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Bioengineering

ताकना अनुपात में, Polyelectrolytes और उनके अप्रत्यक्ष निगरानी के साथ धातु समाविष्ट की मल्टी स्केल संशोधन Published: July 1, 2013 doi: 10.3791/50533
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,3, 1,3, 1,3
1Biomatériaux et Bioingénieriee, INSERM, 2Service Oto-Rhino-Laryngologie, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg, 3Faculté de Chirurgie Dentaire, Université de Strasbourg

Summary

इस वीडियो में, हम उनकी कार्यक्षमता में सुधार के लिए और सेल प्रवास को नियंत्रित करने के लिए झरझरा धातु प्रत्यारोपण के लिए संशोधन तकनीकों का प्रदर्शन करेंगे. तकनीक 3 डी और तहखाने झिल्ली का उत्पादन 2 डी में सेल आंदोलन को नियंत्रित करने के mimics में सेल आंदोलन को नियंत्रित करने के लिए ताकना ढ़ाल का विकास शामिल है. इसके अलावा, रक्त प्रोटीन के विश्लेषण के माध्यम से विवो में निगरानी प्रत्यारोपण एकीकरण के लिए एक HPLC आधारित विधि वर्णित है.

Introduction

वर्तमान में उपलब्ध धातु प्रत्यारोपण लोड असर अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन उनकी गैर degradability के लिए उन्हें 1 आसपास के ऊतक के साथ एक मजबूत इंटरफ़ेस सुनिश्चित डिजाइन जो जरूरी है. Vivo में और उपनिवेशवाद से विकास में सेलुलर कि सुविधा संरचनाओं प्रदान करके, धातु प्रत्यारोपण का जीवनकाल 2 लंबे समय तक किया जा सकता है. खुलेआम झरझरा धातु प्रत्यारोपण और भी प्रत्यारोपण के अच्छे बसाना सुनिश्चित करने के लिए ऊतक इंटरफ़ेस इंजीनियरिंग के लिए सामग्री का वादा कर रहे हैं. वे सक्रिय रूप से आर्थोपेडिक प्रत्यारोपण के रूप में और भी सांस की नली प्रत्यारोपण 3-5 के रूप में इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, इस तरह ताकना क्षेत्रों में सेल आंदोलन पर सटीक नियंत्रण के रूप में हल करने की आवश्यकता है कि समस्या अभी भी कर रहे हैं. इस प्रक्रिया को नियंत्रित करने में विफलता एक छोर और अन्य में restenosis में अधूरा बसाना को जन्म दे सकता है. इसके अलावा इन प्रत्यारोपण के आगे functionalization ऐसी वृद्धि कारकों के वितरण, के रूप में अधिक कार्य को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है,निर्देशित vascularization और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 6-8 के एक साथ आंदोलन. एक vascularized ऊतक से प्रत्यारोपण के औपनिवेशीकरण वांछनीय है के रूप में सांस की नली प्रत्यारोपण के लिए, यह महत्वपूर्ण है. यह प्रत्यारोपण प्रत्यक्षता कम हो जाती है क्योंकि हालांकि, ट्रेकिआ के लुमेन से विकास में अनियंत्रित ऊतक अवांछनीय है.

सेल आंदोलन को नियंत्रित करने के लिए एक संभावना यह आकार अपवर्जन है. लक्ष्य कोशिकाओं और एक दिया सिंथेटिक बहुलक के साथ बातचीत करने की क्षमता का आकार जानने के द्वारा इसे प्रभावी ढंग से सेल आंदोलन की गहराई तय कर सकते हैं जो छिद्रों की ढ़ाल का विकास संभव है. संयोजी ऊतक extraluminally जैसे fibroblasts कोशिकाओं, लेकिन intraluminally एक ट्यूबलर प्रत्यारोपण के औपनिवेशीकरण पर एक प्रभावी नियंत्रण उनके आंदोलन को रोकने के लिए (कम से कम 10 माइक्रोन) काफी छोटे के प्रवेश के लिए प्राप्त किया जा सकता है कि काफी बड़े एक ताकना वास्तुकला बनाने के द्वारा उदाहरण के लिए.

ऐसे फ्रीज dryi के रूप में उपलब्ध ताकना निर्माण विधियों सेएनजी, कण लीचिंग, 9,10 झाग गैस, आवश्यक उपकरणों की कम से कम राशि के साथ ताकना ढ़ाल के तेजी से निर्माण के लिए विधि अनुकूलित करने के लिए सबसे आसान फ्रीज निकासी 11 है. इस विधि में, एक बहुलक समाधान एक कार्बनिक विलायक और पानी की एक द्विआधारी मिश्रण में जमे हुए है. बाद में, विलायक इथेनॉल जैसे एक विलेयशील पूर्व ठंडा तरल द्वारा निकासी के माध्यम से बदल जाता है. ठंड और निकासी की स्थिति pores के आकार और आकार का निर्धारण और निष्कर्षण निष्कर्षण समाधान के आंदोलन को नियंत्रित किया जा सकता है, जहां एक तरह से किया जाता है, ताकना आकार और आकृति directionally संग्राहक जा सकता है.

बहुकोशिकीय ऊतकों के लिए दूसरे चरण के लिए अपनी बातचीत को नियंत्रित करने के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच झरझरा बाधाओं के गठन की है. यह भी उनकी आवश्यकताओं 12,13 के आधार पर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए विभिन्न microenvironments की उपलब्धता के लिए आवश्यक है. श्वासनली bronch साथ गला जोड़ता एक ट्यूबलर अंग हैमैं. यह बलगम उत्पादन जो interdispersed जाम कोशिकाओं के साथ एक आंतरिक pseudostratified रोमक उपकला अस्तर है. श्वासनली की 3 डी संरचना और स्थिरता सी छल्ले के आकार में उपास्थि द्वारा बनाए रखा है. इस प्रकार, एक कृत्रिम श्वासनली में संयोजी ऊतक और रोमक उपकला परत के बीच एक परिभाषित संगम होना चाहिए. एक 3 डी संरचना संयोजी ऊतक भाग के लिए आवश्यक है, उपकला कोशिकाओं के प्रवास एक तहखाने झिल्ली की तरह की आवश्यकता सतह घाव की दिशात्मक आंदोलन और बंद करने के लक्ष्य को हासिल करने के लिए. Polyelectrolyte बहुपरत फिल्मों (PEMs) तहखाने झिल्ली mimics के प्राप्त करने के लिए एक संभव विकल्प हैं. परत दर परत विधि (LBL) पतली और कार्यात्मक सतह कोटिंग्स प्राप्त करने के लिए एक बहुमुखी प्रक्रिया है. यह, जिसका गुण ऐसे polyelectrolyte प्रजातियों, पीएच के रूप में बस बदलते चर से अलग किया जा सकता है nanoscale सतह कोटिंग्स प्राप्त करने के लिए एक क्रमिक ढंग से दो विपरीत आरोप लगाया polyelectrolytes और उनके निर्माण की electrostatic बातचीत पर आधारित हैपरत संख्या, एक कैपिंग परत के अलावा, LBL विधि का मुख्य लाभ की तिर्यक आदि एक अंतर्निहित सब्सट्रेट की स्थलाकृति के अनुरूप करने की क्षमता है. इस प्रकार, नियंत्रित परिस्थितियों में इस विधि का भी झरझरा संरचना की सतह कवरेज प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कोलेजन polyelectrolytes में से एक के रूप में प्रयोग किया जाता है, तो यह तहखाने झिल्ली की सतह की नकल कर सकते हैं कि nanofibrillar संरचनाओं प्राप्त करने के लिए संभव है. टाइटेनियम के hydrophobicity ऐसी संरचनाओं के विकास के लिए सक्षम बनाता है और fibrillarity मोटी कोटिंग्स 14 में संरक्षित किया जा सकता है. इस तरह से सतह पर सेल के लगाव और आंदोलन भी नियंत्रित किया जा सकता है. क्रमिक रूप से फ्रीज निष्कर्षण और LBL फिल्म कोटिंग का उपयोग करके, सेल आंदोलन longitudinally और circumferentially, पार्श्वतः नियंत्रित किया जा सकता है, जहां एक संरचना 15 प्राप्त किया जा सकता है.

यहाँ हम हो सकता है जो उनके हाइड्रोफोबिक व्यवहार का उपयोग करके टाइटेनियम प्रत्यारोपण के लिए दो उपन्यास संशोधन विधियों का वर्णनहाइड्रोफोबिक, सिंथेटिक पॉलिमर दो) सेल के विकास और polyelectrolyte multilayers द्वारा अस्तर गठन का समर्थन करता है कि प्रत्यारोपण की सतह पर एक मोटी बहुलक फिल्म परत के गठन के साथ Macroporous टाइटेनियम प्रत्यारोपण के भीतर micropores की ढ़ाल के i) के गठन: विभिन्न झरझरा प्रत्यारोपण के संशोधन के लिए बढ़ा दिया. इन तरीकों में क्रमिक रूप से या अलग से इस्तेमाल किया जा सकता है. वे नियंत्रित प्रवास और बहुकोशिकीय ऊतकों 16,17 में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के स्थानिक संगठन यह सुनिश्चित है कि संरचनाओं प्रदान करते हैं. श्वासनली की विशिष्ट मामले के लिए, प्रत्यारोपण के लिए वांछित परिणाम restenosis और polyelectrolyte multilayers पर रोमक उपकला कोशिकाओं की अंदरूनी परत के गठन के बिना micropore ढ़ाल के भीतर जो तंतुमय एवं वाहिकामय दोनों हो ऊतक से बसाना होगा.

प्रत्यारोपण के एकीकरण को नियंत्रित करने का एक तरीका यह बगल में मेजबान के साथ अपने एकीकरण की अवधि के दौरान छोटी सी शल्य हस्तक्षेप करने के लिए है. कर टी होने के लिएहस्तक्षेप के समय के बारे में फैसला ओ, यह प्रत्यारोपण के प्रणालीगत प्रभाव के बारे में जानकारी होना बहुत जरूरी है. सी रिएक्टिव प्रोटीन (सीआरपी) के संक्रमण की निगरानी और नैदानिक ​​सेटिंग में भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल किया गया है. Chromogranin ए (सीजीए) भी एक समान तरीके से इस्तेमाल किया जा सकता है और सूजन 18 के स्तर पर निरीक्षण करने के लिए और अधिक सटीक परिणाम प्रदान हो सकता है. विवो में धातु प्रत्यारोपण एकीकरण के अवलोकन के संभावित रास्ते के रूप में, हम उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) की और बाद में प्रोटीन अनुक्रमण के साथ पशुओं के रक्त नमूने के लक्षण वर्णन द्वारा प्रत्यारोपण प्रणालीगत प्रभाव की एक सतत निगरानी प्रक्रिया मौजूद है. इस विधि का विस्तार नियमित अंत बिंदु ऊतकीय विश्लेषण से बचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. धातु प्रत्यारोपण के histological काटने के एक लंबे, जटिल और महंगी प्रक्रिया है और केवल विशिष्ट समय बिंदुओं पर कार्य शुरू किया जा सकता है. इस कारण के कारण, प्रत्यारोपण के स्वास्थ्य के बारे में मजबूत जानकारी उपलब्ध कराने के रक्त परीक्षण होगा अच्छी तरह से डिजाइनपशु प्रयोगों के विषय में ही यूरोपीय संघ के नियमों द्वारा अनिवार्य रूप पशु प्रयोगों को कम करने के लिए संभव मार्गों हो.

यहाँ प्रस्तुत तरीकों functionalization के माध्यम से धातु प्रत्यारोपण के प्रदर्शन में सुधार करने या मौजूदा प्रत्यारोपण की निगरानी का एक वैकल्पिक तरीका है करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

1. Macroporous धातु समाविष्ट में Micropore अनुपात की तैयारी

  1. इथेनॉल के साथ प्रत्यारोपण (जैसे 400-500 माइक्रोन, Neyco एसएएस, फ्रांस का एक आकार सीमा के साथ चिकित्सा ग्रेड टाइटेनियम मोती के बने प्रत्यारोपण के रूप में) साफ करें और फिर 15 मिनट के लिए एसीटोन में sonicate.
  2. प्रत्यारोपण के आकार और आकृति (मानक प्रयोगों के लिए, 2 सेमी की ऊंचाई के साथ 1.5 सेमी व्यास का बेलनाकार नए साँचे उपयोग किया जाता है) के अनुसार डिजाइन और निर्माण Teflon के सांचों. Molds के कुछ भागों निकासी के दौरान हटाया जा सकता है, ताकि मॉड्यूलर होना चाहिए. इस तरह की एक मोल्ड डिजाइन एक निर्देशित ढंग से निकासी तरल पदार्थ का आंदोलन मजबूर द्वारा निकालने की प्रक्रिया पर नियंत्रण सुनिश्चित करता है.
  3. मैं) प्रत्यारोपण के आकार, द्वितीय निर्धारित करने के लिए एक नीचे हिस्से) एक खराद का धुरा और हटाने योग्य है जो iii) एक बाहरी कोर: श्वासनली की जगह तैयार ट्यूबलर प्रत्यारोपण के लिए, संरचना तीन टुकड़ों से बना होना चाहिए. इस तरह, ताकना आकार ढाल अंदर की ओर बाहर से गठन किया जा सकता है.
    4. <ली> सिंथेटिक बहुलक (PLLA) समाधान तैयार: फ्रीज / निकासी PLLA समाधान dioxane और पानी (: ध् 87:13%, वी) के एक द्विआधारी मिश्रण में तैयार रहने की जरूरत है.
  4. एक समरूप समाधान प्राप्त करने के लिए डिग्री सेल्सियस के क्रम में 60 से मिश्रण गर्मी. 60 ° यह प्रत्यारोपण में समाधान की शुरूआत के लिए इस्तेमाल किया जा है कि परिशुद्धता गिलास सीरिंज के लिए तापमान प्रतिरोध की उच्च सीमा के रूप में सी का चयन किया.
  5. उच्च एकाग्रता (≥ 6%), उच्च आणविक भार PLLA समाधान का उपयोग किया जाता है, तो तुरंत हीटिंग के बाद प्रत्यारोपण में समाधान परिचय. अन्यथा समाधान का जमाना पूर्ण विसर्जन के बिना होता है.
  6. प्रत्यारोपण के porosity के संबंध में आवश्यक बहुलक समाधान की मात्रा की गणना, स्थिर समाधान की मात्रा में सटीकता बदलाव के लिए ध्यान में रखा जा सकता है.
  7. 0.1 μl सटीकता के साथ सटीक कांच सीरिंज के साथ प्रत्यारोपण में समाधान का परिचय दें. बहुलक एकाग्रता के लिए सीमा से कम हैप्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ताकना ढाल गठन के लिए 3% यह 6% ऊपर मोटी नमूनों में समरूप वितरण प्राप्त करने के लिए कठिन हो जाता है जबकि. हालांकि, विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए अन्य सांद्रता में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  8. नमूने सीधे -80 डिग्री सेल्सियस पर या कमरे के तापमान पर 30 मिनट के एक पूर्व ऊष्मायन अवधि के साथ या तो रुक. ठंड की स्थिति आंशिक रूप से ताकना गठन का निर्धारण, इस प्रकार ठंड शर्तों के उद्देश्य से सरंध्रता के अनुसार समायोजित किया जा सकता है. -80 पर नमूने रातोंरात रखें डिग्री सेल्सियस
  9. निष्कर्षण: पूर्व ठंडा EtOH के 80% में प्रत्यारोपण विसर्जित कर दिया. रात में -20 डिग्री सेल्सियस पर निकासी के लिए बाहर ले. सरंध्रता ढ़ाल प्राप्त करने के लिए, डिस्क के आकार का प्रत्यारोपण के लिए नीचे के भाग को छोड़कर ट्यूबलर प्रत्यारोपण और सभी भागों के लिए खराद का धुरा के अलावा सभी मोल्ड भागों को हटा दें. मोल्ड के आसान अलग होने के लिए एक पूर्व ठंडा स्केलपेल का उपयोग करें.
  10. पर निकासी के बाद -20 डिग्री सेल्सियस रातोंरात 19, शेष मोल्ड भागों को हटाने और हवा प्रत्यारोपण सूखी. लक्षण वर्णन के लिएसंरचना पारा porosimeter विश्लेषण के समग्र सरंध्रता आवश्यक है. पारा Porosimeter माप प्रत्यारोपण और छोटे interdispersed pores के दोनों पक्षों पर pores के अनुरूप है कि अलग चोटियों दिखाया. लेकिन अधिक महत्वपूर्ण डेटा एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) 20 के साथ ताकना आकार के वितरण के लिए छवि जम्मू से विश्लेषण किया जा सकता है जो intraluminal और extraluminal सतहों के porosities के बीच का अंतर है. ताकना ढाल के सत्यापन के लिए, नमूने फ्रीज फ्रैक्चर और SEM के साथ पार अनुभाग का निरीक्षण.
  11. इस्तेमाल किया प्रत्यारोपण के खुले झरझरा प्रकृति, और टाइटेनियम के प्रकाश को दर्शाती क्षमता के कारण, यह झरझरा प्रत्यारोपण के भीतर लेबल की कोशिकाओं के z-ढेर करने के लिए संभव है. PKH26 या Calcein-AM के साथ कोशिकाओं लेबल और लेजर confocal माइक्रोस्कोपी के साथ प्रत्यारोपण कल्पना.

2. कोलेजन / Alginate multilayers साथ झरझरा धातु समाविष्ट की सतह कोटिंग

  1. निर्माण के लिएmultilayers की, उच्चतम reproducibility की सूई रोबोट के साथ प्राप्त की है. एक सूई रोबोट उपलब्ध नहीं है हालांकि, अगर इन कदमों मैन्युअल रूप से किया जा सकता है.
  2. चिकित्सा ग्रेड कोलेजन प्रकार मैं और सोडियम alginate का प्रयोग करें. अनुकूलित सांद्रता पीएच 3.8 पर साइट्रेट बफर में NaCl 150 मिमी में प्रत्येक के लिए 0.5 ग्राम / एल हैं.
  3. समाधान की एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए रात में कोलेजन समाधान भंग. 3.8 की अम्लीय पीएच आवश्यक है संरचना तटस्थ पीएच में तिर्यक पहले अस्थिर है के रूप में परतों की स्थिर निर्माण के लिए.
  4. वैकल्पिक रूप से कोलेजन और alginate समाधान में प्रत्यारोपण डुबो कर एक सूई रोबोट प्रणाली द्वारा जमा परतों. बयान के समय प्रत्येक बाद परत के लिए 15 मिनट है. 5 मिनट के लिए पीएच 3.8 से कम 150 मिमी NaCl के साथ बयान कदम के बीच में संरचना कुल्ला.
  5. Polyelectrolyte बहुपरत उत्पादन में इस्तेमाल सूई रोबोट के साथ प्रत्यारोपण के उपयोग के लिए डिजाइन विशिष्ट धारक. या तो टाइटेनियम की सतह केवल impla पर जमा परतोंसंशोधित एनटीएस या प्रत्यारोपण के रूप में खंड 1 में वर्णित है.
  6. तहखाने झिल्ली के स्थिरीकरण genipin साथ नकल: ध् अनुपात: 01:04 वी पर एक dimethylsulfoxide (DMSO) / साइट्रेट बफर (150 मिमी NaCl, पीएच 3.8) में तिर्यक समाधान तैयार है. सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला का इस्तेमाल किया और 100 मिमी crosslinking के लिए पर्याप्त है किया जा सकता है. DMSO के घटक में पहली genipin और clumping से बचने के लिए बाद में पानी घटक जोड़ने भंग.
  7. 12-24 घंटे के बीच तिर्यक समाधान में विसर्जन से नमूने crosslink. बाद में साइट्रेट बफर के प्रचुर मात्रा (पीएच 3.8) के साथ कुल्ला.
  8. धोने के कदम के बाद, यूवी उपचार (30 मिनट) या एक एंटीबायोटिक / रोधी स्नान (पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, Fungizone) के साथ या तो नमूने बाँझ.
  9. नकल तहखाने झिल्ली की गुणवत्ता निर्धारित मुख्य पैरामीटर है कि उसकी मोटाई और फाइबर का व्यास हैं. संपर्क मोड में प्राप्त की परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) छवियों का उपयोग फाइबर व्यास की गणना. एक साथ नमूने सूखीइमेजिंग से पहले नाइट्रोजन प्रवाह. छवि जम्मू सॉफ्टवेयर के साथ औसत महीन रेशा मोटाई निर्धारित करने के लिए छवि के अनुसार कम से कम 10 फाइबर की मोटाई यों.
  10. फिल्मों की मोटाई AFM का उपयोग खरोंच परीक्षण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. सूखी (सीओएल / ALG) 24 / सीओएल बहुपरत फिल्मों. फिल्म खरोंच करने के लिए एक सिरिंज सुई का प्रयोग करें. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप से खरोंच के स्थानीयकरण के बाद, खरोंच की सीमा पर 10 x 10 माइक्रोन 2 सतहों पर AFM के साथ छवियों को प्राप्त करते हैं. फिल्म परत की मोटाई प्रदान करता है जो AFM के सॉफ्टवेयर के साथ प्राप्त की प्रोफाइल से ऊंचाइयों की गणना.

3. रक्त प्लाज्मा के विश्लेषण से विवो में प्रत्यारोपण एकता का अप्रत्यक्ष निगरानी

  1. सभी आवश्यक समिति के अनुमोदन के प्रत्येक देश के 21 के लिए संचालन नियम के अनुसार पशु प्रयोग के लिए रखा जाना चाहिए. हमारे मामले में प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग (राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद, 2010) के लिए गाइड का पालन किया है और वें हैस्ट्रासबर्ग नैतिक समिति विश्वविद्यालय की ई स्वीकृति प्राप्त की है.
  2. लक्ष्य स्थल पर आरोपण बाहर ले. यहां दिए गए रक्त की निगरानी प्रोटोकॉल एक 15 मिमी सांस की नली लकीर का न्यूजीलैंड सफेद खरगोश में सांस की नली को बदलने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
  3. आरोपण के बाद अनुवर्ती एक दैनिक में इस तरह के और अपने वजन की रिकॉर्डिंग सामान्य जानवरों की भलाई (शल्य साइटों, साँस लेने की दर के आसपास चिकित्सा) montioring के रूप में आवश्यक है.
  4. रक्त परीक्षण को मान्य करने के लिए, रक्त सीआरपी के स्तर के लिए एलिसा परीक्षण के रूप में एक अच्छी तरह से स्थापित विधि का उपयोग करें. कई जानवरों के लिए सीआरपी परीक्षण उपलब्ध हैं और खरगोशों के लिए इस्तेमाल किया विशेष परीक्षा 1 टेबल में सूचीबद्ध है. इसी प्रकार, पश्चिमी सीजीए के स्तर के निर्धारण के लिए सोख्ता का उपयोग करें. मोनोक्लोनल विरोधी सीजीए एंटीबॉडी (विरोधी सीजीए 47-68) इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया.
  5. प्लाज्मा लक्षण वर्णन के लिए, खरगोश की auricular नसों से खून के नमूने प्राप्त करते हैं. 4 बजे 20 मिनट के लिए 5000 rpm पर अपकेंद्रित्र डिग्री, सी. विश्लेषण के लिए प्राप्त तैरनेवाला का प्रयोग करें. हमारी प्रक्रिया में, इन परीक्षणों एक साप्ताहिक आधार पर किया जाता है, लेकिन अधिक लगातार परीक्षण भी संभव हैं.
  6. प्लाज्मा प्रोटीन सामग्री के चरण HPLC शोधन रिवर्स: trifluoroacetic एसिड का 0.1% (1:1;: v v) के साथ खरगोश प्लाज्मा निकालें. एक Dionex HPLC प्रणाली (अंतिम 3000, सनीवेल, सीए यूएसए) का उपयोग करके निकालने शुद्ध 300 5C18 स्तंभ रिवर्स चरण एक nucleosil पर (4 × 250 मिमी, कण आकार 5 माइक्रोन, सरंध्रता, 300).
  7. 214 और 280 एनएम पर absorbance रिकार्ड. इस्तेमाल किया विलायक प्रणाली) मैं है सॉल्वेंट एक: पानी और द्वितीय में 0.1% (v / v) trifluoroacetic एसिड (TFA)) विलायक बी: 0.09% (v / v) 70% में TFA से (v / v) acetonitrile का पानी.
  8. 700 μl / elutions लिए ढ़ाल का उपयोग कर मिनट की एक प्रवाह दर का प्रयोग करें. शिखर भिन्न लीजिए. स्पीड वैक्यूम आवेदन द्वारा वाष्पीकरण से भिन्न ध्यान लगाओ. यह पूरा सूखापन से पहले स्पीड निर्वात को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है.
  9. सह भर में अलग अलग समय बिंदुओं पर प्राप्त चोटियों सहसंबंधीआरोपण अवधि के urse. स्वचालित Edman अनुक्रमण द्वारा पहचान के लिए आरोपण के दौरान संगत के रुझान दिखा रहे हैं कि शुद्ध पेप्टाइड्स का प्रयोग करें.
  10. पेप्टाइड्स के स्वचालित Edman अनुक्रमण: एक Procise microsequencer का उपयोग कर स्वचालित Edman गिरावट से शुद्ध पेप्टाइड्स के एन टर्मिनल अनुक्रम का निर्धारण करते हैं. Polybrene का इलाज ग्लास फाइबर फिल्टर करने के लिए नमूना लोड. अगले कदम के लिए एक सी 18 स्तंभ (पीटीएच सी -18, 2.1 x 200 मिमी) 22 क्रोमैटोग्राफी द्वारा Phenylthiohydantoin अमीनो एसिड (PTH-Xaa) की पहचान की है. अनुक्रम प्राप्त करने के बाद, यह स्विस प्रोट डेटाबेस का उपयोग करते हुए ब्लास्ट सॉफ्टवेयर द्वारा पहचाना जा सकता है.

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Representative Results

ताकना ढ़ाल का गठन

PLLA समाधान की एकाग्रता से बदल रहा है, यह प्रत्यारोपण के extraluminal ओर pores के आकार को नियंत्रित करने के लिए संभव है. ध्यान में लीन होना आकार और आकार में काफी टाइटेनियम प्रत्यारोपण (आंकड़े 1a और 1b) की उपस्थिति से प्रभावित था. 40-100 माइक्रोन और कम सांद्रता का उपयोग छोटे pores में परिणामस्वरूप से ताकना आकार बताया गया. Intraluminal ओर ताकना आकार में प्रतिबंधित निष्कर्षण द्वारा शासित और fibroblasts का औसत आकार से कम लगभग 9 माइक्रोन 23 था, जबकि. बड़े pores के ताकना दीवारों अपने स्वयं सरंध्रता प्राप्त किया जा सकता है, जहां कमरे के तापमान पर एक ऊष्मायन कदम एक डबल झरझरा संरचना, जोड़ कर. यह गैस और पोषक आंदोलन (चित्रा -1 सी) की सुविधा होगी के रूप में यह सुविधा, मोटी प्रत्यारोपण के लिए महत्वपूर्ण है.

Nanofibrillar तहखाने झिल्ली नकल गठन

(चित्रा 2) पर कोलेजन / Alginate फिल्म परत को जोड़ने के लिए संभव है. इस फिल्म परत PLLA फोम के ऊपर स्थिर है और यह भी फोम (आंकड़े 3a और 3b) के अभाव में सतह पर रखा जा सकता है. फिल्म परत (चित्रा -3 सी) के रूप में होती नेनो पैमाने कोलेजन फाइबर के रूप में. फिल्म का विकास इस प्रकार कई सौ नैनोमीटर की एक मोटी फिल्म (चित्रा 3 डी) प्राप्त किया जा सकता है, घातीय है.

HPLC और आरोपण के बाद बाद में अनुक्रमण के साथ रक्त प्लाज्मा के विश्लेषण

झरझरा टाइटेनियम प्रत्यारोपण मेजबान ऊतक के साथ एकीकृत और पूरी तरह से vivo में 4-6 सप्ताह (चित्रा 4) के बीच भर रहे हैं. हालांकि, इस प्रक्रिया को जारी रखने के restenosis के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और PLLA संरचना के कारण ताकना ढाल की उपस्थिति में, कोई तंतुप्रसू उपस्थिति एक मनाया गयाआरोपण 20 के fter 6 सप्ताह. इस अवधि के दौरान HPLC विश्लेषण आरोपण के समय के पाठ्यक्रम के दौरान उतार चढ़ाव हो कि अलग चोटियों दिखाया. ब्याज की चोटी भिन्न अनुक्रम और सीआरपी रीडिंग के साथ एक इसी तरह की प्रवृत्ति से पता चला था जो अल्फा और बीटा हीमोग्लोबिन साढ़े चेन (चित्रा 5), होना निर्धारित है.

चित्रा 1
चित्रा 1. ताकना ढाल गठन की विधि. फ्रीज निष्कर्षण विधि के माध्यम से झरझरा PLLA फोम की तैयारी. Macroporous टाइटेनियम प्रत्यारोपण (आंतरिक) के साथ Macroporous टाइटेनियम प्रत्यारोपण (बाहरी) (सी) के साथ Macroporous टाइटेनियम प्रत्यारोपण (बाहरी) (बी) के बिना SEM के micrographs (ए). प्रत्यारोपण की उपस्थिति ताकना आकारिकी बदल दिया है. (सी, डी) एक ही प्रक्रिया appl जा सकता है ट्यूबलर प्रत्यारोपण में ध्यान में लीन होना ढ़ाल प्राप्त करने के लिए ट्यूबलर संरचना को आइईडी. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. Multifunctional प्रत्यारोपण विकास की योजना. एक छेद के आकार को ढाल प्राप्त किया जा सकता है एक सिंथेटिक बहुलक आधारित फोम के अलावा द्वारा, microbead आधारित झरझरा प्रत्यारोपण से शुरू. ताकना ढाल की आकृति आंशिक रूप से नए नए साँचे की संरचना द्वारा नियंत्रित किया जाता है. इस संरचना के शीर्ष पर एक तहखाने झिल्ली की तरह संरचना सेल लगाव और 2 डी में अस्तर गठन के लिए एक उपयुक्त सतह प्रदान करेगा, जो जोड़ा जा सकता है.

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चित्रा 3. एक तहखाने झिल्ली mimick के रूप में टाइटेनियम प्रत्यारोपण पर Nanofibrillar बहुपरत गठन. मोटी कोलेजन / Alginate multilayers (ए) टाइटेनियम केवल प्रत्यारोपण (400-500 माइक्रोन के एक औसत मनका के आकार के साथ) (बी) टाइटेनियम / PLLA फोम संकर की सतह पर विशेष रूप से गठित किया जा सकता है. (डी) मोटाई: यह सतह (~ 1 माइक्रोन मोटी) endothelial कोशिकाओं की कुर्की और प्रसार के लिए एक सब्सट्रेट (सी) multilayers के nanofibrillar प्रकृति AFM के विश्लेषण (30 माइक्रोन x 30 माइक्रोन स्कैन क्षेत्र) की विशेषता है प्रदान करता है multilayers खरोंच परीक्षण द्वारा निर्धारित किया जाता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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4 चित्रा. खरगोश इन विवो में झरझरा टाइटेनियम प्रत्यारोपण की एकता. Explanted प्रत्यारोपण पार वर्गों की Haemotoxylin और eosin धुंधला (ए) झरझरा क्षेत्रों को पूरी तरह से (बी) pores के भीतर ऊतक vascularization का एक अच्छा स्तर के साथ एक परिपक्व संयोजी ऊतक है vivo में 4-6 सप्ताह की अवधि के भीतर भरा जा सकता है .

चित्रा 5
चित्रा 5. HPLC और बाद में अनुक्रमण द्वारा एक आरोपण के पाठ्यक्रम पर प्लाज्मा प्रोटीन सामग्री की निगरानी. प्रतिनिधि एचपीएलसी घटता क्रमशः आरोपण के 3, 4 और 6 सप्ताह (ऊपर बाएं, ऊपर सही, नीचे जाने के बाद पशुओं के रक्त के नमूनों से प्राप्त चोटियों को दिखाने ). प्रत्येक चोटी एक विशेष प्रोटीन से मेल खाती है. मतभेदशिखर में अनुक्रमण (जैसे α और एसएस हीमोग्लोबिन साढ़े श्रृंखला के रूप में) द्वारा निर्धारित किया जा सकता है जो किसी दिए गए प्रोटीन के रिश्तेदार बहुतायत के अनुरूप हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

ताकना ढ़ाल इंटरफ़ेस ऊतक इंजीनियरिंग में महत्वपूर्ण औजार हैं और यहां वर्णित प्रणाली सेल प्रवास अध्ययन करने के लिए ताकना ढाल के लिए फार्म अकेले या धातु प्रत्यारोपण के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रणाली कार्बनिक विलायकों को संभालने के लिए एक रासायनिक धूआं हुड को छोड़कर किसी भी अतिरिक्त स्थापित करने या अतिरिक्त उपकरण की जरूरत नहीं है, इस प्रकार यह जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में लागू किया जा सकता है. ऐसे पाली (एसिड) (पीजीए), पाली (लैक्टिक सह glycolic) एसिड (PLGA) और पाली (caprolactone) (पीसीएल) के रूप में इसी तरह के पॉलिमर मामूली संशोधनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. कार्बनिक विलायकों में भंग नहीं होगा कि अन्य Macroporous संरचनाओं का भी इस्तेमाल किया जा सकता है. एक सतह पर छोटे आकार ताकना (nanoscale पर) प्राप्त करने के लिए, एक अतिरिक्त पतली nanoporous फिल्म परत गठन भी संभव है. यह पहली बार एक अत्यधिक अस्थिर विलायक में संरचना के शीर्ष पर बहुलक का एक पतला समाधान (1%) डाल (जैसे क्लोरोफॉर्म के रूप में) और फिर तुरंत एपी में डुबो कर चरण जुदाई के कारण द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैउरे इथेनॉल समाधान. इस तरह केवल एक सामग्री आधारित है जो एक सह संस्कृति प्रणाली प्राप्त किया जा सकता है.

निकासी तरल पदार्थ का आंदोलन यह द्वारा निर्धारित किया जाता है के रूप में Teflon मोल्ड डिजाइन ताकना आकार के नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है. निकासी तरल पदार्थ और निकासी तरल पदार्थ और विलायक pores के गठन को प्रभावित के बीच विनिमय की दर का आंदोलन. नियंत्रण आगे प्रत्यारोपण के माध्यम से निकासी तरल पदार्थ की लामिना का प्रवाह के आवेदन के द्वारा सुधार किया जा सकता है. निकासी तरल की मात्रा एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है और इसे इस्तेमाल बहुलक की राशि के संबंध में और भी प्रत्यारोपण के आकार के संबंध में व्यवस्था की जानी चाहिए. बेलनाकार 2mm मोटाई के साथ प्रत्यारोपण और 500 माइक्रोन चिकित्सा ग्रेड टाइटेनियम मोती का गठन 11 मिमी व्यास के लिए 200 मिलीलीटर की एक निकासी स्नान आवश्यक है. Calcein-AM सेल आकारिकी का एक बेहतर अवलोकन प्रदान करता है, जबकि सेल प्रवास के अध्ययन के लिए, PKH26 दीर्घकालिक प्रवास के अध्ययन के लिए एक बेहतर विकल्प है. योग्यता के रूप मेंZ-दिशा में सेल आंदोलन की ntification सेलुलर आंदोलन पर नियंत्रण के लिए इन विट्रो माप में एक अप्रत्यक्ष है. इसके अलावा इस प्रणाली या तो प्रत्यक्ष बोने से या जेल कैप्सूलीकरण 24 का उपयोग कर मानक angiogenesis assays का उपयोग, प्रत्यारोपण के इन विट्रो vascularization में की मात्रा का ठहराव के लिए endothelial कोशिकाओं के साथ प्रयोग किया जा सकता है.

वहाँ इस तरह के electrospinning या चरण जुदाई के रूप में कई उपलब्ध nanofiber गठन के तरीके हैं, लेकिन कोलेजन की electrospinning आम तौर पर कोलेजन तंतुओं denature माना जाता है. परिशुद्धता के उच्च स्तर के साथ आवश्यक तंतुमय संरचना प्रदान करते हुए एक polyelectrolyte आधारित संरचना का उपयोग विकृतीकरण की रोकथाम सुनिश्चित करता है. इसके अलावा LBL तरीकों जटिल प्रत्यारोपण आकार के लिए अनुकूल करने के लिए आसान कर रहे हैं. झरझरा संरचना पर फिल्म परतों सेलुलर घटकों के बीच बातचीत पर अधिक नियंत्रण के साथ transwell की तरह assays विकसित करने के लिए सरल तरीके हैं. यह confoca साथ निरीक्षण करने के लिए संभव हैएल माइक्रोस्कोपी प्रत्यारोपण पर ऊपर परत. इस तरह के उपकला कोशिकाओं या endothelial कोशिकाओं के रूप में प्रत्यारोपण के साथ संपर्क में multilayers साथ प्रासंगिक प्राथमिक कोशिकाओं की बातचीत का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 25 अलग या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या तो कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जा सकता है. इस फिल्म परत एक ट्यूबलर अंग के लिए एक अंदरूनी परत में विकसित किया जा सकता है, जहां एक सतह प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, इस विशेष मामले में उद्देश्य श्वासनली के लिए एक कृत्रिम झिल्ली का विकास किया गया है, और इस संरचना श्वसन उपकला 23 के लिए उपयुक्त होना दिखाया गया था.

परत की मोटाई फिल्म एक बाधा (24 द्विशताब्दी परतों) के रूप में कार्य करने के लिए काफी मोटी है जहां एक स्तर पर सेट किया जाता है. दोनों टाइटेनियम में सब्सट्रेट एक अपेक्षाकृत सपाट फिल्म परत की hydrophobicity के कारण ही और टाइटेनियम / PLLA प्रत्यारोपण pores, संरचना और नवगठित फिल्म परत के बीच इंटरफेस की स्थिरता के लिए योगदान जहां प्रत्यारोपण, पर गठित किया जा सकता है. उपलब्ध तिर्यक अलावा मुझेthods, genipin तिर्यक पशु experimentations के लिए सबसे उपयुक्त है. ऐसे glutaraldehyde के रूप में अन्य तिर्यक तरीकों, ईडीसी / एनएचएस भी इस्तेमाल किया, लेकिन वे आम तौर पर कम सेल लगाव हो सकती है. एक और संभावना photocrosslinkable कोलेजन 26 उपयोग करने के लिए है.

यह समझने में अधिक गहराई प्रदान हो सकता है के रूप में प्रोटीन अनुक्रमण, प्रत्यारोपण की निगरानी के लिए एक आशाजनक तरीका है. प्राप्त प्रोटीन की प्रकृति के अनुसार, यह आरोपण के प्रणालीगत प्रभाव अनुमान और भी बारीकी से इस तरह के सांस की नली प्रत्यारोपण के मामले में प्रत्यारोपण एक मोहरबंद क्षेत्र में नहीं है जहां के मामलों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं जो संभव संक्रमण पर नजर रखने के लिए संभव है . संक्रमण का जल्दी पता लगाने के लिए एक समय पर ढंग से संक्रमण संबंधी जटिलताओं की रोकथाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. HPLC प्रोफ़ाइल प्राप्त किया जा सकता है ब्याज की कई प्रोटीन के साथ कई चोटियों के रूप में इस तरह के सीआरपी या सीजीए के रूप में एक दिया प्रोटीन का एक लक्षण वर्णन की तुलना में अधिक जानकारी प्रदान कर सकते हैंइस विधि के साथ एड. उदाहरण के लिए, अल्फा और सांस की नली प्रत्यारोपण के साथ खरगोश के लिए बीटा हीमोग्लोबिन साढ़े जंजीरों हमारे पूर्ण सांस की नली प्रतिस्थापन मॉडल में सीआरपी रीडिंग के साथ इसी तरह के रुझान दिखाया है. इस तरह बहुमुखी प्रतिभा वर्णित तकनीक के सुधार के साथ काफी सटीकता के साथ मिनट प्रणालीगत प्रभाव के निर्धारण के लिए एक स्थल प्रदान करेगा.

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Disclosures

पूर्वोत्तर Vrana Protip एसएएस के एक कर्मचारी है.

Acknowledgments

लेखक पशु प्रयोगों के साथ उनकी मदद के लिए निर्माण हुआ Teflon के सांचों और डॉ. जी Prevost के लिए निर्माण टाइटेनियम प्रत्यारोपण के लिए डॉ. आंद्रे Walder और निकोलस पेरिन, लालकृष्ण Benmlih धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी वित्तीय योगदान के लिए क्षेत्र एल्सेस और PMNA (ध्रुव MATERIAUX एट नैनोसाईंसिस d'Alsace) स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Dioxane Sigma-Aldrich 360481 Toxic material, Strictly under chemical hood
PLLA
i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g
ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g 		Sigma-Aldrich 94829, 81273 The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent.
PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) Novamatrix 4200006 Low viscosity(20-200 mPa.s)
Collagen type I (Bovine) Symatese CBPE2US100
Pen/Strep, Fungizone Promocell C42020
Genipin Wako 0703021
Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. Bruker MSCT
Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% Sigma-Aldrich 302031 Hazardous Material, Please follow MSDS carefully
Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% Sigma-Aldrich 34998
Calcein-AM Invitrogen C3100MP
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma-Aldrich PKH26GL
Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit Genway Bio GWB-9BF960
DMSO, Bioreagent, ≥99.7% Sigma-Aldrich D2650
Equipment
Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope Bruker
Procise microsequencer Applied Biosystems
Ultima 3000 HPLC system Dionex
Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 Hitachi
Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 Zeiss

Table 1. List of Materials and Reagents.

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References

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बायोमेडिकल इंजीनियरिंग अंक 77 जैव अभियांत्रिकी चिकित्सा एनाटॉमी फिजियोलॉजी बायोफिज़िक्स सेलुलर जीवविज्ञान आण्विक जीव विज्ञान पदार्थ विज्ञान जैव चिकित्सा और दंत चिकित्सा सामग्री कम्पोजिट सामग्री धातु और धातु सामग्री अभियांत्रिकी (सामान्य) टाइटेनियम ताकना ढाल प्रत्यारोपण, रक्त विश्लेषण फ्रीज निकासी फोम प्रत्यारोपण प्रत्यारोपण नैदानिक ​​अनुप्रयोगों
ताकना अनुपात में, Polyelectrolytes और उनके अप्रत्यक्ष निगरानी के साथ धातु समाविष्ट की मल्टी स्केल संशोधन<em&gt; विवो में</em
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Vrana, N. E., Dupret-Bories, A.,… More

Vrana, N. E., Dupret-Bories, A., Chaubaroux, C., Rieger, E., Debry, C., Vautier, D., Metz-Boutigue, M. H., Lavalle, P. Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50533, doi:10.3791/50533 (2013).

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