Summary
このビデオでは、それらの機能を改善し、細胞移動を制御するために多孔性金属インプラントのための改質技術を実証する。技術は、3Dおよび基底膜の製造は2-Dにおける細胞移動を制御する模倣における細胞移動を制御するための細孔勾配の発達が挙げられる。また、血液タンパク質の分析を介して生体内インプラント統合を監視するためのHPLCベースの方法が記載されている。
Abstract
特に、金属インプラント、チタンインプラントは、広く臨床応用に使用されている。組織におけるこれらのインプラントへと統合·成長の組織が成功した臨床転帰のための重要なパラメータである。組織の統合を改善するために、多孔性金属インプラントが開発されてきた。細孔領域は全体構造の機械的特性を損なわずに官能化することができるので、金属発泡体の開気孔率は、非常に有利である。ここでは、チタンのマイクロビーズに基づく多孔質チタンのインプラントを使用して、このような変更を説明します。チタンなどの疎水として固有の物理的性質を用いることにより、基底膜を有するようにマイクロビーズ系金属インプラント内であると同時に疎水性の細孔勾配を得ることができる親水性、天然ポリマーに基づく模倣。 3次元細孔勾配は、例えば、凍結抽出法によるポリ-L-乳酸（PLLA）などの合成ポリマーによって形成されている。 2Dナノファイバーシュール面は天然架橋剤（ゲニピン）との架橋工程に続いて、コラーゲン/アルギン酸塩を用いて形成されている。このナノファイバー膜は2つの反対荷電分子の層（のLbL）蒸着法、コラーゲンとアルギン酸塩によって層によって建てられました。最後に、これは多くの多細胞組織のために必要であるように異なる領域が、異なる細胞型を収容することができるインプラントを得ることができる。により、異なる細胞型によって異なる方向にこのようセルラー移動を制御することができる。このようなシステムは、気管再生の特定の場合について説明するが、他の標的器官のために変更することができる。細胞遊走と異なる孔勾配を作成するための可能な方法の分析が精緻化される。そのようなインプラントの分析における次のステップは、移植後のそれらの特徴付けである。しかし、金属製のインプラントの組織学的分析は、生体内で金属製のインプラントに監視ホスト反応のためにこのように長くて面倒なプロセスですCGAと異なる血液タンパク質監視に基づいてlternative方法も記載されている。これらの方法は、インビトロ 、カスタムメイドの移行およびコロニー形成試験に現像に使用することができ、また、組織学せずインビボで官能化された金属インプラントの分析のために使用される。
Introduction
現在利用可能な金属製のインプラントは、荷重支持用途に適しているが、それらの非分解性はそれらに1を囲む組織との強力な界面を確保するための設計を必要とする。 インビボでのコロニー形成および成長中の細胞促進する構造を設けることにより、金属インプラントの寿命が2延ばすことができる。公然と多孔性金属インプラントは、また、インプラントの良い植民地を確保するための組織界面工学のための材料を約束している。それらが積極的に整形外科用インプラントとして、また、気管3-5インプラントとして使用されている。しかしながら、このような細孔分野における細胞運動を正確に制御するように解決すべき問題が残っています。このプロセスを制御するために、障害が発生しても、他の一端および再狭窄に不完全な植民地化につながる可能性があります。また、これらのインプラントの更なる官能化は、例えば成長因子の送達等の高機能を実現するために必要である、異なる細胞タイプ6-8の指示血管新生と同時移動。血管組織によるインプラントのコロニー形成が望まれるように気管インプラントのために、これは重要である。それはインプラントの開存性を低下させるので、気管内腔への成長の制御不能な組織は望ましくない。
細胞運動を制御するための一つの可能性は、サイズ排除である。標的細胞と指定された合成ポリマーと相互作用する能力の大きさを知ることにより、効果的に細胞運動の深さを決定することができる細孔の勾配を開発することが可能である。例えばこのような外性線維芽細胞などの結合組織細胞の侵入のために十分な大きさですが、管腔内管状インプラントの植民実効支配を彼らの動きを防ぐために（10μm未満）十分に小さい細孔アーキテクチャを作成することによって達成することができる。
このような凍結dryiとして利用ポア作成方法からngの、粒子浸出、9,10発泡ガス、必要な機器の最小限の細孔勾配の迅速形成するための方法を適応するのが最も簡単で凍結抽出11である。この方法では、ポリマー溶液は、有機溶媒と水との二元混合物中で凍結される。その後、溶媒をエタノールなどの混和予め冷却液によって抽出を介して交換される。凍結および抽出条件は、細孔の形状及び大きさを決定し、抽出、抽出液の移動を制御することができる方法で行われている場合、孔サイズおよび形状は一方向に変調することができる。
多細胞組織のための第二のステップは、それらの相互作用を制御するために、異なる細胞タイプ間の多孔障壁の形成である。これはまた、それらの要件12,13に応じて、異なる種類の細胞ごとに異なる微小環境の可用性のために必要である。気管はbronchと喉頭をつなぐ管状の器官である私。それは粘液を作り出す相互分散杯細胞とインナーpseudostratified繊毛上皮の裏地を持っています。気管の3次元構造および安定性がCリング状の軟骨によって維持される。このように、人工的な気管内結合組織と毛様体上皮層の間に定義されて接合があるはずです。 3D構造は結合組織の部分のために必要であるが、上皮細胞の遊走は、創傷の方向の動きとクロージャを達成するために、基底膜のような表面を必要とします。高分子電解質多層膜（PEMは）基底膜の模倣を取得するための一つの可能なオプションです。層毎法（のLbL）は薄く、機能表面コーティングを得るための多用途のプロセスである。それは、その特性がそのような高分子電解質種、pHを単に変える変数によって変化させることができるナノスケールの表面コーティングを得るために順次に2つの反対に荷電した高分子電解質とそのビルドアップ、静電的相互作用に基づいているレイヤ番号、キャッピング層の添加、架橋等のLbL方法の主な利点の1つは、下地基板のトポグラフィに準拠する能力である。このように、制御された条件下でこの方法はまた、多孔質構造の表面被覆率を得るために使用することができる。コラーゲンは、高分子電解質の1つとして使用されている場合には、基底膜の表面を模倣することができるナノファイバーの構造を得ることができる。チタンの疎水性は、14このような構造の開発を可能とfibrillarityは厚いコーティングで保存することができます。この方法は、表面上の細胞の接着と移動も制御することができる。順次抽出し、凍結のLbLフィルムコーティングを用いることにより、細胞運動を長手方向と円周方向に、横方向に制御することができる構造が15を得ることができる。
ここでは、することができ、それらの疎水性の動作を使用することにより、チタンインプラントのための2つの新たな修正方法を説明します疎水性合成ポリマーii）の細胞増殖および高分子電解質多層によるライニングの形成をサポートするインプラント表面上に厚さのポリマーフィルム層の形成とマクロポーラス酸化チタンインプラント内のマイクロポアの勾配のi）の形成：種々の多孔質インプラントの変形例に延長した。これらの方法は、連続的に又は別々に使用することができる。彼らは管理された移行と多細胞組織16,17で異なる種類の細胞の空間的な組織化を確保する構造を提供します。気管の具体的なケースでは、インプラントのための望ましい結果は、再狭窄および高分子電解質多層膜上の繊毛上皮細胞の内側のライニングを形成することなく細孔勾配内線維血管組織による植民地化されるだろう。
インプラントの統合を制御する一つの方法は、in situで 、ホストとの集積化の期間中に小さな外科的介入を行うことである。できるTようにするために介入のタイミングを決定し、O、それはインプラントの全身作用に関する情報を有することが重要である。 C反応性蛋白（CRP）は、感染および臨床の場における炎症反応のモニタリングに使用されている。クロモグラニンAは（CGA）も同様に使用することができ、炎症18のレベルを観察するために、より正確な結果を提供するかもしれない。 インビボでの金属インプラント統合を観察可能な方法として、我々は高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）およびその後のタンパク質配列決定による動物の血液試料の特性によってインプラント全身作用を連続的に監視手順を示す。この方法の精緻化は、通常、エンドポイント組織学的分析を回避するために使用することができる。金属インプラントの組織切断が長く、面倒で高価なプロセスであり、特定の時点で行うことができる。この理由から、インプラント健康について堅牢な情報を提供する血液検査でしょううまく設計された動物実験に関する最近のEU規則で義務付けられて動物実験を減らすために可能なルートである。
ここに提示方法は官能化を介して、金属インプラントの性能を向上させる、または既存のインプラントを監視する別の方法を有するように使用することができる。
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Protocol
1。マクロポーラス金属インプラントにおける微小孔グラデーションの調製
- エタノールでインプラント（例えば400-500ミクロンのサイズ範囲、Neyco SAS、フランスで医療グレードチタンビーズで作られたインプラントなど）をきれいにした後、15分間アセトン中で超音波処理。
- インプラントのサイズや形状に合わせて設計·製造テフロン型（標準実験のために、2cmの高さと直径1.5cmの円筒状金型が使用されている）。金型は、特定の部分が抽出時に除去することができるように、モジュラーなければならない。このような金型の設計が導かようにして抽出液の移動を強制することによって、抽出プロセスの制御を確実にする。
- i）は、インプラントのサイズ、IIを決定するため底部）マンドレルと取り外し可能ですⅲ）アウターコア：気管を置き換えるために設計された筒状のインプラントの場合は、構造は3つの部分から構成されるべきである。このように、孔径勾配が内側に向かって外側から形成することができる。 <李は>合成高分子（PLLA）溶液を調製：凍結/抽出のためPLLAソリューションは、ジオキサンおよび水（：V 87:13％、v）との二元混合で準備する必要があります。
- 均一な溶液を得るために60℃に混合物を加熱する。 60°Cは、インプラントへの溶液の導入のために使用される精密したガラスシリンジ用温度抵抗の上限であるとして選択。
- 高濃度（≥6％）、高分子量PLLA溶液が使用される場合、即座に加熱した後、インプラントに溶液を導入する。そうでなければ、溶液のゲル化は、フルイマージョンずに発生します。
- インプラントの気孔率に対する必要性高分子溶液の体積を計算し、凍結溶液の体積の精度変化を考慮に入れることができる。
- 0.1μlの精度で精密ガラス注射器とインプラントへのソリューションをご紹介します。ポリマー濃度の下限である再現可能な細孔勾配形成のための3％それが6％上記の厚い試料で均一な分布を得ることが困難になる一方。しかし、特定の用途のために他の濃度を使用することができる。
- サンプルを直接-80℃で、または室温で30分の前に潜伏期間のいずれかを凍結。凍結条件は、部分的に孔形成を決定し、このようにして凍結条件を目的とする気孔率に応じて調整することができる。 -80℃でサンプルを一晩続ける℃の
- 抽出：80％プリチルドEtOHにインプラントを浸します。一晩-20℃で抽出を行う。気孔率勾配を得るためには、管状のインプラントと円盤状のインプラントのための底部分を除くすべての部分のための心棒を除くすべての金型部品を取り外します。金型を簡単に分離するためにあらかじめ冷却メスを使用してください。
- -20℃で一晩19で抽出した後、残りの金型部品を取り外し、空気がインプラントを乾燥させます。特性評価のための構造体の水銀ポロシメーター分析の全体的な気孔率が必要である。水銀ポロシメータ測定は、インプラントと相互分散より小さい孔の両側の孔に対応する明確なピークを示した。しかしながら、より重要なデータは、走査型電子顕微鏡（SEM）20と孔サイズ分布のための画像Jによって分析することができる管腔内と管腔外表面の気孔率の差である。毛穴勾配の検証のために、サンプルを凍結破砕とSEMで断面を観察します。
- 使用されるインプラント、及びチタンの容量を反射光の開放多孔性の性質のため、多孔質インプラント内に標識された細胞のzスタックを行うことが可能である。 PKH26またはカルセイン-AMで細胞を標識し、共焦点レーザー顕微鏡でインプラントを可視化する。
2。コラーゲン/アルギン酸多層膜と多孔性金属インプラントの表面コーティング
- ビルドアップのために多層のうち、最も高い再現性を浸漬ロボットが得られる。ディッピングロボットが利用できない場合は、これらの手順を手動で行うことができます。
- 医療グレードI型コラーゲンとアルギン酸ナトリウムを使用してください。最適化された濃度は、pHが3.8にクエン酸緩衝液中のNaCl 150mMの中でそれぞれに0.5グラム/ Lである。
- 溶液の均質性を確実にするために一晩コラーゲン溶液に溶解する。 3.8の酸性pHが必要である構造が中性pHにおける架橋前の不安定なような層の安定したビルドアップのために。
- 代替的に、コラーゲンおよびアルギン酸塩の溶液に浸漬することにより、インプラントを浸漬するロボットシステムにより層を堆積させる。堆積時間は、各後続層15分である。 5分間のpH 3.8で150mMのNaClで堆積ステップ間に構造をすすぐ。
- 高分子電解質多層生産に使用される浸漬ロボットとインプラントの利用のためのデザイン固有のホルダー。どちらチタンの表面のみimplaに層を堆積NTSまたはインプラントは第1節で説明したように修正された。
- 基底膜の安定化ゲニピンと模倣：V比：1：04 Vでのジメチルスルホキシド（DMSO）/クエン酸緩衝液（150mMのNaCl、pHは3.8）で架橋溶液を準備します。広範囲の濃度が使用され、100mMのは、架橋のために十分であることができる。 DMSOコンポーネントに最初ゲニピン及び凝集を回避するために、後で水成分を加え溶かす。
- 12〜24時間の間に架橋溶液中に浸漬することによって試料を架橋する。その後クエン酸緩衝液のおびただしい量（pH値3.8）で洗い流してください。
- 洗浄工程の後、UV処理（30分）または抗生物質/抗真菌薬浴（ペニシリン/ストレプトマイシン、ファンギゾン）のいずれかのサンプルを滅菌する。
- 模倣基底膜の品質を決定する主なパラメータは、その厚さ及び繊維の直径である。接触モードで得られた原子間力顕微鏡（AFM）画像を用いて繊維直径を算出する。のサンプルを乾燥させ撮像前の窒素フロー。画像Jソフトウェアとフィブリルの平均厚さを決定するには画像あたり少なくとも10の繊維の太さを定量化する。
- フィルムの厚さは、AFMを用いてスクラッチ試験によって決定することができる。ドライ（COL / ALG）24 / COL多層フィルム。フィルムに傷を注射針を使用してください。光顕微鏡でスクラッチの局在した後、スクラッチの境界にある10×10μmの2面にAFMで画像を得る。フィルム層の厚さを提供するAFMソフトウェアを用いて得られたプロフィールから高さを計算する。
3。血漿の分析によってインビボでインプラントの統合の間接的モニタリング
- 必要なすべての委員会の承認は各国21統治規則に従って動物実験のために取られるべきである。我々のケースで実験動物のケアと利用（国立研究評議会、2010）のためのガイドが続いていると目のストラスブールの倫理委員会の大学の電子承認が得られる。
- 標的部位に注入を行う。ここで与えられた血液モニタリングプロトコルを15mm気管切除のニュージーランド白ウサギに気管の交換のために使用された。
- 移植後のフォローアップの毎日は、このようなと自分の体重を記録する一般的な動物のウェルビーイング（手術部位、呼吸の速度周り治癒）montioringとして必要である。
- 血液検査を検証するには、血中CRP値のためのELISAテストなどの十分に確立されたメソッドを使用します。多くの動物のためのCRP検査が利用可能であり、ウサギのために使用される特定の試験は、 表1に記載されている。同様に、西部はCGAレベルの測定のためにブロッティング使用。モノクローナル抗CGA抗体（抗CGA 47-68）は 、このプロトコルを使用した。
- プラズマの特性評価のために、ウサギの耳介静脈から血液サンプルを得る。 4℃で20分間5,000 rpmで遠心°; C.分析のために得られた上清を使用してください。我々の手順では、これらの試験は、週ごとに行うが、より頻繁なテストも可能であるている。
- 血漿タンパク質含量の相HPLC精製を逆：0.1％トリフルオロ酢酸（1:1であり、v：v）でウサギ血漿を抽出する。ダイオネクスHPLCシステム（アルティメット3000、サニーベール、CA USA）を使用してエキスを精製300-5C18-カラム逆相ヌクレオシルに（4×250ミリメートル、粒径が5μm、空隙率、300Å）。
- 214と280nmの吸光度を記録します。使用される溶媒系は、i）で溶媒：水およびii 0.1％（v / v）のトリフルオロ酢酸（TFA））溶媒B：0.09％（v / v）の70％でTFA（v / v）のアセトニトリル - 水。
- 溶出のためにグラデーションを使用して700μL/分の流量を使用してください。ピーク分画を収集します。高速真空アプリケーションによって蒸発によって分画を集中。それは完全な乾燥度前にスピード真空を停止することが重要です。
- 共同以上の異なる時間点で得られたピークを関連付ける移植期間のURSE。自動エドマン配列決定によって同定するための移植の過程で一貫した傾向を見せている精製されたペプチドを使用してください。
- ペプチドの自動エドマンシング：Prociseマイクロシーケンサを使用した自動エドマン分解によって精製されたペプチドのN末端配列を決定します。ポリブレン処理したガラス繊維フィルターにサンプルをロードします。次のステップは、C 18カラム（PTH C-18、2.1×200 mm）の22上のクロマトグラフィーによるフェニルチオ-アミノ酸（PTH-Xaaは）の同定である。配列が得られた後、それはSWISS-Protのデータベースを使用してブラストソフトウェアによって識別することができる。
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Representative Results
毛穴勾配の形成
PLLA溶液の濃度を変えることにより、インプラントの管腔外側の細孔の大きさを制御することが可能である。孔の大きさや形状が著しくチタ ンインプラント（ 図1a及び1b）の存在によって影響を受けた。 40-100程度と低濃度の利用の範囲であった細孔サイズが小さな孔が生じた。腔内側孔径に制限された抽出によって支配と線維芽細胞の平均サイズより小さい約9μmの23、であった、一方。大きな細孔の細孔壁が自分の気孔率を得ることができる有し、室温でインキュベーション工程ダブル多孔質構造を追加します。それはガスと栄養素の動きを（ 図1c）が容易になるので、この機能は、太いインプラントのために重要である。
ナノファイバー基底膜模倣形成
図2）コラーゲン/アルギン酸フィルム層を追加することが可能である。このフィルム層はPLLA発泡体の上に安定しており、それはまた、発泡体（ 図3a及び図3b）の非存在下で表面に維持することができる。ナノコラーゲン繊維が（ 図3c）フィルム層の成長に合わせて形成します。膜の成長は、このように数百ナノメートルの厚さの膜（ 図3d）を得ることができる、指数関数的である。
移植後HPLCおよびその後の配列決定と血漿の分析
多孔質チタンインプラントは、宿主組織と統合し、完全に生体内で 4〜6週間（ 図4）の間に充填されています。しかし、このプロセスの継続は、再狭窄につながることができ、PLLA構造により細孔勾配の存在下で、まだ線維芽細胞の存在が観察されなかった移植20の上げ装置6週間。この期間中にHPLC分析は、注入の時間経過の間に変動する明確なピークを示した。関心のピーク画分を配列決定し、CRPの測定値と同様の傾向を示していたアルファおよびベータヘモグロビン½鎖（ 図5）、と判断される。
図1。細孔勾配形成方法。凍結抽出法を介して多孔PLLA発泡体の調製。マクロポーラスチタンインプラント（インナー）とマクロポーラスチタンインプラント（外）（C）とマクロポーラスチタンインプラントなしのSEM顕微鏡写真は、（）（外）（B）。インプラントの存在は、細孔の形態を変更しました。（C、D）と同じプロセスはAPPLすることができます筒状のインプラントで毛 穴勾配を得るために、管状構造にiedを。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。多インプラント開発のスキーム。マイクロビーズ系多孔質インプラントから出発して、合成ポリマーベースの発泡体を添加することにより細孔径勾配を得ることができる。細孔勾配の形状は、部分的に金型の構造によって制御される。この構造の上に基底膜状構造は、細胞付着および2Dでライニング形成に適した表面を提供する、これを添加することができる。
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図3。基底膜の模倣等のチタンインプラント上のナノファイバー積層形成 。太いコラーゲン/アルギン酸多層膜（A）はチタンのみのインプラント（400-500ミクロンの平均ビーズサイズ付）（B）チタン/ PLLA泡ハイブリッドの表面に特異的に形成することができる。の（D）厚さ：この表面は（〜1μmの厚さ）（C）多層膜のナノファイバーの性質をAFM分析（30ミクロン×30μmのスキャン領域）によって特徴付けられる内皮細胞の付着と増殖用基板を提供しています多層は、スクラッチ試験により決定されますより大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図4。ウサギ生体内における多孔質のチタンインプラントの統合 。植インプラント断面のヘマトキシリン＆エオシン染色（）は、多孔質の領域が完全に（B）の細孔内に組織が 血管新生の良いレベルを持つ成熟した結合組織であり、生体内で 4〜6週間の期間内に充填することができる。
図5。 HPLCおよびその後の配列決定により注入の過程でプラズマのタンパク質含有量を監視する。代表HPLC曲線は、それぞれ注入3,4および6週（左上、右上、左下の後、動物の血液サンプルから得られたピークを示す）。各ピークは、特定のタンパク質に対応しています。違いピークでシーケンシング（例えば、αとβ-ヘモグロビン½鎖など）により決定することができる任意のタンパク質の相対量に対応しています。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
細孔勾配は、インタフェース組織工学における重要なツールであり、ここで説明するシステムは、細胞遊走を研究するために細孔勾配を形成するために、単独で、または金属インプラントと組み合わせて使用することができる。システムは、有機溶剤を扱う化学ヒュームフードを除く任意の余分な設定や特別な機器を必要としない、したがって、それは、生物学の研究室に適用することができます。例えば、ポリ（グリコール酸）（PGA）、ポリ（乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）及びポリ（カプロラクトン）（PCL）と同様のポリマーは、わずかな変更を加えて使用することができる。有機溶媒に溶解しないだろうし、他のマクロ孔構造を用いることもできる。一面に小さい孔径（ナノスケールで）得るために、追加の薄いナノ多孔質膜層形成も可能である。これは、最初に揮発性の高い溶媒た構造の上にポリマーの希薄溶液（1％）を入れて（クロロホルム等）、その後すぐにapに浸漬して相分離させることにより得ることができるUREのエタノール溶液。この方法は、1つの材料基づいて共培養系を得ることができる。
抽出液の移動が、このことによって決定されるテフロンモールドの設計は、細孔径の制御のために重要である。抽出液と抽出液と溶剤の間の為替レートの動きは、細孔の形成に影響を与えます。コントロールはさらに、インプラントを介して抽出液の層流の適用により向上させることができる。抽出液の量が重要なパラメータであり、それは使用されるポリマーの量に対して、また、インプラントの大きさに対して配置されるべきである。円筒形の2mm厚でインプラントと500μmの医療グレードチタンビーズで形成された11ミリメートルの直径のために200ミリリットルの抽出槽が必要である。カルセイン-AMは細胞の形態のより良い観察を提供するのに対し、細胞の移動を研究するため、PKH26は長期の移行研究のためのより良いオプションです。資格でz方向における細胞運動のntificationは、細胞移動を制御するためのin vitroでの間接測定である。また、このシステムは、直接播種又はゲルカプセル24を使用して、標準血管新生アッセイを用いて、インプラントのインビトロ血管新生内の定量化のための内皮細胞を使用することができる。
そこにこのようなエレクトロスピニング又は相分離などのいくつかの利用可能なナノファイバーの形成方法があるが、コラーゲンのエレクトロスピニングは、一般に、コラーゲン線維を変性させると考えられる。精度の高いレベルで必要な線維構造を提供しながら、高分子電解質ベースの構造の利用は変性の防止を確実にします。またのLbL方法は、複雑なインプラント形状のために適応させることが容易です。多孔質構造上のフィルム層は細胞成分間の相互作用をより詳細に制御をトランスウェルのようなアッセイを開発するためのシンプルなメソッドです。 confocaで観察することが可能であるL顕微鏡インプラントに最上層。これは、上皮細胞、または内皮細胞などの移植片と接触して多層に関連した一次細胞の相互作用を観察するために使用することができる。 25単離された又は市販のいずれかの細胞を用いることができる。このフィルム層は、管状器官のインナーライニングを開発することができる表面を提供する。例えば、この特定の場合には目的は、気管ための人工膜を開発することであり、この構造体は気道上皮23に適していることが示された。
層の厚さは、膜は、バリア（24双層）として作用するに十分な厚さレベルに設定される。両方のチタン基材に比較的平坦なフィルム層の疎水性のためにのみ、チタン/ PLLAインプラントは、細孔構造および新たに形成された薄膜層との界面の安定性に寄与インプラントを形成することができる。利用可能な架橋のうち、私thodsは、ゲニピン架橋は、動物実験法に最も適しています。グルタルアルデヒドのような他の架橋方法、EDC / NHSを用いても、それらは一般的に少ない細胞付着をもたらすことができる。別の可能性は、光架橋コラーゲン26を使用することである。
それは理解の深さでより多くを提供するかもしれないとして、プロテインシーケンシングは、インプラントを監視するための有望な方法である。得られたタンパク質の性質によると、注入の全身作用を推測することも密接にかかる気管インプラントの場合のように、インプラントが密封された領域内にない場合には特に重要である可能性感染症を監視することが可能である。感染症の早期発見には、タイムリーに感染関連合併症の予防につながることができます。 HPLCプロファイルを得ることができます興味のあるいくつかのタンパク質を持ついくつかのピークのようなCRPやCGAとして所定のタンパク質の単キャラに比べてより多くの情報を提供することができますこの方法でED。例えば、気管インプラントウサギのアルファとベータヘモグロビン½チェーンは、当社全額気管交換モデルでCRPの測定値と同様の傾向を示している。このような多様性は説明された技術の改良と素晴らしい精度で微細な全身的な効果を測定するための場を提供するでしょう。
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Disclosures
NEブラーナはProtip SASの従業員である。
Acknowledgments
著者らは、動物実験で彼の助けのためにビルドアップテフロンモールド博士G.プレボのため製造チタンインプラント博士アンドレワルダーとニコラ·ペラン、K. Benmlihに感謝したいと思います。また、財政的な貢献のために地域アルザスとPMNA（ダルザスポールMateriauxらナノサイエンス）を認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss | ||
Table 1. List of Materials and Reagents. |
|||
References
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