Summary
Bu videoda, onların işlevselliğini artırmak ve hücre göçü kontrol etmek için gözenekli metalik implantlar için modifikasyon tekniklerini gösterecektir. Teknikleri 3D ve bazal membran üretimi 2-B hücre hareketini kontrol etmek için taklit hücre hareketini kontrol etmek için gözenek geçişlerini geliştirilmesi yer alıyor. Ayrıca, kan proteinlerinin analizi ile in-vivo olarak izlenmesi implant entegrasyonu için bir HPLC-tabanlı bir yöntem tarif edilmektedir.
Abstract
Özellikle metalik implantlar, titanyum implantları, yaygın klinik uygulamalarda kullanılır. Dokularda bu implantlara ve entegrasyon-büyüme Doku başarılı klinik sonuçlar için önemli parametrelerdir. Doku entegrasyonu geliştirmek için, gözenekli metalik implantlar geliştirilmektedir var. Gözenek alanları, bütün yapının mekanik özellikleri tehlikeye atmadan fonksiyonalize edilebilir çünkü metal köpükler açık gözeneklilik çok avantajlıdır. Burada titan, mikro-gözenekli göre titanyum protezler kullanarak bu tür değişiklikleri açıklar. Bu tür titanyum hidrofobik olarak doğal fiziksel özelliklerini kullanarak, bir bazal membran hidrofilik, doğal polimerler esas taklit olması mikroboncuk esaslı metalik implantlar içinde ve aynı zamanda hidrofobik gözenek gradyanları elde etmek mümkündür. 3D gözenek gradyanları gibi dondurarak ekstraksiyon yöntemiyle poli-L-laktik asit (PLLA) gibi sentetik polimerler ile oluşturulmaktadır. 2D nanofibrillar suryüzleri doğal bir çapraz bağlayıcı (genipin) ile bir çapraz bağlama adımı takip kollajen / aljinat kullanılarak oluşturulmaktadır. Bu nanofibrillar film tabakası (LBL) iki zıt yüklü moleküller, kollajen ve aljinat birikimi yöntemi ile tabaka ile inşa edildi. Son olarak, bu pek çok hücreli dokular için gerekli olduğu kadar farklı alanlarda farklı hücre tipleri kalabileceği bir implant, elde edilebilir. Tarafından, farklı hücre tipleri, farklı yönlerde bu şekilde hücresel hareket kontrol edilebilir. Böyle bir sistem, trakea rejenerasyon belirli bir durum için ayrı tarif edilmektedir, fakat diğer hedef organlar için modifiye edilebilir. Hücre göçü ve farklı gözenek gradyanları oluşturmak için olası yöntemleri analizi detaylandırılmıştır. Bu tür implantlar analizinde bir sonraki adım implantasyondan sonra karakterizasyonudur. Ancak metalik implantlar histolojik analiz, in vivo, bir bir metalik implantlar izleme host reaksiyonu için bu nedenle, uzun ve hantal bir süreçtirCGA, farklı kan proteinleri izleme esas lternative yöntem de tarif edilmektedir. Bu yöntemler arasında in vitro ısmarlama göç ve kolonizasyonu testlerinde geliştirmek için kullanılabilir ve aynı zamanda histolojik olmadan, in vivo olarak işlevselleştirilmiş metalik implantlar analizi için kullanılabilir.
Introduction
Şu anda mevcut metalik implantlar yük taşıyan uygulamalar için uygundur, ancak olmayan nitelik kaybı onları 1 çevreleyen doku ile güçlü bir arayüz sağlamak tasarımları gerektirir. In vivo ve kolonizasyon büyüme hücresel kolaylaştırmak yapılar sağlayarak, metal implantların ömrü 2 uzatılabilir. Açıkça gözenekli metalik implantlar ve aynı zamanda implantların iyi kolonizasyonu sağlamak için doku arayüzü mühendislik malzemeleri umut vericidir. Bunlar aktif ortopedik implantlar gibi ve aynı zamanda trakeal implantlar 3-5 olarak kullanılmıştır. Ancak, gözenek alanlarda hücre hareketi üzerinde kesin kontrol olarak çözülmesi gereken sorunlar hala var. Bu süreci kontrol etmek için başarısızlık bir ucunu ve diğer restenoz içinde eksik kolonizasyon yol açabilir. Ayrıca bu implantlar başka bir işlevselleştirilmesini Bu büyüme faktörlerinin teslim gibi yüksek fonksiyonları gerçekleştirmek için gerekli olan,yönettiği vaskülarizasyon ve farklı hücre tipleri 6-8 aynı anda hareket. Bir damarlı dokusu ile implantın kolonizasyonu arzu edilir olarak trakeal implantlar için, bu çok önemlidir. Bu implant açıklığı azalır Ancak, trakea lümenine-büyüme kontrolsüz doku istenmeyen bir durumdur.
Hücre hareketi kontrol etmek için bir olasılık boyutu dışlanmasıdır. Hedef hücreler ve belirli bir sentetik polimer ile etkileşim yeteneğini büyüklüğü bilerek etkili bir hücre hareketi derinliğini belirlemek gözenek gradyanları geliştirmek mümkündür. Bağ dokusu extraluminally gibi fibroblast gibi hücreler, ancak lümen bir boru implantın kolonizasyonu üzerinde etkili bir kontrol onların hareket etmesini önlemek için (az 10 mikron) kadar küçük girişi için elde edilebilir yeterince büyük bir gözenek mimari oluşturarak örneğin.
Bu donma-dryi olarak mevcuttur gözenek oluşturma yöntemlering, partikül liç, 9,10 köpük gaz, gerekli ekipmanların az miktarda gözenek geçişlerini hızlı oluşumu için yöntem uyum için en kolay dondurma-çıkarma 11'dir. Bu yöntemde, bir polimer çözeltisi bir organik çözücü ve su karışımı içinde bir ikili dondurulur. Daha sonra, çözücü, etanol gibi bir karışabilir önceden soğutulmuş bir sıvı ile ekstraksiyon yoluyla değiştirilir. Dondurma ve ekstraksiyon koşulları gözeneklerin şekil ve boyutunu belirlemek ve ekstraksiyon ekstraksiyon çözeltisi hareketini kontrol edilebilir bir şekilde yapılır, gözenek boyutu ve şekli yönlü olarak modüle edilebilir.
Çok hücreli dokular için ikinci adım, etkileşimi kontrol etmek için farklı hücre tipleri arasında gözenekli engellerin oluşumudur. Bu aynı zamanda onların ihtiyaçlarını 12,13 bağlı olarak farklı hücre tipleri için farklı mikroçevrelerde durumu için gereklidir. Trakea bronş ile gırtlak bağlayan bir boru şeklinde bir organdıri. Bu mukus üretmesine interdispersed goblet hücreleri ile bir iç yalancı siliyer epitel hayır vardır. Trakea 3D yapısı ve istikrar C-halkalar şeklinde kıkırdak tarafından yapılmaktadır. Böylece, bir yapay trakea bağ dokusu ve siliyer epitel tabakası arasında tanımlanan bir birleşme olmalıdır. Bir 3D yapı bağ dokusu parçası için gerekli olsa da, epitel hücrelerin göç bir bazal membran benzeri gerektiren yüzeye, yaranın yönlü hareketi ve kapatma elde etmek. Polielektrolit çok katmanlı filmler (PEMS) bazal membran taklit elde etmek için olası bir seçenek. Katman-by-katman yöntemi (LBL) ince ve işlevsel yüzey kaplamaları elde etmek için çok yönlü bir süreçtir. Bu, özelliklerini bu polielektrolit türü, pH olarak sadece değişen değişkenler tarafından değiştirilebilir nano yüzey kaplama elde etmek için sıralı bir şekilde iki zıt yüklü polielektrolitler ve inşa-up elektrostatik etkileşimleri dayanmaktadırkatman sayısı, bir kapatma tabakasının yanı sıra, LBL yöntemin en önemli avantajlarından çapraz vb Bir temel yüzey topografya uyması için yeteneğidir. Böylece, kontrollü şartlar altında bu yöntem aynı zamanda gözenekli yapıların yüzey kaplaması elde etmek için de kullanılabilir. Kollajen polielektrolitlerin olarak kullanılırsa, bazal membran yüzeyinde taklit edebilir nanofibrillar yapılar elde etmek mümkündür. Titanyum hidrofobik tür yapıların gelişimi sağlar ve fibrillarity kalın kaplama 14 muhafaza edilebilir. Bu şekilde yüzey üzerinde hücre bağlanma hareketi ve aynı zamanda kontrol edilebilir. Ardışık dondurularak ekstraksiyon ve Lbl film kaplama kullanılarak, hücre hareketi ve uzunlamasına çevresel olarak, yanal olarak kontrol edilebilir bir yapı 15 elde edilebilir.
Burada olabilir onların hidrofobik davranış kullanarak titanyum implantlar için iki yeni modifikasyon yöntemleri tarifhidrofobik, sentetik polimerler ii) hücre büyümesi ve polielektrolit çok katmanlı tarafından astar oluşumunu destekler implant yüzeyinde kalın bir polimerik film tabakası oluşumu ile gözenekli titanyum implantlar içinde micropores geçişlerini i) oluşumu: Çeşitli gözenekli implantlar değişiklik uzatıldı. Bu yöntemler, sırayla veya ayrı ayrı kullanılabilir. Bunlar kontrollü göç ve çok hücreli doku 16,17 farklı hücre tiplerinin mekansal organizasyon sağlamak yapıları sağlamak. Trakea özel durum için, implant için istenen sonucu restenoz ve polielektrolit çok katmanlı üzerinde siliyalı epitel hücrelerinin iç astar oluşumu olmadan mikrogözenek geçişlerini içinde fibrovasküler doku ile kolonizasyon olacaktır.
Implantların entegrasyonu kontrol bir yolu yerinde ev sahibi ile entegrasyon döneminde küçük cerrahi müdahaleler yapmaktır. Güçlü t olmak içinmüdahalelerin zamanlaması karar o, bu implant sistemik etkileri hakkında bilgi sahibi olmak önemlidir. C-reaktif protein (CRP) enfeksiyonun izlenmesi ve klinik ortamlarda inflamatuar yanıt için kullanılmıştır. Kromogranin A (CGA) de benzer bir şekilde kullanılabilir ve inflamasyon 18 seviyesini gözlemek için daha kesin sonuçlar sağlayabilir. In vivo metalik implant entegrasyon gözlemleyerek bir şekilde olarak, Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi (HPLC) ve sonraki protein sıralama ile hayvan kan örneklerinin karakterizasyonu ile implant sistemik etkileri sürekli bir izleme prosedürü mevcut. Bu yöntemin hazırlanması normal son nokta histolojik analiz kaçınmak için kullanılabilir. Metalik implantlar histolojik kesme uzun, hantal ve pahalı bir süreçtir ve sadece belirli zaman noktalarında yapılabilir. Bu nedenle, implant sağlığı hakkında sağlam bilgi veren kan testi olacaktır iyi tasarlanmışhayvan deneyleri ile ilgili son AB kuralları tarafından zorunlu olarak hayvan deneyleri azaltmak için olası yolları olabilir.
Burada yer alan yöntem ile fonksiyonlandırma metalik implantlar performansını artırmak için ya da var olan implantlar izlenmesi için alternatif bir yol için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Makrogözenekli Metalik İmplantlar içinde Micropore Degradeler hazırlanması
- Etanol ile implantlar (örneğin, 400-500 um, Neyco SAS, Fransa bir boyut aralığı ile tıp titanyum boncuklardan oluşan implantlar gibi), temiz ve daha sonra 15 dakika boyunca aseton içinde sonikasyon.
- Implant büyüklüğü ve şekli (standart deneyler için, 2 cm'lik bir yüksekliğe sahip 1.5 cm çapında silindirik bir kalıp kullanılır) göre tasarım ve üretim teflon. Kalıplar belirli parçaları çıkarma sırasında kaldırılabilir, böylece modüler olmalıdır. Böyle bir kalıp tasarımı yönlendirilmiş bir şekilde çıkarma sıvının hareketi zorlayarak ekstraksiyon süreci üzerinde kontrol sağlar.
- I) implantın büyüklüğü, ii belirlemek için bir alt kısmı) bir mandrel ve çıkarılabilir iii) bir dış çekirdek: trakea değiştirmek için tasarlanmış boru implantlar için, yapının üç parçadan oluşmalıdır. Bu şekilde, gözenek boyutu gradyan içine doğru dışarıdan oluşturulabilir. <li> sentetik polimer (PLLA) çözeltisi hazırlayın: donma / çıkarma PLLA çözeltisi dioksan ve su (v% 87:13, v) ikili bir karışımı hazırlanmış alınması gerekmektedir.
- Homojen bir çözelti elde etmek amacıyla ° C ile 60 karışım ısıtın. 60 ° bu implant içine çözüm getirilmesi için kullanılacak olan hassas cam şırınga için ısı direnci daha yüksek limit C olarak seçilmiştir.
- Yüksek bir konsantrasyon (≥% 6), yüksek molekül ağırlıklı PLLA çözümler kullanıldığında, derhal ısıtıldıktan sonra, implant içine çözüm getirmektedir. Aksi takdirde, çözelti jelleştirme tam daldırma olmadan meydana gelir.
- Implant gözenekli ile ilgili olarak gerekli olan polimer çözeltisi hacmi hesaplamak, dondurulmuş çözeltinin hacmi doğruluğu değişim için dikkate alınabilir.
- 0.1 ul hassasiyetle hassas cam şırınga ile implantların içine çözüm tanıtmak. Polimer konsantrasyonu için alt sınırTekrarlanabilir gözenek degrade oluşumu için% 3 bu% 6 üzerinde kalın örneklerde homojen dağılımı elde etmek zor olur ise. Bununla birlikte, özel uygulamalar için diğer konsantrasyonlarda kullanılabilir.
- Örnekler doğrudan -80 ° C'de ya da oda sıcaklığında 30 dakika bir ön kuluçka süresi ya da dondurulur. Donma şartlar kısmen gözenek oluşumunu belirlemek için, böylece donma koşulları amaçlanmaktadır gözenekliliğine göre ayarlanabilir. -80 Numuneler gece boyunca tutmak ° C
- Ekstraksiyon: Önceden soğutulmuş EtOH% 80 implantlar bırakın. Gece -20 ° C'de çıkarma yapın. Gözenek gradyanları elde etmek için, disk şeklinde bir implant için alt kısmı hariç boru şekilli implant ve tüm parçalar için mandrel hariç tüm kalıp parçaları kaldırın. Kalıbın daha kolay ayrılması için önceden soğutulmuş bir neşter kullanarak.
- Ekstraksiyon sonra, -20 ° C de bir gece 19, kalan kalıp parçaları kaldırmak ve hava implantlar kurutun. Karakterizasyonu içinyapı cıva gözeneklilik ölçerine göre analizin tüm gözenek gereklidir. Merkür Porozimetre ölçümleri implant ve küçük interdispersed gözeneklerin her iki tarafında gözenekleri karşılık farklı zirveleri gösterdi. Ancak daha önemli veri bir taramalı elektron mikroskobu (SEM) 20 ile gözenek boyutu dağılımı için Resim J ile analiz edilebilir içi ve dışı yüzeyleri, gözenekler arasındaki farktır. Gözenek gradyan doğrulanması için, numuneler, dondurma-kırılma ve SEM ile kesit görüyoruz.
- Kullanılan implantlar açık gözenekli doğası, ve titanyum ışık yansıtan kapasitesi nedeniyle, bu gözenekli implantlar içinde işaretli hücrelerin z yığınları yapmak mümkündür. PKH26 veya Calcein-AM ile hücreleri Etiket ve konfokal lazer mikroskobu ile implantlar görselleştirmek.
2. Kollajen / Aljinatta çok Katmanlı ile gözenekli Metalik İmplant Yüzey Kaplama
- Oluşumu içinçok katmanlı bir, yüksek tekrarlanabilirlik daldırma robotlar ile elde edilir. Bir daldırma robot mevcut değilse Ancak, bu adımları elle de yapılabilir.
- Medikal kollajen tip I ve sodyum aljinat kullanın. Optimize konsantrasyonları pH 3.8 'de sitrat tampon içinde NaCI 150 mM her biri için 0.5 g / L'dir.
- Çözeltinin homojenliği sağlamak için gece boyunca kolajen çözeltisi içinde çözülür. 3.8 asidik pH gerekli olan yapı nötr pH içinde çapraz bağlanma öncesi kararsız olduğu gibi, tabakaların stabil birikme için.
- Alternatif kollajen ve aljinat çözümler implantlar daldırarak bir daldırma robot sistemi ile katmanları Depozito. Depozisyon süresi her bir takip eden katman boyunca 15 dk. 5 dakika boyunca pH 3.8 'de 150 mM NaCI ile birikimi adımlar arasında yapısı durulayın.
- Polielektrolit çok katmanlı üretiminde kullanılan daldırma robotlar ile implantların kullanımı için tasarım özel tutucu. Ya da titanyumun yüzeyi üzerinde sadece impla tabakalarının biriktirilmesimodifiye NTS veya implantlar, bölüm 1'de açıklandığı.
- Bazal membran stabilizasyon genipin ile taklit: v oranı: 01:04 v de dimetilsülfoksit (DMSO) / sitrat tampon maddesi (150 mM NaCI, pH 3.8) 'de çapraz bağlama çözeltisi hazırlayın. Konsantrasyonları geniş bir yelpazede kullanılan ve 100 mM çapraz bağlanması için yeterli olabilir. DMSO bileşeninde ilk genipin ve topaklanma önlemek için daha sonra su bileşeni ekleyin çözülür.
- 12-24 saat arasındaki çapraz bağlama çözeltisi içinde daldırma örnekleri çapraz bağ. Daha sonra sitrat tamponu bol miktarda (pH 3.8) ile durulayın.
- Yıkama adım sonra, UV tedavi (30 dk) veya antibiyotik / antifungal banyo (Penisilin / Streptomisin, Fungizone) ile ya da örnekleri sterilize edin.
- Taklit bazal membran kalitesini belirleyen en önemli parametre, kalınlığı ve liflerin çapı vardır. Temas modunda elde Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) görüntüleri kullanılarak lif çapları hesaplayın. A ile numuneleri kuruGörüntüleme önce azot akışı. Resim J yazılımı ile ortalama fibril kalınlığı belirlemek için görüntü başına en az 10 tellerinin kalınlığı ölçmek.
- Film kalınlığı AFM kullanarak sıfırdan testleri ile belirlenebilir. Kuru (COL / ALG) 24 / COL çok katmanlı filmler. Filmin sıfırdan bir şırınga iğne kullanın. Bir ışık mikroskobu ile sıfırdan lokalizasyonu sonra, sıfırdan sınırında 10 x 10 mm 2 yüzeylerde AFM ile görüntüler elde. Film tabaka kalınlığını içerir AFM yazılımı ile elde edilen profiller yükseklikleri hesaplayın.
3. Kan Plazma analizi ile in vivo İmplant Entegrasyon dolaylı İzleme
- Gerekli tüm komite onayları her ülkenin 21 yönetim kurallarına göre hayvan deneyleri için alınmalıdır. Bizim durumumuzda Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım (Ulusal Araştırma Konseyi, 2010) için Kılavuzu takip ve inci edilirStrazburg etik komite Üniversitesi E onayı gerekir.
- Hedef yerinde implantasyon gerçekleştirin. Burada verilen kan izleme protokolü, 15 mm trakeal rezeksiyon Yeni Zelanda tavşanlarında trakeal değiştirilmesi için kullanılmıştır.
- Implantasyon ardından takip günlük gibi ve ağırlık kaydı genel hayvanların refahı (cerrahi siteleri, nefes alma oranı yaklaşık iyileşme) izleyerek hangi kampanyaların olarak gereklidir.
- Kan testi doğrulamak için, kan CRP düzeyleri için ELISA testleri gibi köklü bir yöntemini kullanın. Birçok hayvan için CRP testleri mevcuttur ve tavşan için kullanılan özel test Tablo 1'de listelenmiştir. Benzer şekilde, Batı CGA düzeylerinin belirlenmesi için kurutma kullanın. Monoklonal anti-CGA antikorlarının (anti-CGA 47-68), bu protokolü kullanılmıştır.
- Plazma karakterizasyonu için, tavşan kulak damarlar kan örnekleri elde. 4 az 20 dakika 5000 rpm'de santrifüj °; C. Analizi için elde edilen üstte kalan kullanın. Bizim prosedürde, bu testler haftalık olarak yapılan, ancak daha sık testleri de mümkündür vardır.
- Plazma protein içeriğinin faz HPLC ile arıtma Ters: trifloroasetik asit içinde% 0.1 (1:1; v: v) ile tavşan plazma çıkarın. Bir Dionex HPLC sistemi (Ultimate 3000, Sunnyvale, CA USA) kullanarak özü arındırın 300-5C18-sütun ters fazlı bir Nucleosil üzerinde (4 x 250 mm; partikül büyüklüğü 5 mikron, gözenek, 300 Å).
- 214 ve 280 nm'de absorbans kaydedin. Kullanılan çözücü sistemi) i Çözücü A: su ve II içinde% 0.1 (v / v) trifluoroasetik asit (TFA) ile) Çözücü B:% 0.09 (v / v)% 70 TFA (v / v) asetonitril-su.
- 700 ul / elutions için gradyanları kullanılarak dk 'lık bir akış hızı kullanın. Tepe kesirleri toplayın. Hızlı vakum uygulaması ile buharlaştırma ile fraksiyonlar konsantre ediniz. Bu tam kuruyana önce hızlı vakum durdurmak için önemlidir.
- Eş farklı zaman noktalarında elde edilen tepe correlateimplantasyon dönemi Urse. Otomatik Edman dizilemesi ile belirlenmesi için implantasyon sırasında tutarlı eğilimler gösteren, saflaştırılmış peptid kullanın.
- Peptidlerin otomatik Edman dizilemesi: bir mikro-Procise kullanarak otomatik Edman indirgeyicisiyle ile arıtılmış, peptidlerin N-terminal sekansı belirlenir. Polybrene ile tedavi edilen cam elyaf filtreler için örnek yükleyin. Bir sonraki adım, bir C 18 kolonu (PTH, C-18, 2.1 x 200 mm) üzerinde kromatografi ile 22 Phenylthiohydantoin-amino asitleri (PTH-Xaa) tanımlanmasıdır. Dizisi elde edildikten sonra, bu Prot veritabanı kullanılarak Blast yazılımı tarafından tespit edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gözenek geçişlerini oluşumu
PLLA solüsyonun konsantrasyonu değiştirerek, implantların ağızlı bir tarafında gözeneklerin boyutunu kontrol etmek mümkündür. Gözenek boyutu ve şekli önemli ölçüde titanyum implantlar (Şekil 1a ve 1b) varlığı ile etkilenmiştir. 40-100 mikron ve daha düşük konsantrasyonların kullanılması küçük gözeneklere neden gelen gözenek boyutları arasında değişmektedir. Intraluminal yan gözenek boyutu kısıtlı çıkarma tarafından yönetilen ve fibroblast ortalama boyutundan daha az yaklaşık 9 mikron 23, oldu, oysa. Daha büyük gözeneklerinin duvarları kendi porozitesi elde edilebilir olması ve oda sıcaklığında bir inkübasyon adımı, bir çift gözenekli yapısı, ekleyerek. Bu gaz ve besin hareketi (Şekil 1c) kolaylaştıracaktır, bu özellik, kalın implantlar için önemlidir.
Nanofibrillar bazal membran-taklit oluşumu
(Şekil 2) Kolajen / aljinat film tabakası eklemek mümkündür. Bu film tabaka PLLA köpük üzerine kararlı olan ve aynı zamanda bir köpük (Şekiller 3a ve 3b) yokluğunda yüzey üzerinde muhafaza edilebilir. Film tabakasının (Şekil 3C) büyüdükçe nano ölçekli kolajen lifleri oluşturmak. Filmin büyümesi, bu birkaç yüz nanometrelik kalın bir film (Şekil 3d) elde edilebilir, üstel.
HPLC ve implantasyon sonrası sonraki sıralama ile kan plazma analizi
Gözenekli titanyum implantlar konak doku ile entegre ve tamamen in vivo 4-6 hafta (Şekil 4) arasında doldurulur. Bununla birlikte, bu sürecin devamını restenoza yol açabilir ve PLLA yapısı nedeniyle gözenek gradyan varlığında, herhangi bir fibroblast varlığı gözlenmediimplantasyon 20 fter 6 hafta. Bu dönemde HPLC analizi implantasyonu sırasında dalgalanma ayrı tepe gösterdi. Ilgi tepe fraksiyonları sıralı ve CRP okuma ile benzer bir eğilim göstermişti alfa ve beta hemoglobin ½ zincirleri (Şekil 5), olduğuna karar verilmiştir.
Şekil 1. Gözenek oluşumu gradyan yöntemi. Dondurularak ekstraksiyon yöntemi ile gözenekli PLLA köpüklerin hazırlanması. Makro gözenekli titanyum implantlar (iç) ile gözenekli titanyum implantlar (dış) (C) ile gözenekli titanyum implantlar (dış) (B) olmadan SEM (A). Implantlar varlığı gözenek morfolojisi değiştirdi. (C, D) aynı işlemi İçi olabilir boru implantlar gözenek geçişlerini elde etmek için boru yapılara ied. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Çok fonksiyonlu implant kalkınma planı. Gözenek boyutu degrade elde edilebilir bir sentetik polimer esaslı köpük eklenerek, microbead tabanlı gözenekli implantlar itibaren. Gözenek gradyan Şekil kısmen kalıp yapısı tarafından kontrol edilir. Bu yapı üstünde bir temel zar benzeri bir yapı hücre bağlanma ve 2 boyutlu olarak kaplama oluşumu için uygun bir yüzey hangi ilave edilebilir.
pload/50533/50533fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50533/50533fig3.jpg "/>
Şekil 3,. Bir bazal membran taklit eden olarak titanyum implantlar üzerinde Nanofibrillar katmanlı oluşumu. Kalın kollajen / aljinat çok tabakalı (A) Titanyum sadece implant (400-500 mikron arasında bir ortalama tanecik boyutları ile birlikte) (B), titanyum / PLLA köpük melez yüzeyi üzerinde özel olarak oluşturulabilir. (D) kalınlığı: Bu yüzey (~ 1 mikron kalınlığında) endotel hücrelerinin eki ve çoğalması için bir substrat (C) çok katmanlı bir nanofibrillar doğası AFM analizi (30 mikron x 30 mikron Tarama alanı) ile karakterizedir sağlar çok katmanlı sıfırdan testi ile belirlenir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
jpg "/>
Şekil 4. Tavşanlarda in-vivo gözenekli titanyum protezler entegrasyonu. Eksplante implant kesitlerin Haemotoxylin ve eozin boyama (A), gözenekli alanları tamamen (B) gözenekleri olan doku vaskülarizasyonu iyi bir düzeyde olan olgun bir bağ dokusu olup, in vivo olarak 4-6 haftalık bir süre içinde doldurulabilir .
Şekil 5,. HPLC ve sonraki sıralama ile bir implantasyon boyunca plazma protein içeriğinin izlenmesi. Temsilcisi HPLC eğrileri sırasıyla implantasyon 3, 4 ve 6 hafta (sol üst, sağ üst, alt ayrıldıktan sonra hayvanların kan örneklerinden elde edilen tepe göstermek .) Her bir zirve, belirli bir proteine karşılık gelir. Farklılıklarzirve sıralama (örneğin, α ve ß-hemoglobin ½ zincirleri gibi) tespit edilebilir belirli bir protein, göreceli bolluk karşılık gelmektedir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gözenek gradyanları arayüzü doku mühendisliği önemli bir araç olup, burada tarif edilen sistemin, hücre göçü incelemek için gözenek gradyanını meydana getirmek için tek başına ya da metalik implantlar ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Sistem, organik çözücüler işlemek için kimyasal bir davlumbaz dışında herhangi bir ek ayar veya ilave ekipman gerektirir etmez, bu nedenle biyoloji laboratuvarlarında uygulanabilir. Poli (glikolik asit) (PGA), poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) ve poli (kaprolakton) (PCL) benzer olarak, polimerler hafif değişiklikler ile birlikte kullanılabilir. Organik çözücü içinde çözülür olmaz diğer makro gözenekli yapılar da kullanılabilir. Bir yüzey üzerinde küçük gözenek boyutları (nano at) elde etmek için, ek ince nano film tabakası oluşumu da mümkündür. Bu, ilk olarak, bir çok uçucu bir çözücü içinde, yapının üstüne polimer içindeki seyreltik bir çözeltisi (% 1) koyarak (kloroform gibi) ve hemen ardından p daldırarak faz ayrılmasına neden olarak, elde edilebilirure etanol çözeltisi. Bu şekilde sadece tek bir malzemeden göre bir ortak-kültür sisteminde elde edilebilir.
Ekstraksiyon sıvının hareketi bu belirlenir olarak teflon kalıp tasarımı gözenek büyüklüğünü kontrol için çok önemlidir. Özütleme sıvısı ile özütleme sıvısı ve çözücü gözeneklerin oluşmasına neden etkiler arasında bir değişim oranının hareketi. Kontrol daha implant yoluyla özütleme sıvısı laminar akış uygulaması ile geliştirilebilir. Ekstraksiyon sıvının miktarı önemli bir parametredir ve kullanılan polimer miktarına göre ve aynı zamanda implant büyüklüğü ile ilgili olarak düzenlenmelidir. Silindirik 2mm kalınlığında implantlar ve 500 mikron medikal titanyum boncuk oluşan, 11 mm çapında, 200 ml 'lik bir çekme banyosu gereklidir. Calcein-AM hücre morfolojisi daha iyi bir gözlem sağlar ise hücre göçü eğitim için, PKH26 uzun süreli göç çalışmaları için daha iyi bir seçenektir. SıfatıylaZ-yönü içinde hücre hareketi ntification hücresel hareketi üzerindeki kontrol in vitro ölçümde bir dolaylıdır. Ayrıca, bu sistem, ya doğrudan tohum ya da jel kapsülleme 24 kullanılarak standart tahliller kullanılarak anjiyojenez, implantların in vitro vaskülarizasyonunda miktarının tayini için endotel hücreleri ile birlikte kullanılabilir.
Bu tür elektro veya faz ayrılması gibi çeşitli uygun Nanolif oluşumu yöntem vardır, ama kolajen elektro genellikle kolajen fibrilleri denatüre etmek için kabul edilir. Hassasiyet düzeyi yüksek gerekli fibriler yapı sunarken, bir polielektrolit bazlı yapı Kullanımına denatürasyon önlenmesini sağlar. Ayrıca LBL yöntemleri karmaşık implant şekiller için uyum daha kolaydır. Gözenekli yapılar üzerinde film tabakaları hücresel bileşenleri arasındaki etkileşimler üzerinde daha fazla kontrol ile transwell benzeri deneyleri geliştirmek için basit yöntemlerdir. Bu confoca ile gözlemlemek mümkündürl mikroskobu implantın üst katmanı. Bu, epitel hücreleri veya endotel hücreleri implant ile temas eden çoklu tabakaya sahip, ilgili birincil hücre etkileşimi gözlemlemek için kullanılabilir. 25 izole edilmiş ya da ticari olarak temin edilebilen ya da hücreler kullanılabilir. Bu film tabaka, bir boru şekilli organ için bir iç astar geliştirilebilir bir yüzey sağlar. Örneğin, bu özel durumda, birinci olarak, soluk borusu için yapay bir membran geliştirmektir ve bu yapının solunum yolu epitel 23 için uygun olduğu gösterilmiştir.
Katman kalınlığı, filmin bir bariyer (24 iki-tabaka) olarak hareket için yeterli kalınlıkta bir seviyede ayarlanır. Her iki titanyum tabaka nispeten düz bir film tabakası hidrofobikliği nedeniyle sadece titanyum ve / PLLA implantları, gözenek yapısı ve yeni oluşan film tabakası arasındaki arayüzün stabilitesine katkıda implantları, üzerinde oluşturulmuş olabilir. Mevcut çapraz bağlama arasında beniMethods, genipin çapraz hayvan deneyleri için en uygundur. Örneğin glutaraldehit gibi diğer çapraz bağlama metotları, EDC / NHS da kullanılabilir, ancak bunlar genel olarak daha az hücre bağlanma ile sonuçlanabilir. Diğer bir olasılık, photocrosslinkable kollajen 26 kullanmaktır.
Bu anlayış daha derinlemesine sağlayabilir gibi protein sıralama, implant izleme için umut verici bir yöntemdir. Elde edilen proteinlerin yapısı göre, implantasyon sistemik etkileri anlaması ve yakından trakeal implantların durumunda olduğu gibi, implant kapalı bir alanda değil olduğu durumlar için özellikle önemlidir olası enfeksiyonlara, izlemek mümkündür . Enfeksiyonların erken saptanması zamanında enfeksiyon ile ilişkili komplikasyonların önlenmesi yol açabilir. HPLC profili elde olabilir ilgi birkaç proteinleri ile birkaç zirveleri gibi CRP veya CGA gibi belirli bir proteinin tek karakterizasyonu göre daha fazla bilgi verebilirBu yöntem ile ed. Örneğin, alfa ve trakeal implantlar ile tavşan için beta hemoglobin ½ zincirleri bizim tam trakea yedek modelinde CRP okuma ile benzer eğilimler göstermiştir. Bu çok yönlülük açıklanan tekniklerin geliştirilmesi ile büyük bir hassasiyetle dakika sistemik etkisinin belirlenmesi için bir mekan sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
NE Vrana Protip SAS bir çalışanıdır.
Acknowledgments
Yazarlar hayvan deneyleri ile yaptığı yardım için birikmesi teflon kalıp ve Dr G. Prevost için üretim titanyum implantlar Dr Andre Walder ve Nicolas Perrin, K. Benmlih teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca mali katkı için Bölge Alsace ve PMNA (Pole Materiaux et Nanobilimler d'Alsace) kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss | ||
Table 1. List of Materials and Reagents. |
|||
References
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).
- Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications. Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).
- Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).
- Janssen, L. M., et al. Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).
- Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28, 2810-2820 (2007).
- Schultz, P., et al. Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis. Biomaterials. 26, 2621-2630 (2005).
- Müller, S., et al. VEGF-Functionalized Polyelectrolyte Multilayers as Proangiogenic Prosthetic Coatings. Advanced Functional Materials. 18, 1767-1775 (2008).
- Mills, R. J., Frith, J. E., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J. Effect of Geometric Challenges on Cell Migration. Tissue Engineering Part C-Methods. 17, 999-1010 (2011).
- O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26, 433-441 (2005).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26, 5474-5491 (2005).
- Budyanto, L., Goh, Y. Q., Ooi, C. P. Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid - liquid phase separation and freeze extraction. J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Chaubaroux, C., et al. Collagen-Based Fibrillar Multilayer Films Cross-Linked by a Natural Agent. Biomacromolecules. 13, 2128-2135 (2012).
- Huang, Y., Siewe, M., Madihally, S. V. Effect of spatial architecture on cellular colonization. Biotechnology and Bioengineering. 93, 64-75 (2006).
- Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Unger, R. E. Co-culture systems for vascularization - Learning from nature. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, 291-299 (2011).
- Lavalle, P., et al. Dynamic Aspects of Films Prepared by a Sequential Deposition of Species: Perspectives for Smart and Responsive Materials. Advanced Materials. 23, 1191-1221 (2011).
- Zhang, D., et al. Serum concentration of chromogranin A at admission: An early biomarker of severity in critically ill patients. Annals of Medicine. 41, 38-44 (2009).
- Goh, Y., Ooi, C. Fabrication and characterization of porous poly(l -lactide) scaffolds using solid - liquid phase separation. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2445-2452 (2008).
- Vrana, N. E., et al. Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions. Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).
- Dupret-Bories, A., et al. Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep. J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).
- Gasnier, C. Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules. Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).
- Vrana, N. E. Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement. PLoS ONE. 6, e20480 (2011).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032 (2012).
- Dong, C. -M., et al. Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen. Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).
