant donné qu'il est possible d'élaborer des gradients de pores qui peut effectivement de déterminer la profondeur de circulation des cellules. Par exemple en créant une architecture pore qui est assez grand pour l'entrée des cellules du tissu conjonctif telles que les fibroblastes extraluminale, mais assez petites (moins de 10 um) pour empêcher leur mouvement intraluminale un contrôle effectif sur la colonisation d'un implant tubulaire peut être réalisé.
De méthodes de création de pores disponibles tels que gel drying, le lessivage des particules, gaz de moussage 9,10; le plus facile à adapter la méthode pour la formation rapide de gradients pores avec minimum d'équipements nécessaires est de gel-extraction 11. Dans ce procédé, une solution de polymère est congelée dans un mélange binaire d'un solvant organique et de l'eau. Ensuite, le solvant est échangé par l'intermédiaire de l'extraction par un liquide pré-refroidi miscible tel que l'éthanol. Congélation et des conditions d'extraction déterminent la forme et la taille des pores, et si l'extraction est réalisée d'une manière où le mouvement de la solution d'extraction peut être commandé, la taille des pores et la forme peuvent être directionnellement modulé.
Deuxième étape de tissus multicellulaires est la formation de barrières poreuses entre les différents types de cellules pour contrôler leur interaction. Cela est également nécessaire pour la disponibilité des différents micro-environnements pour les différents types de cellules en fonction de leurs exigences 12,13. Trachée est un organe tubulaire qui relie le larynx avec bronchi. Il a une pseudostratifié doublure de l'épithélium ciliaire intérieur des cellules à mucus interdispersées qui produisent du mucus. La structure 3D et la stabilité de la trachée est maintenue par le cartilage en forme de C-rings. Ainsi, dans une trachée artificielle il devrait y avoir une jonction définie entre le tissu conjonctif et la couche épithéliale ciliaire. Bien que d'une structure 3D est nécessaire pour la partie de tissu conjonctif, la migration des cellules épithéliales nécessite une membrane en forme de sous-sol surface pour réaliser le mouvement directionnel et la fermeture de la plaie. Polyélectrolytiques films multicouches (PEM) sont une option possible pour obtenir des imitateurs de la membrane basale. Procédé par couche de la couche (LBL) est un procédé polyvalent pour obtenir des revêtements de surface mince et fonctionnel. Il est basé sur des interactions électrostatiques de deux polyélectrolytes de charges opposées et leur accumulation dans une manière séquentielle pour obtenir des revêtements de surface nanométrique dont les propriétés peuvent être modifiées en changeant simplement les variables telles que les espèces de polyélectrolytes, le pH,numéro de couche, l'ajout d'une couche de recouvrement, etc réticulation Un des principaux avantages de la méthode LbL est sa capacité à se conformer à la topographie du substrat sous-jacent. Ainsi, dans des conditions contrôlées, cette méthode peut aussi être utilisée pour obtenir une couverture de surface de structures poreuses. Si le collagène est utilisé comme l'un des polyélectrolytes, il est possible d'obtenir des structures nanofibrillar qui peuvent imiter la surface de la membrane basale. L'hydrophobie de titane permet le développement de ces structures et fibrillarity peut être préservée dans les revêtements épais 14. De cette façon, l'attachement et le mouvement de cellule à la surface peut également être contrôlée. En utilisant de gel-extraction et de revêtement de film par couche de manière séquentielle, une structure dans laquelle le mouvement des cellules peut être commandée latéralement, longitudinalement et circonférentiellement peut être obtenue 15.
Ici, nous décrivons deux méthodes de modification nouvelles pour les implants en titane à l'aide de leur comportement hydrophobe qui peut êtreétendu à la modification des divers implants poreux: i) la formation de gradients de micropores à l'intérieur des implants en titane macroporeux avec hydrophobes, des polymères synthétiques, ii) la formation d'une couche de film polymère épais sur la surface de l'implant qui favorise la croissance cellulaire et la formation de la garniture par des multicouches de polyélectrolytes. Ces méthodes peuvent être utilisées successivement ou séparément. Ils fournissent des structures qui assurent la migration contrôlée et l'organisation spatiale des différents types de cellules dans les tissus multicellulaires 16,17. Pour le cas spécifique de la trachée, le résultat souhaité pour l'implant serait la colonisation par le tissu fibro-vasculaire dans les gradients micropores sans resténose et la formation de la paroi interne des cellules épithéliales ciliées sur les multicouches de polyélectrolytes.
Une façon de contrôler l'intégration des implants est de faire de petites interventions chirurgicales au cours de la période de leur intégration avec l'hôte in situ. Afin d'être en mesure to décider du calendrier des interventions, il est important d'avoir des informations sur les effets systémiques de l'implant. C-Reactive Protein (CRP) a été utilisé pour la surveillance de l'infection et la réponse inflammatoire dans les milieux cliniques. Chromogranine A (CGA) peut également être utilisé de manière similaire et pourrait fournir des résultats plus précis pour observer le niveau d'inflammation 18. Comme un moyen possible d'observer l'intégration de l'implant métallique in vivo, nous présentons une procédure de surveillance continue des effets systémiques de l'implant par la caractérisation d'échantillons sanguins animaux avec la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) et le séquençage des protéines ultérieure. Élaboration de cette méthode peut être utilisée pour échapper à l'analyse histologique point final régulière. Coupe histologique des implants métalliques est un processus long, lourd et coûteux et peut être effectuée uniquement à des moments spécifiques. Pour cette raison, les tests sanguins qui fournissent des informations solides sur la santé de l'implant bien conçuêtre les voies possibles pour réduire l'expérimentation animale tel que mandaté par les récentes règles de l'UE concernant l'expérimentation animale.
Les méthodes présentées ici peuvent être utilisés pour améliorer la performance des implants métalliques par fonctionnalisation ou d'avoir une autre façon de contrôler les implants existants.
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Protocol
1. Préparation des gradients micropores implants métalliques macroporeuses
- Nettoyez les implants (tels que les implants faits de billes de titane de qualité médicale avec une gamme de taille de 400-500 um, Neyco SAS, France) à l'éthanol puis soniquer dans l'acétone pendant 15 min.
- Conception et fabrication des moules en Téflon selon la taille de l'implant et de la forme (Pour les expériences classiques, des moules cylindriques de 1,5 cm de diamètre avec une hauteur de 2 cm sont utilisés). Les moules doivent être modulaire, de sorte que les certaines parties peuvent être retirées au cours de l'extraction. Une telle conception du moule assure le contrôle du processus d'extraction en forçant le déplacement du fluide d'extraction d'une manière dirigée.
- Pour les implants tubulaires destinées à remplacer la trachée, de la structure soit composé de trois éléments: i) une partie de fond pour déterminer la taille de l'implant, ii) d'un mandrin, et iii) d'un noyau externe qui est amovible. De cette façon, le gradient de taille des pores peut être formé à partir de l'extérieur vers l'intérieur. <li> Préparer la solution de polymère synthétique (PLLA): Pour une solution de PLLA gel / extraction doit être préparé dans un mélange binaire de dioxane et d'eau (87:13%, v: v).
- Chauffer le mélange à 60 ° C afin d'obtenir une solution homogène. 60 ° C, choisi car il correspond à la limite supérieure de la résistance à la température pour les seringues de précision en verre qui doit être utilisé pour l'introduction de la solution dans les implants.
- Si une concentration élevée (≥ 6%) des solutions de PLLA de haut poids moléculaire, on utilise, à introduire la solution dans de l'implant immédiatement après le chauffage. Sinon gélification de la solution se fait sans une immersion totale.
- Calculer le volume de la solution de polymère nécessaire à l'égard de la porosité de l'implant, par changement de la précision dans le volume de la solution congelée pouvant être pris en compte.
- Introduire la solution dans les implants avec des seringues en verre de précision avec précision de 0,1 pi. La limite inférieure de la concentration en polymère est3% pour la formation de pores gradient reproductible alors il devient difficile d'obtenir une répartition homogène dans les échantillons d'épaisseur supérieure à 6%. Cependant, pour des applications spécifiques autres concentrations peuvent être utilisés.
- Congeler les échantillons directement à -80 ° C ou avec une période d'incubation avant de 30 min à température ambiante. Conditions de gel déterminent en partie la formation de pores, donc les conditions de congélation peuvent être ajustées en fonction de la porosité visé. Conserver les échantillons pendant la nuit à -80 ° C.
- Extraction: Plonger les implants dans 80% de EtOH pré-réfrigérés. Effectuer l'extraction à -20 ° C pendant la nuit. Pour obtenir des gradients de porosité, supprimer toutes les parties du moule à l'exception du mandrin pour les implants tubulaires et toutes les parties sauf la partie de fond pour des implants en forme de disque. L'utilisation d'un scalpel pré-réfrigérée pour en faciliter la séparation du moule.
- Après extraction à -20 ° C pendant la nuit 19, enlever les parties de moule restants et sécher à l'air les implants. Pour la caractérisation desla porosité totale de la structure d'analyse porosimètre au mercure est nécessaire. Mesures porosimètre à mercure ont montré des pics distincts correspondant aux pores sur les deux côtés de l'implant et les pores plus petits interdispersées. Toutefois, les données les plus cruciaux est la différence entre les porosités de surfaces intraluminaux et extraluminal, qui peuvent être analysés par J de l'image pour la distribution de taille des pores avec un microscope électronique à balayage (MEB) 20. Pour la vérification de la pente des pores, cryofracturation les échantillons et observer la coupe avec SEM.
- En raison de la nature poreuse ouverte des implants utilisés, et la capacité à réfléchir la lumière de titane, il est possible de faire z empilements de cellules marquées dans les implants poreux. Marquer les cellules avec PKH26 ou Calcein-AM et de visualiser les implants avec la microscopie confocale à balayage laser.
2. Revêtement de surface des implants métalliques poreux avec le collagène / alginate Multilayers
- Pour accumulationde multicouches, la plus haute reproductibilité est obtenue avec des robots trempage. Toutefois, si un robot trempage n'est pas disponible ces étapes peuvent être effectuées manuellement.
- Utilisation médicale de type I de collagène de qualité et de l'alginate de sodium. Les concentrations optimales sont de 0,5 g / L pour chaque dans 150 mM de NaCl dans un tampon citrate à pH 3,8.
- Dissoudre la solution de collagène pendant une nuit afin d'assurer l'homogénéité de la solution. PH acide de 3,8 est nécessaire pour la stabilité accumulation des couches de la structure est instable, avant réticulation, de pH neutre.
- Déposer les couches par un système de robot trempage par immersion de l'implant dans des solutions de collagène et de l'alginate en variante. Temps de dépôt est de 15 min pour chaque couche successive. Rincer la structure entre les deux étapes de dépôt avec NaCl 150 mM à pH 3,8 pendant 5 min.
- titulaire spécifique de conception pour l'utilisation des implants avec des robots trempage utilisés dans la production multicouche de polyélectrolytes. Déposer les couches sur la surface de titane soit seulement implants ou des implants modifiés comme décrit dans la section 1.
- La stabilisation de la membrane basale imiter avec génipine: Préparer la solution de réticulation dans un diméthylsulfoxyde (DMSO) / tampon citrate (NaCl 150 mM, pH 3,8) à 01:04 v: rapport v. Une large gamme de concentrations peut être utilisé et 100 mm est suffisante pour la réticulation. Dissoudre génipine première dans le composant DMSO et ajoutez le composant de l'eau afin d'éviter une agglutination.
- Réticuler les échantillons par l'immersion dans la solution de réticulation entre 12-24 heures. Ensuite rincer abondamment avec de tampon citrate (pH 3,8).
- Après les étapes de lavage, la stérilisation des échantillons soit avec traitement UV (30 min) ou un bain antibiotique / antifongique (pénicilline / streptomycine, Fungizone).
- Les principaux paramètres qui déterminent la qualité de la membrane basale imiter sont son épaisseur et le diamètre des fibres. Calculer les diamètres de fibres par microscopie images de force atomique (AFM) obtenus en mode contact. Sécher les échantillons avec unun courant d'azote avant de l'imagerie. Quantifier l'épaisseur d'au moins 10 fibres par image afin de déterminer l'épaisseur moyenne des fibrilles avec un logiciel de J de l'image.
- L'épaisseur des films peut être déterminée par des essais de zéro en utilisant l'AFM. Dry (COL / ALG) 24 films multicouches / COL. Utiliser une aiguille de seringue à la hauteur du film. Après localisation de la rayure avec un microscope optique, obtenir des images avec l'AFM sur 10 x 10 um 2 surfaces à la limite de la rayure. Calculer les hauteurs des profils obtenus avec le logiciel AFM, ce qui fournit de l'épaisseur de la couche de film.
3. Contrôle indirect de l'intégration de l'implant in vivo par l'analyse du plasma sanguin
- Toutes les approbations des comités nécessaires devraient être prises pour l'expérimentation animale, conformément aux règles régissant dans chaque pays 21. Dans notre cas, le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (National Research Council, 2010) est suivie et eOn obtient l'approbation du e de l'Université du comité d'éthique de Strasbourg.
- Réaliser l'implantation sur le site cible. Le protocole de surveillance du sang donnée ici a été utilisé pour le remplacement trachéal en Nouvelle-Zélande lapins blancs de 15 mm résection trachéale.
- Suite à l'implantation d'un suivi quotidien est nécessaire comme montioring le bien-être des animaux (guérison autour des sites chirurgicaux, le taux de respiration) général et l'enregistrement de leur poids.
- Pour valider le test sanguin, utilisez une méthode bien établie, comme les tests ELISA pour la CRP dans le sang. Essais CRP pour beaucoup d'animaux sont disponibles et le test spécifique utilisé pour les lapins sont énumérées dans le tableau 1. De même, utiliser Western blot pour la détermination des niveaux de CGA. Anticorps anti-CGA monoclonaux (anti-CGA 47-68) ont été utilisés dans ce protocole.
- Pour la caractérisation du plasma, d'obtenir des échantillons de sang provenant des veines auriculaires des lapins. Centrifuger à 5000 rpm pendant 20 min à 4 °; C. Utilisation du surnageant obtenu à l'analyse. Dans notre procédure, ces tests sont effectués sur une base hebdomadaire, mais des tests plus fréquents sont également possibles.
- Inverser purification par HPLC en phase de la teneur en protéines du plasma: Extraire le plasma de lapin avec 0,1% d'acide trifluoroacétique (1:1, v: v). Purifier l'extrait en utilisant un système HPLC Dionex (Ultimate 3000, Sunnyvale, CA USA) sur une phase inverse nucléosil 300-5C18-colonne (4 x 250 mm, granulométrie 5 um, porosité, 300 Å).
- Lire l'absorbance à 214 et 280 nm. Le système solvant utilisé est i) Solvant A: 0,1% (v / v) d'acide trifluoroacétique (TFA) dans l'eau et ii) le solvant B: 0,09% (v / v) TFA dans 70% (v / v) d'acétonitrile et d'eau.
- Utiliser un débit de 700 pi / min en utilisant des gradients pour élutions. Recueillir les fractions de pointe. Concentrer les fractions par évaporation par l'application speed-vide. Il est important d'arrêter la vitesse à vide avant de sécheresse complète.
- Corréler les pics obtenus à différents points de temps sur la coopérationURSE de la période de l'implantation. Utilisez les peptides purifiés qui montrent des tendances cohérentes au cours d'implantation pour l'identification automatique par séquençage d'Edman.
- Automatique d'Edman séquençage des peptides: déterminer la séquence N-terminale des peptides purifiés par dégradation d'Edman automatique à l'aide d'un microséquenceur Procise. Chargez l'échantillon à des filtres en fibre de verre polybrene traités. La prochaine étape est l'identification des Phenylthiohydantoin acides aminés (PTH-Xaa) par chromatographie sur colonne C 18 (PTH C-18, 2,1 x 200 mm) 22. Après la séquence est obtenue, il peut être identifié par le logiciel Blast avec base de données Swiss-Prot.
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Representative Results
Formation des gradients pores
En modifiant la concentration de la solution PLLA, il est possible de contrôler la taille des pores du côté extraluminal des implants. La taille des pores et la forme a été significativement affectée par la présence d'implants en titane (figures 1a et 1b). Taille des pores varie de 40 à 100 um et l'utilisation de plus faibles concentrations ont donné lieu à des pores plus petits. Considérant que, la taille des pores du côté intraluminal était régie par l'extraction restreinte et était d'environ 9 um 23, inférieure à la taille moyenne des fibroblastes. En ajoutant une étape d'incubation à température ambiante, une structure à double poreuse, où les parois des pores des pores plus grands ont leur porosité ne peut être obtenue. Cette caractéristique est importante pour les implants épais, car il facilitera le gaz et le mouvement des éléments nutritifs (figure 1C).
Formation sous-sol Nanofibrillar membrane imiter
(Figure 2). Cette couche de film est stable sur le dessus de la mousse PLLA et il peut également être maintenue sur la surface en l'absence de la mousse (figures 3a et 3b). Les fibres de collagène constituent Nanoparticules que la couche de film se développe (figure 3c). La croissance du film est exponentielle, donc un film épais de plusieurs centaines de nanomètres peut être obtenue (Figure 3d).
L'analyse du plasma sanguin par HPLC et séquençage ultérieur après l'implantation
Implants en titane poreux s'intègrent au tissu hôte et sont complètement remplis entre 4-6 semaines in vivo (figure 4). Toutefois, la poursuite de ce processus peut conduire à une resténose et en présence du gradient de pores en raison de la structure PLLA, aucune présence de fibroblastes a été observé uneprès avoir 6 semaines d'implantation 20. Pendant cette période, l'analyse HPLC a montré des pics distincts qui varient au cours du temps de l'implantation. Les fractions de pic d'intérêt sont séquencées et déterminés à être alpha et bêta hémoglobine ½ chaînes (Figure 5), qui ont montré une tendance similaire avec des lectures de CRP.
Figure 1. Procédé de formation de gradient de pore. Préparation de mousses de PLLA poreux via la méthode de congélation-extraction. Micrographies SEM (A) sans implants en titane macroporeux (externe) (B) avec des implants en titane macroporeux (externe) (C) avec des implants en titane macroporeux (intérieure). Présence des implants changé la morphologie des pores. (C, D) même processus peut être appl IED de structures tubulaires pour obtenir gradients pores dans les implants tubulaires. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Schéma de la mise au point de l'implant multifonctionnel. Partir implants poreux à base de microbilles, par addition d'une mousse à base de polymère synthétique un gradient de taille de pores peut être obtenue. Forme du gradient de pore est partiellement contrôlée par la structure des moules. Au sommet de cette structure une structure semblable à une membrane sous-sol peut être ajoutée, ce qui donnerait une surface appropriée pour la fixation des cellules et la formation de doublure en 2D.
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Figure 3. Nanofibrillar formation multicouche sur des implants en titane sous forme de mimer la membrane basale. Collagène / alginate multicouches épaisses peuvent être formés spécifiquement à la surface de (A) titane seuls les implants (avec une taille moyenne des billes de um 400-500) (B) Titane / PLLA hybrides de mousse. Cette surface (épaisseur ~ 1 um) fournit un substrat pour la fixation et la prolifération des cellules endothéliales (c) la nature nanofibrillar des multicouches est caractérisé par analyse AFM (Zone de numérisation: 30 um x 30 um) (D) épaisseur de la multicouches est déterminée par un test de zéro. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Figure 4. L'intégration des implants en titane poreux in vivo chez le lapin. Hématoxyline & éosine de l'implant sections expiantes (A) Les zones poreuses peut être complètement rempli dans un délai de 4-6 semaines in vivo (B) Le tissu à l'intérieur des pores est un tissu conjonctif mature avec un bon niveau de la vascularisation .
Figure 5. Suivi de la teneur en protéines du plasma au cours d'une implantation par HPLC et séquençage ultérieur. Les courbes HPLC représentatifs montrent les pics obtenus à partir d'échantillons sanguins d'animaux après 3, 4 et 6 semaines d'implantation respectivement (en haut à gauche, en haut à droite, en bas à gauche ). Chaque pic correspond à une protéine spécifique. Les différencesdans le pic correspond à l'abondance relative d'une protéine donnée, qui peut être déterminée par séquençage (comme α et ß de l'hémoglobine ½ chaînes). Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
Gradients pores sont des outils importants dans l'ingénierie tissulaire de l'interface et le système décrit ici peut être utilisé seul ou en combinaison avec des implants métalliques pour former des pores gradient d'étudier la migration cellulaire. Le système ne nécessite aucun réglage supplémentaire ou matériel supplémentaire, sauf une hotte à manipuler des solvants organiques, donc elle peut être appliquée dans les laboratoires de biologie. Polymères similaires tels que le poly (acide glycolique) (PGA), le poly (lactique-co-glycolique), l'acide (PLGA) et le poly (caprolactone) (PCL) peuvent être utilisés avec de légères modifications. D'autres structures macroporeuses qui se dissout pas dans les solvants organiques peuvent également être utilisés. Pour l'obtention de petites tailles de pores (à l'échelle nanométrique) sur une surface, une formation de couche de film mince supplémentaire nanoporeuse est également possible. Ceci peut être obtenu en mettant d'abord une solution diluée (1%) du polymère sur le dessus de la structure dans un solvant très volatil (tel que le chloroforme), puis entraînant immédiatement la séparation des phases par immersion dans l'APsolution d'éthanol ure. De cette façon un système de co-culture, qui est basé un seul matériau peut être obtenu.
La conception de moules en Téflon est essentiel pour le contrôle de la taille des pores que la circulation du fluide d'extraction est déterminée par la présente. Le mouvement du fluide d'extraction et la vitesse d'échange entre le fluide d'extraction et le solvant a une incidence sur la formation de pores. Le contrôle peut être encore améliorée par l'application d'un écoulement laminaire du fluide d'extraction à travers l'implant. La quantité de liquide d'extraction est un paramètre important et il doit être disposé par rapport à la quantité de polymère utilisé, et également par rapport à la taille de l'implant. Pour les implants cylindriques de 2 mm d'épaisseur et 11 mm de diamètre formé de 500 billes de titane de grade médical um un bain d'extraction de 200 ml est nécessaire. Pour étudier la migration cellulaire, PKH26 est une meilleure option pour les études de migration à long terme alors que Calcein-AM permet une meilleure observation de la morphologie cellulaire. Quantification du mouvement de la cellule dans la direction z est une mesure indirecte en vitro du contrôle sur le mouvement cellulaire. En outre, ce système peut être utilisé avec des cellules endothéliales pour la quantification de la vascularisation in vitro des implants, soit par semis direct ou en utilisant des tests standards de l'angiogenèse en utilisant l'encapsulation de gel 24.
Il existe plusieurs méthodes de formation des nanofibres disponibles tels que electrospinning ou de séparation de phase, mais électrofilature de collagène est généralement considéré dénaturer fibrilles de collagène. L'utilisation d'une structure basée sur polyélectrolyte assure la prévention de la dénaturation tout en fournissant la structure fibrillaire nécessaire avec un haut niveau de précision. Aussi méthodes LbL sont plus faciles à adapter pour les formes d'implants complexes. couches de film sur les structures poreuses existe des méthodes simples pour mettre au point des dosages transwell-like avec plus de contrôle sur les interactions entre les composants cellulaires. Il est possible d'observer avec confocal microscopie de la couche supérieure sur l'implant. Ceci peut être utilisé pour observer l'interaction des cellules primaires correspondantes avec les multicouches en contact avec l'implant tel que des cellules épithéliales ou des cellules endothéliales. Soit des cellules isolées ou 25 disponibles dans le commerce peuvent être utilisés. Cette couche de film fournit une surface où une doublure intérieure pour un organe tubulaire peut être développé. Par exemple, dans ce cas précis, l'objectif était de mettre au point une membrane artificielle pour la trachée, et cette structure a été montré pour être adapté à l'épithélium respiratoire 23.
L'épaisseur de la couche est fixée à un niveau tel que le film est suffisamment épaisse pour servir de barrière (24 bi-couches). En tant titane seuls les implants et titane / PLLA, en raison de l'hydrophobicité du substrat, une couche de film relativement plat peuvent être formés sur les implants, où les pores contribuent à la stabilité de l'interface entre la structure et la couche de film nouvellement formé. Parmi la réticulation disponible moithodes, génipine réticulation est le plus approprié pour des expérimentations animales. D'autres méthodes de réticulation tel que le glutaraldéhyde, EDC / NHS peuvent aussi être utilisés, mais ils donnent généralement lieu à la fixation des cellules moins. Une autre possibilité est d'utiliser le collagène photoréticulables 26.
séquençage des protéines est une méthode prometteuse pour le suivi de l'implant, car il pourrait fournir plus de compréhension en profondeur. Selon la nature des protéines obtenues, il est possible de déduire les effets systémiques de l'implantation et également suivre de près les possibles infections qui sont particulièrement importantes pour les cas où l'implant n'est pas dans une zone étanche, comme dans le cas des implants trachéales . La détection précoce des infections peuvent conduire à la prévention des complications liées à une infection dans un temps opportun. Le profil HPLC peut fournir plus d'informations par rapport à la caractérisation unique d'une protéine donnée comme CRP ou CGA comme plusieurs pics avec plusieurs protéines d'intérêt peut être obtenired avec cette méthode. Par exemple, l'alpha et bêta hémoglobine chaînes de ½ pour les lapins ayant reçu des implants trachéales ont montré des tendances similaires avec des lectures de CRP dans notre modèle complet de remplacement trachéal. Une telle polyvalence pourrait fournir un lieu pour la détermination de l'effet systémique minute avec une grande précision avec l'amélioration des techniques décrites.
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Disclosures
NE Vrana est un employé de Protip SAS.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr André Walder et Nicolas Perrin pour les implants en titane fabrication, K. Benmlih pour l'accumulation des moules en téflon et le Dr G. Prévost pour son aide à l'expérimentation animale. Nous reconnaissons également la Région Alsace et PMNA (Pôle Matériaux et Nanosciences d'Alsace) pour sa contribution financière.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss | ||
Table 1. List of Materials and Reagents. |
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References
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