Summary
In questo video, dimostreremo tecniche di modificazione per porosi impianti metallici per migliorare la loro funzionalità e per controllare la migrazione delle cellule. Le tecniche includono lo sviluppo di gradienti pori per controllare il movimento delle cellule in 3D e produzione di membrana basale imita per controllare il movimento delle cellule in 2-D. Inoltre un metodo HPLC-based per il monitoraggio integrazione dell'impianto in vivo mediante analisi delle proteine del sangue è descritto.
Abstract
Impianti metallici, in particolare impianti di titanio, sono ampiamente utilizzati in applicazioni cliniche. Tessuto in crescita e l'integrazione di questi impianti nei tessuti sono parametri importanti per i risultati clinici di successo. Al fine di migliorare l'integrazione del tessuto, sono state sviluppate impianti metallici porosi. Porosità aperta di schiume metalliche è molto vantaggiosa, in quanto le aree del poro possono essere funzionalizzata senza compromettere le proprietà meccaniche di tutta la struttura. Qui si descrivono le modifiche che utilizzano impianti in titanio poroso a base di microsfere in titanio. Utilizzando le proprietà fisiche intrinseche quali idrofobicità di titanio, è possibile avere gradienti pori idrofobi entro microperla impianti metallici based e allo stesso tempo di avere una membrana basale mimo basa su idrofili, polimeri naturali. Gradienti poro 3D sono formate da polimeri sintetici come acido poli-L-lattico (PLLA) mediante metodo freeze-estrazione. 2D nanofibrillar surfacce sono formati utilizzando collagene / alginato seguita da una fase di reticolazione con un reticolante naturale (genipin). Questo film nanofibrillar è stato costruito da strati con il metodo di deposizione delle due molecole di carica opposta, collagene e alginato strato (LBL). Infine, un impianto dove diverse aree possono ospitare diversi tipi di cellule, in quanto ciò sia necessario per molti tessuti multicellulari, può essere ottenuto. Da, in questo modo il movimento cellulare in direzioni diverse da diversi tipi di cellule può essere controllato. Tale sistema è descritto per il caso specifico di trachea rigenerazione, ma può essere modificata per altri organi bersaglio. Analisi della migrazione cellulare e le possibili metodi per la creazione di diversi gradienti pori vengono elaborati. Il passo successivo nella analisi di tali impianti è la loro caratterizzazione dopo l'impianto. Tuttavia, l'analisi istologica di impianti metallici è un processo lungo e ingombrante, quindi per il monitoraggio reazione host per impianti metallici in vivo di unlternative metodo basato sul monitoraggio proteine del sangue CGA e diverso è anche descritto. Questi metodi possono essere utilizzati per lo sviluppo in vitro la migrazione su misura e test di colonizzazione e di essere utilizzato anche per l'analisi di funzionalizzati impianti metallici in vivo senza istologia.
Introduction
Attualmente sono disponibili impianti metallici sono adatti per applicazioni portanti, ma la loro non degradabilità richiede disegni che garantiscono una forte interfaccia con il tessuto circostante li 1. Prevedendo strutture che facilitano la crescita cellulare in-e la colonizzazione in vivo, la vita di impianti metallici può essere prolungato 2. Apertamente porosi impianti metallici sono materiali per l'ingegneria dei tessuti interfaccia promettenti e anche per garantire una buona colonizzazione degli impianti. Essi sono stati utilizzati attivamente, come impianti ortopedici e anche come protesi tracheali 3-5. Tuttavia, vi sono ancora problemi che devono essere risolti come il controllo preciso movimento delle cellule nelle zone dei pori. Incapacità di controllare questo processo potrebbe portare alla colonizzazione incompleta in una estremità e restenosi nell'altra. Inoltre un'ulteriore funzionalizzazione di questi impianti è necessario per raggiungere funzioni superiori come, consegna di fattori di crescita,vascolarizzazione diretto e movimento simultaneo di diversi tipi di cellule 6-8. Per impianti tracheali, questo è cruciale come la colonizzazione dell'impianto da un tessuto vascolarizzato è auspicabile. Tuttavia, il tessuto incontrollata crescita interna al lume della trachea è indesiderabile perché diminuisce implantare pervietà.
Una possibilità di controllare il movimento delle cellule è la dimensione di esclusione. Conoscendo la dimensione delle cellule bersaglio e la loro capacità di interagire con un dato polimero sintetico è possibile sviluppare gradienti di pori che possono determinare efficacemente la profondità di movimento cellulare. Ad esempio creando un'architettura poro che è abbastanza grande per l'ingresso di cellule del tessuto connettivo, quali fibroblasti extraluminally, ma abbastanza piccoli (meno di 10 micron) per impedire il loro movimento intraluminale un efficace controllo colonizzazione di una protesi tubolare può essere raggiunto.
Dal metodi di creazione dei pori disponibili come freeze-essiccazione ding, la lisciviazione di particelle, gas schiumogeno 9,10, il più facile da adattare il metodo per la rapida formazione di gradienti pori con quantità minima di attrezzature necessarie è freeze-estrazione 11. In questo metodo, una soluzione polimerica è congelato in una miscela binaria di un solvente organico ed acqua. Successivamente, il solvente viene scambiato tramite estrazione con un liquido miscibile pre-raffreddata come etanolo. Congelamento e condizioni di estrazione determinano la forma e la dimensione dei pori e se l'estrazione avviene in un modo in cui può essere controllato il movimento della soluzione di estrazione, forma e dimensione dei pori può essere modulata direzionalmente.
Secondo passo per tessuti multicellulari è la formazione di barriere porose tra diversi tipi cellulari per controllare il loro interazione. Ciò è necessario anche per la disponibilità di diversi microambienti per diversi tipi di cellule a seconda delle loro esigenze 12,13. Trachea è un organo tubolare che collega laringe con BRONCHi. Ha un rivestimento interno pseudostratificato epitelio ciliare con interdispersed cellule caliciformi che producono muco. La struttura 3D della trachea e la stabilità è mantenuta da cartilagine a forma di C-ring. Così, in una trachea artificiale ci dovrebbe essere una giunzione definita tra il tessuto connettivo e lo strato epiteliale ciliare. Mentre una struttura 3D è necessario del tessuto connettivo, la migrazione delle cellule epiteliali richiede una membrana-come seminterrato superficie per ottenere movimento direzionale e la chiusura della ferita. Polielettrolita film multistrato (PEM) sono una possibile opzione per ottenere seminterrato imita membrana. Metodo layer-by-layer (LBL) è un processo versatile per ottenere rivestimenti superficiali sottili e funzionale. Essa si basa su interazioni elettrostatiche di due polielettroliti di carica opposta e il loro accumulo nei maniera sequenziale per ottenere rivestimenti di superficie su scala nanometrica le cui proprietà può essere variato cambiando semplicemente variabili come specie polielettrolita, pH,numero strati, aggiunta di uno strato di tappatura, reticolazione ecc Uno dei principali vantaggi del metodo LBL è la sua capacità di conformarsi alla topografia del substrato sottostante. Così, in condizioni controllate questo metodo può essere utilizzato anche per ottenere la copertura superficiale di strutture porose. Se collagene viene utilizzato come uno dei polielettroliti è possibile ottenere strutture nanofibrillar che possono mimare la superficie della membrana basale. L'idrofobicità del titanio consente lo sviluppo di tali strutture e fibrillarity può essere conservato in strati spessi 14. Questo modo attaccamento e movimento di cellula sulla superficie può anche essere controllato. Utilizzando freeze-estrazione e pellicole di rivestimento Lbl sequenzialmente, una struttura in cui il movimento delle cellule può essere controllato lateralmente e longitudinalmente circonferenzialmente può essere ottenuto 15.
Qui si descrive due metodi di modifica per i nuovi impianti in titanio, utilizzando il loro comportamento idrofobico che può essereesteso a modifica di vari impianti porosi: i) formazione di gradienti di micropori entro i macroporosi con impianti di titanio idrofobe, polimeri sintetici ii) formazione di uno spesso strato di film polimerico sulla superficie dell'impianto che supporta la crescita cellulare e la formazione di rivestimento multistrati polielettrolita. Questi metodi possono essere usati in sequenza o separatamente. Essi forniscono strutture che garantiscono la migrazione controllata e organizzazione spaziale dei diversi tipi di cellule nei tessuti multicellulari 16,17. Per il caso specifico della trachea, il risultato desiderato per l'impianto sarebbe la colonizzazione da tessuto fibrovascolare entro i gradienti micropori senza restenosi e la formazione del rivestimento interno di cellule epiteliali ciliate sui multistrati polielettrolita.
Un modo per controllare l'integrazione della protesi è di fare piccoli interventi chirurgici nel periodo della loro integrazione con l'host in situ. Al fine di essere in grado tØ decidere la tempistica degli interventi, è importante disporre di informazioni sugli effetti sistemici della protesi. Proteina C-reattiva (CRP) è stato utilizzato per il monitoraggio di infezione e risposta infiammatoria in ambito clinico. Cromogranina A (CGA) può anche essere usato in modo simile e potrebbe fornire risultati più accurati per osservare il livello di infiammazione 18. Come un possibile modo di osservare l'integrazione impianto metallico in vivo, vi presentiamo una procedura di monitoraggio continuo di effetti sistemici degli impianti da parte caratterizzazione di campioni di sangue di animali con cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e il successivo sequenziamento di proteine. Elaborazione di questo metodo può essere utilizzato per eludere analisi istologica end-point regolare. Taglio istologica di impianti metallici è un processo lungo, complicato e costoso e può essere effettuata solo in momenti specifici. Per questo motivo, ben progettato analisi del sangue forniscono informazioni circa la salute robusta impianto sarebbeessere possibili vie per diminuire la sperimentazione animale come richiesto dalle recenti norme UE in materia di sperimentazione animale.
I metodi qui presentati possono essere usati per migliorare le prestazioni di impianti metallici mediante funzionalizzazione o di avere un modo alternativo di monitoraggio degli impianti esistenti.
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Protocol
1. Preparazione di gradienti micropori in macroporose impianti metallici
- Pulire gli impianti (ad esempio impianti in grado perle di titanio medico con una gamma di dimensioni di 400-500 micron, Neyco SAS, Francia) con etanolo e poi ultrasuoni in acetone per 15 min.
- Progettazione e produzione stampi in teflon a seconda delle dimensioni dell'impianto e la forma (per esperimenti standard sono utilizzati stampi cilindrici di 1,5 cm di diametro, con una altezza di 2 cm). Stampi devono essere modulari, in modo che le alcune parti possono essere rimossi durante l'estrazione. Tale disegno stampo assicura il controllo sul processo di estrazione forzando il movimento del liquido di estrazione in modo diretto.
- Per impianti tubolare destinato a sostituire trachea, la struttura dovrebbe essere composto da tre parti: i) una parte inferiore per determinare le dimensioni dell'impianto, ii) un mandrino e iii) un nucleo esterno che è rimovibile. In questo modo, il gradiente dimensione dei pori può essere formata dall'esterno verso l'interno. <li> Preparare la soluzione di polimero sintetico (PLLA): Per la soluzione PLLA freeze / estrazione deve essere preparato in una miscela binaria di diossano e acqua (87:13%, v: v).
- Scaldare la miscela a 60 ° C per ottenere una soluzione omogenea. 60 ° C scelto in quanto è il limite superiore della resistenza delle temperature per le siringhe di vetro di precisione che deve essere utilizzato per l'introduzione della soluzione in impianti.
- Se vengono usati ad alta concentrazione (≥ 6%), soluzioni di PLLA ad elevato peso molecolare, introdurre la soluzione nel implantare immediatamente dopo il riscaldamento. Altrimenti gelificazione della soluzione avviene senza immersione completa.
- Calcolare il volume della soluzione di polimero necessaria rispetto alla porosità della protesi, per il cambiamento precisione nel volume della soluzione congelata può essere preso in considerazione.
- Introdurre la soluzione in impianti con le siringhe di vetro di precisione con precisione di 0,1 microlitri. Il limite inferiore per la concentrazione del polimero è3% per la formazione di pendenze riproducibile pori mentre diventa difficile ottenere una distribuzione omogenea nei campioni di spessore superiore al 6%. Tuttavia, per applicazioni specifiche possono essere usate altre concentrazioni.
- Congelare i campioni direttamente a -80 ° C o con un periodo di incubazione, prima di 30 min a temperatura ambiente. Condizioni di gelo determinano in parte la formazione di pori, quindi le condizioni di congelamento possono essere regolate a seconda della porosità mirato. Conservare i campioni durante la notte a -80 ° C.
- Estrazione: Immergere gli impianti nel 80% EtOH pre-raffreddata. Eseguire l'estrazione a -20 ° C per una notte. Per ottenere gradienti di porosità, rimuovere tutte le parti dello stampo, tranne il mandrino per gli impianti tubolari e di tutte le parti tranne la parte inferiore per gli impianti a forma di disco. Utilizzare un bisturi pre-raffreddata per facilitare la separazione dello stampo.
- Dopo l'estrazione a -20 ° C per una notte 19, rimuovere i restanti parti dello stampo e lasciare asciugare gli impianti. Per la caratterizzazione deila porosità complessiva della struttura mercurio analisi porosimetro è necessario. Mercurio misurazioni porosimetro mostravano picchi distinti che corrispondono ai pori sui due lati dell'impianto e le interdispersed pori più piccoli. Tuttavia i dati più importanti è la differenza tra le porosità superfici intraluminale e extraluminale, che possono essere analizzati da J immagine per distribuzione dimensionale dei pori con un microscopio elettronico a scansione (SEM) 20. Per la verifica del gradiente dei pori, congelare-frattura dei campioni e osservare la sezione trasversale con SEM.
- A causa della natura porosa aperta delle protesi utilizzate, e la capacità di riflettere la luce di titanio, è possibile fare z-pile di cellule marcate all'interno dei impianti porosi. Etichettare le cellule con PKH26 o Calcein-AM e visualizzare gli impianti con microscopia laser confocale.
2. Rivestimento superficiale di porosi impianti metallici con collagene / alginato Multilayers
- Per accumulodi multistrati, più alta riproducibilità è ottenuto con i robot immersione. Tuttavia, se un robot immersione non è disponibile, queste fasi possono essere eseguite manualmente.
- Utilizzare il grado di collagene tipo I medici e alginato di sodio. Le concentrazioni sono ottimizzati 0,5 g / L per ogni in 150 mM NaCl in tampone citrato a pH 3.8.
- Sciogliere la soluzione di collagene durante la notte per assicurare l'omogeneità della soluzione. PH acido di 3,8 è necessaria per stabile accumulo degli strati in quanto la struttura è instabile prima della reticolazione a pH neutro.
- Depositare gli strati da un sistema di robot immersione immergendo gli impianti in soluzioni di collagene e alginato in alternativa. Tempo di deposizione è di 15 minuti per ogni strato successivo. Sciacquare la struttura tra fasi di deposizione con 150 mM di NaCl a pH 3,8 per 5 min.
- Titolare specifico Design per l'utilizzo degli impianti con robot immersione utilizzati nella produzione di multistrato di polielettrolita. Depositare gli strati sulla superficie sia titanio solo IMPLAnti o impianti modificati come descritto nella sezione 1.
- Stabilizzazione della membrana basale mimare con genipin: Preparare la soluzione di reticolazione in dimetilsolfossido (DMSO) / tampone citrato (150 mM NaCl, pH 3,8) a 1:4 v: v rapporto. Una vasta gamma di concentrazioni possono essere usate e 100 mM è sufficiente per la reticolazione. Sciogliere genipin prima nella componente DMSO e aggiungere il componente acqua dopo per evitare grumi.
- Reticolarlo i campioni dalla immersione nella soluzione di reticolazione tra 12-24 hr. Successivamente sciacquare abbondantemente con tampone citrato (pH 3,8).
- Dopo le fasi di lavaggio, sterilizzare i campioni sia con il trattamento UV (30 min) o un bagno di antibiotico / antimicotico (penicillina / streptomicina, Fungizone).
- I principali parametri che determinano la qualità della membrana basale mimica sono suo spessore e il diametro delle fibre. Calcolare i diametri delle fibre mediante microscopia a forza (AFM) immagini Atomic ottenuti nella modalità di contatto. Asciugare i campioni conflusso di azoto prima di imaging. Quantificare lo spessore di almeno 10 fibre per immagine per determinare lo spessore medio fibrilla con il software Image J.
- Lo spessore dei film può essere determinata con test zero utilizzando AFM. Secco (COL / ALG) 24 film multistrato / COL. Utilizzare un ago di siringa a graffiare la pellicola. Dopo la localizzazione del graffio con un microscopio ottico, ottenere immagini AFM su 10 x 10 micron 2 superfici al confine del graffio. Calcolare le altezze dei profili ottenuti con il software AFM, che fornisce lo spessore dello strato di pellicola.
3. Monitoraggio indiretto di Implant Integrazione in vivo Analisi del plasma sanguigno
- Tutte le approvazioni delle commissioni necessarie devono essere prese per la sperimentazione animale in base alle regole che disciplinano per ogni paese 21. Nel nostro caso la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (Consiglio Nazionale delle Ricerche, 2010) è seguito e THapprovazione e dell'Università di comitato etico Strasburgo si ottiene.
- Eseguire l'impianto presso il sito di destinazione. Il protocollo di monitoraggio sangue dato qui è stato utilizzato per la sostituzione tracheale in conigli bianchi New Zealand di una resezione tracheale 15 mm.
- Dopo l'impianto di un giorno di follow-up è necessario, come ad esempio montioring il benessere degli animali (la guarigione intorno ai siti chirurgici, il tasso di respirazione) generale e la registrazione del loro peso.
- Per convalidare l'esame del sangue, utilizzare un metodo ben consolidato come il test ELISA per i livelli di CRP nel sangue. Test CRP per molti animali sono a disposizione ed il test specifico utilizzato per i conigli sono elencati nella Tabella 1. Allo stesso modo, l'uso western blotting per la determinazione dei livelli di CGA. Anticorpi monoclonali anti-CGA (anti-CGA 47-68) sono stati utilizzati in questo protocollo.
- Per la caratterizzazione di plasma, ottenere campioni di sangue dalla vena auricolare dei conigli. Centrifugare a 5000 rpm per 20 min a 4 °, C. Utilizzare il supernatante ottenuto per l'analisi. Nella nostra procedura, questi test sono fatti su base settimanale, ma i test più frequenti sono inoltre possibili.
- HPLC in fase inversa purificazione del contenuto proteico: Estrarre il plasma di coniglio con il 0,1% di acido trifluoroacetico (1:1, v: v). Purificare l'estratto utilizzando un sistema di HPLC Dionex (ultima 3000; Sunnyvale, CA USA) su un NUCLEOSIL fase inversa 300-5C18-colonna (4 x 250 mm; particella 5 micron, porosità, 300 Å).
- Registrare l'assorbanza a 214 e 280 nm. Il sistema solvente usato è i) Solvente A: Acido 0,1% (v / v) trifluoroacetico (TFA) in acqua e ii) Solvente B: 0,09% (v / v) TFA in 70% (v / v) di acetonitrile-acqua.
- Utilizzare un flusso di 700 ml / min utilizzando gradienti per eluizioni. Raccogliere le frazioni di punta. Concentrare le frazioni per evaporazione dalla applicazione della velocità a vuoto. È importante arrestare la velocità-vuoto prima completa secchezza.
- Correlare i picchi ottenuti in diversi punti temporali nel coUrse del periodo di impianto. Utilizzare i peptidi purificati che mostrano andamenti coerenti durante il corso di impiantazione per l'identificazione mediante sequenziamento automatico Edman.
- Automatica Edman sequenziamento dei peptidi: Determinare la sequenza N-terminale dei peptidi purificati mediante degradazione di Edman automatico utilizzando un microsequencer Procise. Caricare il campione di filtri in fibra di vetro polibrene-trattati. Passo successivo è l'identificazione di acidi Phenylthiohydantoin-aminoacidi (PTH-Xaa) mediante cromatografia su una colonna C 18 (PTH C-18, 2.1 x 200 mm) 22. Dopo la sequenza è ottenuta, può essere identificato da software Blast utilizzando il database Swiss-Prot.
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Representative Results
Formazione di gradienti pori
Modificando la concentrazione della soluzione PLLA, è possibile controllare la dimensione dei pori sul lato extraluminale degli impianti. Dimensioni e la forma dei pori è stata significativamente influenzata dalla presenza di impianti in titanio (figure 1a e 1b). Dimensioni dei pori variava 40-100 micron e l'utilizzo di concentrazioni più basse hanno provocato pori più piccoli. Considerando che, nella dimensione dei pori endoluminale lato è stato disciplinato dalla estrazione ristretta ed era circa 9 micron 23, inferiore alla dimensione media dei fibroblasti. Aggiungendo un passaggio di incubazione a temperatura ambiente una struttura porosa doppia, dove le pareti dei pori di pori più grandi hanno una loro porosità può essere ottenuto. Questa caratteristica è importante per protesi spesse, poiché faciliterebbe il gas e il movimento dei nutrienti (Figura 1c).
Nanofibrillar membrana basale-mimico formazione
(Figura 2). Questo strato pellicola è stabile sulla parte superiore della schiuma PLLA e può anche essere mantenuta in superficie in assenza della schiuma (figure 3a e 3b). Fibre collagene nanoscala formano come strato pellicola cresce (figura 3c). La crescita del film è esponenziale, quindi un film spesso di diverse centinaia di nanometri può essere ottenuto (Figura 3d).
Analisi del plasma sanguigno con HPLC e successivo sequenziamento dopo impianto
Impianti in titanio poroso integrano con il tessuto ospite e sono completamente riempiti tra 4-6 settimane in vivo (Figura 4). Tuttavia, continuazione di questo processo può portare alla ristenosi e in presenza del gradiente poro causa della struttura PLLA, nessuna presenza di fibroblasti è stato osservato unaopo 6 settimane di fissaggio 20. Durante questo periodo di analisi HPLC ha mostrato picchi distinti che fluttuano nel corso momento dell'impianto. Le frazioni di picco di interesse sono in sequenza e determinati a essere alfa e beta dell'emoglobina ½ catene (Figura 5), che avevano mostrato un andamento simile, con letture di CRP.
Figura 1. Metodo di formazione di pendenze poro. Preparazione di schiume PLLA porosi tramite metodo di congelamento-estrazione. Micrografie SEM (A) senza impianti in titanio macroporose (esterno) (B) con impianti in titanio macroporose (esterno) (C), con impianti in titanio macroporose (interno). Presenza degli impianti cambiato la morfologia dei pori. (C, D) stesso processo può essere appl IED a strutture tubolari per ottenere gradienti poro nelle protesi tubulari. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Schema dello sviluppo dell'impianto multifunzionale. Partendo da microsfere impianti porosi a base, per aggiunta di una schiuma a base di polimero sintetico un gradiente dimensione dei pori può essere ottenuto. Forma della sfumatura poro è parzialmente controllata dalla struttura degli stampi. In cima a questa struttura una struttura a membrana-come seminterrato può essere aggiunto, che fornirebbe una superficie adatta per l'adesione cellulare e la formazione di rivestimento in 2D.
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Figura 3. Nanofibrillar formazione multistrato su impianti in titanio come una membrana mimando seminterrato. Spesse collagene / alginato multistrati possono essere formati specificamente sulla superficie (A) in titanio solo impianti (con una dimensione media goccia di 400-500 micron) (B) di titanio / PLLA ibridi schiuma. Questa superficie (~ 1 micron di spessore) fornisce un substrato per il fissaggio e la proliferazione delle cellule endoteliali (C) La natura nanofibrillar dei multistrati è caratterizzata da analisi AFM (area di scansione: 30 um x 30 um) (D) Spessore della multistrati è determinata dalla prova di graffio. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Figura 4. Integrazione di impianti in titanio poroso in vivo nei conigli. Haemotoxylin & eosina dell'impianto sezioni trasversali espiantati (A) Le superfici porose possono essere completamente riempito entro un periodo di 4-6 settimane in vivo (B) Il tessuto all'interno dei pori è un tessuto connettivo maturo con un buon livello di vascolarizzazione .
Figura 5. Monitoraggio del contenuto di proteine del plasma nel corso di un impianto tramite HPLC e successivo sequenziamento. Le curve rappresentative HPLC mostrano i picchi ottenuti da campioni di sangue di animali dopo 3, 4 e 6 settimane di impiantazione rispettivamente (in alto a sinistra, superiore destro, inferiore sinistro ). Ogni picco corrisponde a una proteina specifica. Le differenzenel picco corrispondono alla relativa abbondanza di una data proteina, che può essere determinato mediante sequenziamento (come α e ß-emoglobina ½ catene). Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Gradienti pori sono strumenti importanti in ingegneria tissutale di interfaccia e il sistema qui descritto possono essere usati da soli o in combinazione con impianti metallici a formare pori gradiente di studiare la migrazione cellulare. Il sistema non richiede alcuna impostazione supplementare o attrezzatura supplementare tranne sotto cappa per gestire solventi organici, così può essere applicato in laboratori di biologia. Polimeri simili come poli (acido glicolico) (PGA), poli (lattico-co-glicolico) acido (PLGA) e poli (caprolattone) (PCL) possono essere utilizzati con lievi modifiche. Altre strutture macroporosi che non sarebbe dissolto in solventi organici possono anche essere utilizzati. Per ottenere piccole dimensioni dei pori (scala nanometrica) su una superficie, un ulteriore strato di pellicola sottile formazione nanoporous è anche possibile. Questo può essere ottenuto mettendo prima una soluzione diluita (1%) del polimero sulla parte superiore della struttura in un solvente altamente volatile (come cloroformio) e quindi provocando immediatamente separazione di fase immergendo in apsoluzione di etanolo ure. In questo modo un sistema di co-coltura che è basato solo materiale può essere ottenuto.
Il disegno dello stampo teflon è cruciale per il controllo della dimensione dei pori come il movimento del liquido di estrazione è determinata da questa. Il movimento del liquido di estrazione e il tasso di cambio tra il fluido e il solvente di estrazione influenzano la formazione di pori. Il controllo può essere ulteriormente migliorata con l'applicazione di flusso laminare del fluido di estrazione attraverso l'impianto. La quantità di liquido di estrazione è un parametro importante e dovrebbe essere disposti rispetto alla quantità di polimero utilizzato e anche rispetto alle dimensioni dell'impianto. Per impianti cilindrici con spessore di 2mm e diametro 11 mm formato da 500 micron perle di grado titanio medici è necessario un bagno di estrazione di 200 ml. Per studiare la migrazione delle cellule, PKH26 è una scelta migliore per gli studi migratori a lungo termine, mentre Calcein-AM fornisce una migliore osservazione della morfologia cellulare. Quantification di movimento delle cellule nella direzione z è un indiretto misurazione in vitro del controllo sul movimento cellulare. Anche questo sistema può essere utilizzato con cellule endoteliali per la quantificazione della vascolarizzazione in vitro degli impianti, sia seminando diretto o mediante saggi di angiogenesi standard usando gel di incapsulamento 24.
Ci sono diversi metodi di formazione nanofibre disponibili come electrospinning o fase di separazione, ma electrospinning di collagene è generalmente considerato per denaturare fibrille di collagene. Utilizzazione di una struttura basata polielettrolita assicura la prevenzione della denaturazione mentre fornisce la struttura fibrillare necessario con elevato grado di precisione. Anche i metodi LBL sono più facili da adattare per le forme implantari complesse. Strati di film su strutture porose sono metodi semplici per sviluppare saggi transwell-come con un maggiore controllo sulle interazioni tra le componenti cellulari. E 'possibile osservare con confocal microscopia lo strato superiore sull'impianto. Questo può essere usato per osservare l'interazione delle cellule primarie rilevanti con i multistrati a contatto con l'impianto, quali cellule epiteliali o cellule endoteliali. Cellule isolate o 25 o commercialmente disponibili possono essere utilizzati. Questo strato pellicola fornisce una superficie in cui può essere sviluppato un rivestimento interno di un organo tubolare. Ad esempio, nel caso specifico lo scopo era quello di sviluppare una membrana artificiale per trachea, e questa struttura ha dimostrato di essere adatto per epitelio respiratorio 23.
Spessore dello strato è fissato a un livello in cui il film è spesso sufficiente per agire come una barriera (24 bi-layer). In entrambi titanio e titanio solo / PLLA impianti, dovuti alla idrofobicità del substrato uno strato di pellicola relativamente piatto possono essere formati sugli impianti, in cui i pori contribuiscono alla stabilità dell'interfaccia tra la struttura e lo strato di pellicola di nuova formazione. Tra la reticolazione disponibile methods, genipin reticolazione è il più adatto per sperimentazioni animali. Altri metodi di reticolazione quali glutaraldeide, EDC / NHS possono anche essere usati, ma in genere provocano attaccamento cellula meno. Un'altra possibilità è quella di utilizzare collagene photocrosslinkable 26.
Proteine sequenziamento è un metodo promettente per il monitoraggio dell'impianto, in quanto potrebbe fornire più approfondita comprensione. Secondo la natura delle proteine ottenuti, è possibile dedurre gli effetti sistemici del impianto e anche monitorare vicino eventuali infezioni che sono particolarmente importanti per i casi in cui l'impianto non è in una zona chiusa, come nel caso degli impianti tracheali . La diagnosi precoce delle infezioni può portare alla prevenzione delle complicanze correlate complicanze in modo tempestivo. Il profilo HPLC può fornire ulteriori informazioni rispetto alla sola caratterizzazione di una data proteina, come CRP o CGA come diversi picchi con diverse proteine di interesse possono essere ottenutinito con questo metodo. Ad esempio, alfa e beta dell'emoglobina catene ½ per conigli con protesi tracheali hanno mostrato tendenze simili con letture di CRP nel nostro modello di sostituzione completa tracheale. Tale versatilità fornirebbe una sede per determinare minuto effetto sistemico con grande precisione con il miglioramento delle tecniche descritte.
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Disclosures
NE Vrana è un dipendente di Protip SAS.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Andre Walder e Nicolas Perrin per la produzione di protesi in titanio, K. Benmlih per l'accumulo degli stampi in teflon e Dr. G. Prevost per il suo aiuto con la sperimentazione animale. Riconosciamo anche la Regione Alsazia e PMNA (Polo Materiaux et Nanoscienze d'Alsace) per il contributo finanziario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss | ||
Table 1. List of Materials and Reagents. |
|||
References
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).
- Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications. Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).
- Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).
- Janssen, L. M., et al. Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).
- Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28, 2810-2820 (2007).
- Schultz, P., et al. Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis. Biomaterials. 26, 2621-2630 (2005).
- Müller, S., et al. VEGF-Functionalized Polyelectrolyte Multilayers as Proangiogenic Prosthetic Coatings. Advanced Functional Materials. 18, 1767-1775 (2008).
- Mills, R. J., Frith, J. E., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J. Effect of Geometric Challenges on Cell Migration. Tissue Engineering Part C-Methods. 17, 999-1010 (2011).
- O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26, 433-441 (2005).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26, 5474-5491 (2005).
- Budyanto, L., Goh, Y. Q., Ooi, C. P. Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid - liquid phase separation and freeze extraction. J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Chaubaroux, C., et al. Collagen-Based Fibrillar Multilayer Films Cross-Linked by a Natural Agent. Biomacromolecules. 13, 2128-2135 (2012).
- Huang, Y., Siewe, M., Madihally, S. V. Effect of spatial architecture on cellular colonization. Biotechnology and Bioengineering. 93, 64-75 (2006).
- Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Unger, R. E. Co-culture systems for vascularization - Learning from nature. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, 291-299 (2011).
- Lavalle, P., et al. Dynamic Aspects of Films Prepared by a Sequential Deposition of Species: Perspectives for Smart and Responsive Materials. Advanced Materials. 23, 1191-1221 (2011).
- Zhang, D., et al. Serum concentration of chromogranin A at admission: An early biomarker of severity in critically ill patients. Annals of Medicine. 41, 38-44 (2009).
- Goh, Y., Ooi, C. Fabrication and characterization of porous poly(l -lactide) scaffolds using solid - liquid phase separation. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2445-2452 (2008).
- Vrana, N. E., et al. Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions. Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).
- Dupret-Bories, A., et al. Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep. J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).
- Gasnier, C. Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules. Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).
- Vrana, N. E. Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement. PLoS ONE. 6, e20480 (2011).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032 (2012).
- Dong, C. -M., et al. Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen. Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).
