Summary
Neste vídeo, vamos demonstrar técnicas de modificação de implantes metálicos porosos para melhorar a sua funcionalidade e para controlar a migração celular. As técnicas incluem o desenvolvimento de gradientes de poros para controlar o movimento de células em 3D e a produção da membrana basal imita para controlar o movimento de células em 2-D. Além disso, um método baseado em HPLC para o acompanhamento da integração do implante in vivo através de análise de proteínas do sangue é descrito.
Abstract
Os implantes metálicos, especialmente os implantes de titânio, são amplamente utilizados em aplicações clínicas. Tecido em crescimento e integração para estes implantes nos tecidos são parâmetros importantes para os resultados clínicos de sucesso. A fim de melhorar a integração do tecido, implantes metálicos porosos têm sido desenvolvidos. A porosidade aberta de espumas metálicas é muito vantajoso, uma vez que as áreas dos poros pode ser funcionalizado, sem comprometer as propriedades mecânicas de toda a estrutura. Aqui descrevemos tais modificações usando implantes de titânio poroso baseado em microesferas de titânio. Usando propriedades físicas inerentes, tais como a hidrofobicidade de titânio, é possível obter gradientes de poros hidrofóbicos dentro microbead implantes metálicos baseados e, ao mesmo tempo que têm uma membrana basal mímico à base de polímeros hidrofílicos, naturais. Gradientes de poro 3D são formadas por polímeros sintéticos tais como o ácido poli-L-láctico (PLLA) pelo método de congelação-extracção. 2D nanofibrillar suras faces são formadas usando colagénio / alginato seguido por um passo de reticulação com um agente de reticulação natural (genipin). Este filme nanofibrillar foi construído por camada pelo método de deposição das duas moléculas de carga oposta, o colagénio e alginato camada (LBL). Finalmente, um implante onde diferentes áreas pode acomodar diferentes tipos de células, como isto é necessário para muitos tecidos multicelulares, podem ser obtidos. Por, esta forma movimento celular em diferentes direcções de diferentes tipos de células pode ser controlada. Tal sistema é descrito para o caso específico de traqueia de regeneração, mas pode ser modificado para outros órgãos alvo. Análise da migração celular e os métodos possíveis para a criação de diferentes gradientes de poros são elaborados. O passo seguinte na análise de tais implantes é a sua caracterização após a implantação. No entanto, a análise histológica de implantes metálicos é um processo longo e complicado, portanto, para monitoramento de reação host para implantes metálicos in vivo a umaMétodo lternative baseada no controlo de proteínas do sangue e CGA diferente é também descrito. Estes métodos podem ser utilizados para o desenvolvimento in vitro de migração e feitos por testes de colonização e também ser usado para a análise dos implantes metálicos funcionalizados in vivo sem histologia.
Introduction
Actualmente os implantes metálicos disponíveis são adequados para aplicações de suporte de carga, mas a sua degradabilidade não necessita de modelos que garantam uma interface forte com o tecido em torno deles 1. Ao proporcionar estruturas que facilitam o crescimento celular em colonização e in vivo, o tempo de vida dos implantes metálicos podem ser prolongadas 2. Os implantes metálicos abertamente porosa são materiais promissores para a engenharia de tecidos da interface e também para assegurar uma boa colonização dos implantes. Eles têm sido utilizados como implantes ortopédicos activamente e também como implantes traqueais 3-5. No entanto, ainda há problemas que precisam de ser resolvidos, tais como o controlo preciso sobre o movimento celular nas áreas dos poros. A falha para controlar este processo pode conduzir à colonização incompleto em uma extremidade e restenose na outra. Também ainda a funcionalização destes implantes é necessária para a obtenção de elevados funções tais como, entrega de factores de crescimento,vascularização dirigido e movimento simultâneo de diferentes tipos de células de 6-8. Para implantes traqueais, isto é crucial que a colonização do implante por um tecido vascularizado é desejável. No entanto, o tecido em crescimento descontrolado para o lúmen de traqueia é indesejável porque ele diminui a permeabilidade do implante.
Uma possibilidade para controlar o movimento da pilha é de exclusão de tamanho. Conhecendo o tamanho das células alvo e da sua capacidade para interagir com um dado polímero sintético é possível desenvolver gradientes de poros que pode eficazmente determinam a profundidade de célula de circulação. Por exemplo através da criação de uma arquitectura de poro que seja suficientemente grande para a entrada das células do tecido conjuntivo tais como os fibroblastos extraluminally, mas suficientemente pequenos (menos de 10 mm) para impedir o seu movimento intraluminarmente um controlo efectivo sobre a colonização de um implante tubular pode ser alcançado.
De métodos de criação de poros disponíveis, tais como congelamento drying, a lixiviação das partículas, gás de formação de espuma 9,10; mais fácil de adaptar o método para a rápida formação de gradientes de poro com uma quantidade mínima de equipamentos necessários por congelação é de extracção 11. Neste método, uma solução de polímero é congelado numa mistura binária de um solvente orgânico e água. Em seguida, o solvente é trocado por meio de extracção por um líquido, pré-refrigerada miscível tal como etanol. Congelamento e condições de extracção determinar a forma e tamanho dos poros e, se a extracção é realizada de uma maneira em que o movimento da solução de extracção, pode ser controlada, a forma e tamanho de poro pode ser modulada direcionalmente.
Segundo passo para tecidos multicelulares é a formação de barreiras porosas entre diferentes tipos de células para controlar a sua interacção. Isto também é necessário para a disponibilidade de diferentes microambientes para diferentes tipos de células em função das suas exigências de 12,13. Traquéia é um órgão tubular que liga laringe com brônquiosi. Tem um revestimento interior do epitélio ciliar pseudo com células caliciformes produtoras de muco que interdispersas. A estrutura 3D e estabilidade da traqueia é mantida por cartilagem em forma de C-rings. Assim, numa traqueia artificial deveria haver uma junção definida entre o tecido conectivo e a camada epitelial ciliar. Embora uma estrutura em 3D é necessário que a parte do tecido conjuntivo, a migração de células epiteliais requer uma membrana basal, como de superfície para obter o movimento direccional e fechamento da ferida. Polieletrólito filmes multicamadas (PEM) são uma opção possível obter imita membrana basal. Método camada por camada (LBL) é um processo versátil de obter revestimentos de superfície fina e funcional. É baseado em interações eletrostáticas de dois polieletrólitos de cargas opostas e seu acúmulo de forma seqüencial para obter revestimentos de superfície em nanoescala cujas propriedades podem ser alteradas simplesmente mudando variáveis como espécie de polieletrólito, pH,Número camada, a adição de uma camada de nivelamento, a reticulação, etc Uma das principais vantagens do método de automontagem é a sua capacidade para conformar à topografia do substrato subjacente. Assim, sob condições controladas, este método pode também ser utilizado para a obtenção de uma cobertura de superfície de estruturas porosas. Se colagénio é utilizado como um dos polielectrólitos é possível obter estruturas nanofibrillar que podem mimetizar a superfície da membrana basal. A hidrofobicidade do titânio permite o desenvolvimento de tais estruturas e fibrillarity pode ser preservada em revestimentos grossos 14. Esta forma de fixação e movimento de células na superfície também pode ser controlado. Usando extracção por congelação e revestimento de filme LbL sequencialmente, uma estrutura em que o movimento da pilha pode ser controlada lateralmente, longitudinalmente e pode ser obtida perifericamente 15.
Aqui nós descrevemos dois métodos de modificação novas para implantes de titânio usando seu comportamento hidrofóbico que pode seralargado a alteração de vários implantes porosos: i) a formação de gradientes de microporos dentro dos implantes de titânio macroporosos com hidrófobos, polímeros sintéticos ii) a formação de uma camada de espessura de película de polímero sobre a superfície do implante que suporta o crescimento de células e formação de revestimento de multicamadas de polielectrólitos. Estes métodos podem ser usados sequencialmente ou separadamente. Eles proporcionam estruturas que garantem a migração controlada e organização espacial dos diferentes tipos de células em tecidos multicelulares 16,17. Para o caso específico de traqueia, o resultado pretendido para o implante seria a colonização por tecido fibrovascular dentro dos gradientes micropore sem reestenose e da formação do revestimento interior de células epiteliais ciliadas sobre as multicamadas polielectrólitos.
Uma maneira de controlar a integração dos implantes é fazer pequenas intervenções cirúrgicas durante o período de sua integração com o hospedeiro in situ. A fim de ser capaz tó decidir sobre o momento das intervenções, é importante ter informações sobre os efeitos sistêmicos do implante. Proteína C-reativa (PCR) tem sido utilizada para o monitoramento da infecção e resposta inflamatória em ambientes clínicos. Cromogranina A (CGA) também pode ser usado de uma maneira semelhante e podem proporcionar resultados mais precisos para observar o nível de inflamação 18. Como uma forma possível de se observar a integração do implante metálico in vivo, apresentamos um processo de acompanhamento contínuo dos efeitos sistêmicos do implante por caracterização de amostras de sangue de animais com Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) e posterior sequenciamento de proteínas. Elaboração do presente método pode ser usado para evitar a análise histológica de ponto final regular. Corte histológico de implantes metálicos é um processo demorado, caro e complicado e só pode ser realizado em pontos de tempo específicos. Por essa razão, bem concebido testes sanguíneos que fornecem informações robustas sobre a saúde implante seriaser possíveis rotas para diminuir experiências com animais, como manda as regras da UE recentes sobre experimentos com animais.
Os métodos aqui apresentados podem ser utilizados para melhorar o desempenho de implantes metálicos por meio de funcionalização ou ter uma forma alternativa de controlo dos implantes existentes.
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Protocol
1. Preparação de gradientes de microporos em implantes metálicos macroporosas
- Limpar os implantes (por exemplo, implantes feitos de esferas de titânio de grau médico, com uma gama de tamanhos de 400-500 mM, Neyco SAS, França) com etanol e acetona, em seguida, sonicar durante 15 min.
- Concepção e fabrico de moldes de Teflon de acordo com o tamanho e forma do implante (Para as experiências de padrão, são usados moldes cilíndricos de 1,5 cm de diâmetro, com uma altura de 2 cm). Os moldes devem ser modular, de modo que as determinadas partes podem ser removidos durante a extracção. Um tal desenho de molde assegura que o controlo sobre o processo de extracção, forçando o movimento do fluido de extracção de uma maneira dirigida.
- Para implantes tubulares destinados a substituir a traqueia, a estrutura deve ser composto de três partes: i) uma parte do fundo para determinar o tamanho do implante, ii) um mandril e iii) um núcleo exterior que é removível. Desta forma, o gradiente de tamanho de poro pode ser formado a partir do exterior para dentro. <li> Preparar a solução de polímero sintético (PLLA): Para a solução de PLLA congelamento / extracção deve ser preparado de uma mistura binária de dioxano e água (87:13%, v: v).
- Aquecer a mistura a 60 ° C, a fim de se obter uma solução homogénea. 60 ° C, que é escolhido como o limite superior da resistência à temperatura para as seringas de vidro de precisão que tem de ser utilizado para a introdução da solução para os implantes.
- Se forem utilizados alta concentração (≥ 6%), soluções de PLLA de elevado peso molecular, introduzir a solução no implante imediatamente após o aquecimento. Caso contrário, a gelificação da solução ocorre sem imersão completa.
- Calcular o volume da solução de polímero necessária no que diz respeito à porosidade do implante, para alterar a precisão do volume da solução congelada pode ser levado em conta.
- Introduzir a solução para os implantes com seringas de vidro de precisão com precisão de 0,1 ul. O limite inferior para a concentração de polímero é3% para a formação de poros gradiente reprodutível enquanto se torna difícil obter uma distribuição homogénea das amostras de espessura acima de 6%. No entanto, para aplicações específicas, podem ser usadas outras concentrações.
- Congele as amostras directamente a -80 ° C ou com um período de incubação prévia de 30 min à temperatura ambiente. Condições de congelação parcialmente determinar a formação de poros, pelo que as condições de congelamento pode ser ajustada de acordo com a porosidade destinada. Manter as amostras durante a noite a -80 ° C.
- Extração: Mergulhe os implantes em 80% EtOH pré-refrigerados. Efectua-se a extracção à temperatura de -20 ° C durante a noite. Para se obter gradientes porosidade, remover todas as partes do molde excepto o mandril para os implantes tubulares e todas as partes, com excepção da parte do fundo para implantes em forma de disco. É um bisturi pré-refrigerada para facilitar a separação do molde.
- Após extracção, a -20 ° C durante a noite 19, remover as restantes partes do molde e ar seco dos implantes. Para a caracterização dea porosidade geral da análise da estrutura de porosímetro de mercúrio é necessário. Mercury medições porosímetro mostrou picos distintos que correspondem aos poros em ambos os lados do implante e os poros mais pequenos interdispersas. Contudo, os dados mais importantes é a diferença entre as porosidades das superfícies intraluminais e extraluminal, que podem ser analisadas por Image J para a distribuição de tamanho de poro com um microscópio electrónico de varredura (SEM) 20. Para a verificação do gradiente de poros, congelar-fraturar as amostras e observar a seção transversal com SEM.
- Devido à natureza porosa aberta dos implantes utilizados, e a capacidade de reflectir a luz de titânio, é possível fazê-z-as pilhas de células marcadas dentro de implantes porosos. Rotular as células com PKH26 ou Calcein-AM e visualizar os implantes com a microscopia confocal a laser.
2. Revestimento de superfície de implantes metálicos porosos com Colágeno / alginato Multilayers
- Para construir-upde multicamadas, a mais alta reprodutibilidade é obtido com robôs de mergulho. No entanto, se um robô de imersão não está disponível estas etapas podem ser feitas manualmente.
- Use um grau de colágeno tipo I médica e alginato de sódio. As concentrações são optimizados de 0,5 g / L para cada em 150 mM de NaCl em tampão de citrato a pH 3,8.
- Dissolve-se a solução de colagénio durante a noite para assegurar a homogeneidade da solução. PH ácido de 3,8 é necessária para a acumulação estável das camadas que a estrutura é instável antes da reticulação, em pH neutro.
- Depositar as camadas por um sistema de robô mergulhando por imersão dos implantes em soluções de colágeno e alginato como alternativa. Deposição de tempo é de 15 minutos para cada camada subsequente. Lavar a estrutura entre os passos de deposição com NaCl 150 mM a pH 3,8, durante 5 minutos.
- Projeto titular específico para a utilização de implantes com robôs de imersão usados na produção de camadas múltiplas polielectrólito. Depositar as camadas da superfície de titânio ou apenas implants ou implantes modificados, conforme descrito na seção 1.
- A estabilização da membrana basal mimetizar com genipin: Preparar a solução de reticulação numa dimetilsulfóxido (DMSO) / tampão de citrato (150 mM de NaCl, pH 3,8) a 01:04 v: v proporção. Uma ampla gama de concentrações e pode ser usada a 100 mM é adequado para a reticulação. Dissolver genipin primeiro no componente de DMSO e adiciona o componente de água mais tarde para evitar a aglomeração.
- CROSSLINK as amostras pela imersão na solução de reticulação entre 12-24 horas. Depois enxágüe com copiosa quantidade de tampão citrato (pH 3,8).
- Após as etapas de lavagem, esterilizar as amostras, quer com tratamento UV (30 min) ou num banho de antibiótico / antifúngico (Penicilina / Estreptomicina, Fungizone).
- Os parâmetros principais que determinam a qualidade da membrana basal são imitar a sua espessura e o diâmetro das fibras. Calcule o diâmetro da fibra, utilizando imagens de microscopia de força atômica (AFM) obtidas no modo de contato. Secam-se as amostras com umfluxo de nitrogênio antes da imagem. Quantificar a espessura de pelo menos 10 fibras por imagem para determinar a espessura média de fibrilas com software Image J.
- A espessura dos filmes pode ser determinada por testes de arranhão utilizando AFM. Dry (COL / ALG) 24 filmes multicamadas / Col. Use uma agulha de seringa para arranhar o filme. Depois da localização da raiz com um microscópio de luz, com a obtenção de imagens AFM em 10 x 10 um 2 superfícies no limite do zero. Calcular as alturas a partir dos perfis obtidos com o software de AFM, que fornece a espessura da camada de película.
3. Monitoramento indireto da Integração Implant In vivo pela análise do plasma sanguíneo
- Todas as aprovações das comissões necessárias devem ser tomadas para a experimentação animal de acordo com as regras de cada país 21. No nosso caso, o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Research Council, 2010) é seguido e thaprovação e da Universidade de Estrasburgo comitê de ética é obtido.
- Realizar a implantação no local de destino. O protocolo de monitoramento sangue dado aqui foi usado para substituição traqueal em coelhos Nova Zelândia Branco de uma ressecção traqueal 15 mm.
- Após a implantação é um acompanhamento diário necessárias, tais como montioring o bem-estar dos animais (cura em torno dos locais cirúrgicos, taxa de respiração) em geral e gravação de seu peso.
- Para validar o exame de sangue, usar um método bem estabelecido, como testes de ELISA para níveis de PCR no sangue. Testes de PCR para muitos animais estão disponíveis e o ensaio específico utilizado para coelhos está listado na Tabela 1. Da mesma forma, usar western blotting para a determinação dos níveis CGA. Anticorpos anti-CGA monoclonais (anti-CGA 47-68) foram utilizados neste protocolo.
- Para a caracterização de plasma, a obtenção de amostras de sangue das veias auriculares dos coelhos. Centrifugar a 5000 rpm durante 20 min a 4 °; C. Utilize-se o sobrenadante obtido para análise. Em nosso processo, estes testes são feitos em uma base semanal, mas testes mais freqüentes também são possíveis.
- HPLC de fase reversa de purificação das proteínas do plasma: Extrai-se a plasma de coelho com 0,1% de ácido trifluoroacético (1:1, v: v). Purifica-se o extracto por meio de um sistema de HPLC Dionex (Ultimate 3000; Sunnyvale, CA EUA) num nucleosil de fase inversa 300-5C18-coluna (4 x 250 mm, tamanho de partícula 5 fim; porosidade, 300 Â).
- Ler a absorvância a 214 e 280 nm. O sistema de solvente usado é i) Solvente A: 0,1% (v / v) de ácido trifluoroacético (TFA) em água e ii) Solvente B: 0,09% (v / v) de ATF em 70% (v / v) de acetonitrilo-água.
- É um caudal de 700 ul / min usando gradientes de eluições. Recolha as frações de pico. Concentre-se as fracções por evaporação por aplicação de vácuo de velocidade. É importante para parar o vácuo de velocidade antes secura completa.
- Correlacionar os picos obtidos em diferentes pontos de tempo ao longo do coURSE do período de implantação. Usar os péptidos purificados que estão mostrando as tendências consistentes durante o curso de implantação para a identificação automática por sequenciação de Edman.
- Sequenciação automática de Edman dos péptidos: Determinar a sequência N-terminal dos péptidos purificados por degradação automática de Edman usando um microsequencer Procise. Carregar a amostra a filtros de fibra de vidro tratados com polibreno. O passo seguinte é a identificação de ácidos aminados feniltiohidantoína (PTH-Xaa) por cromatografia sobre uma coluna C 18 (PTH C-18, 2,1 x 200 mm) 22. Depois de a sequência obtida, ela pode ser identificada pelo software de banco de dados SWISS explosão utilizando-Prot.
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Representative Results
A formação de gradientes de poro
Ao alterar a concentração da solução de PLLA, é possível controlar o tamanho dos poros no lado extraluminal dos implantes. A forma e tamanho dos poros foi significativamente afectada pela presença de implantes de titânio (Figuras 1a e 1b). Tamanhos de poros variando 40-100 mM e utilização de concentrações mais baixas resultaram em poros mais pequenos. Considerando que, no tamanho de poro do lado intraluminal foi regulada pela extracção restrita e foi de cerca de 9 mM 23, menos do que o tamanho médio dos fibroblastos. Pela adição de um passo de incubação à temperatura ambiente, uma estrutura porosa duplo, em que as paredes dos poros dos poros maiores, têm a sua própria porosidade pode ser obtida. Esta característica é importante para os implantes de espessura, uma vez que facilitaria a circulação de gás e de nutrientes (Figura 1c).
Porão Nanofibrillar membrana imitar formação
(Figura 2). Esta camada de película é estável na parte superior da espuma de PLLA e também pode ser mantido sobre a superfície na ausência da espuma (figuras 3a e 3b). As fibras de colagénio como Nanoscale formar a camada de película aumenta (Figura 3c). O crescimento da película é exponencial, assim, um filme de espessura de algumas centenas de nanómetros podem ser obtidos (Figura 3d).
Análise do plasma sanguíneo com HPLC e sequenciação subsequente após o implante
Os implantes de titânio poroso integrar-se com o tecido do hospedeiro, e estão completamente preenchidos entre 4-6 semanas in vivo (Figura 4). No entanto, a continuação deste processo pode conduzir à restenose e na presença do gradiente de poros, devido à estrutura de PLLA, sem a presença de fibroblastos foi observadaepois de 6 semanas de implantação 20. Durante este período, a análise por HPLC mostrou picos distintos que variam no decurso do tempo de implantação. As fracções de pico de interesse são sequenciados e determinada como sendo alfa e beta da hemoglobina ½ cadeias (Figura 5), que tinha mostrado uma tendência semelhante com leituras de PCR.
Figura 1. Método de formação de gradiente de poro. Preparação de espumas porosas de PLLA através do método de extracção por congelação. Micrografias (A) sem implantes de titânio macroporosos (exterior) (B) com implantes de titânio macroporosos (exterior) (C) com implantes de titânio macroporosos (interior). A presença dos implantes mudaram a morfologia dos poros. (C, D) mesmo processo pode ser apl IED para estruturas tubulares para obter gradientes de poros em implantes tubulares. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 2. Esquema do desenvolvimento do implante multifuncional. Desde microbead implantes porosos base, através da adição de uma espuma base de polímero sintético um gradiente de tamanho de poro pode ser obtido. Forma do gradiente de poro é parcialmente controlado pela estrutura dos moldes. No topo desta estrutura de uma estrutura de membrana basal, tal como pode ser adicionado, o que iria proporcionar uma superfície adequada para a ligação de células e formação de revestimento em 2D.
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Figura 3. Nanofibrillar formação de multicamadas em implantes de titânio como mimick membrana basal. Colagénio / alginato de multicamadas grossas podem ser formadas especificamente sobre a superfície de (a) apenas os implantes de titânio (com um tamanho médio de gota de 400-500 mM) (B) de titânio / PLLA híbridos de espuma. Esta superfície (~ 1 mm de espessura) proporciona um substrato para a fixação e a proliferação das células endoteliais (C) A natureza dos nanofibrillar multicamadas é caracterizado por análise de AFM (área de digitalização: 30 mm x 30 mM) (D) A espessura da multicamadas é determinado pelo teste do zero. Clique aqui para ver a figura maior .
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Figura 4. Integração dos implantes de titânio porosos in-vivo em coelhos. Haemotoxylin & Eosina dos explantados de implante as secções (A) As áreas porosas pode ser completamente cheio dentro de um período de 4-6 semanas in vivo (B) no interior dos poros do tecido é um tecido conjuntivo maduro com um bom nível de vascularização .
Figura 5. Monitorização do teor de proteínas do plasma ao longo de um implante por meio de HPLC e sequenciação subsequente. As curvas de HPLC representativos mostram os picos obtidos a partir de amostras de sangue dos animais após 3, 4 e 6 semanas de implantação, respectivamente (superior esquerdo, superior direito, inferior esquerdo ). Cada pico corresponde a uma proteína específica. As diferençasno pico correspondendo a abundância relativa de uma determinada proteína, que pode ser determinada através de sequenciação (por exemplo, α e ß-hemoglobina ½ cadeias). clique aqui para ver figura maior .
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Discussion
Gradientes de poros são ferramentas importantes na engenharia de tecidos de interface e o sistema aqui descrito pode ser utilizado sozinho ou em conjunto com implantes metálicos para formar gradiente de poro para estudar a migração celular. O sistema não necessita de qualquer configuração extra ou equipamento adicional, excepto uma coifa química para lidar com solventes orgânicos, pelo que pode ser aplicada em laboratórios de biologia. Polímeros similares, tais como poli (ácido glicólico) (PGA), poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) e poli (caprolactona) (PCL) pode ser utilizado, com ligeiras modificações. Outras estruturas macroporosas que não se dissolvem em solventes orgânicos podem também ser usados. Para a obtenção de tamanhos de poros menores (em nanoescala) sobre uma superfície, a formação de uma camada de película fina adicional nanoporoso é também possível. Isto pode ser obtido pela primeira colocação de uma solução diluída (1%) do polímero na parte superior da estrutura de um solvente altamente volátil (tal como o clorofórmio) e em seguida, imediatamente a causar a separação de fase por imersão em apsolução de etanol ure. Desta forma, um sistema de co-cultura, que se baseia num único material pode ser obtido.
O desenho do molde de teflon é crucial para o controlo do tamanho de poro, como o movimento do fluido de extracção é determinado por este. A circulação do fluido de extracção e a taxa de troca entre o fluido de extracção e o solvente afecta a formação de poros. O controle pode ser melhorada pela aplicação de um fluxo laminar do fluido de extracção através do implante. A quantidade de líquido de extracção é um parâmetro importante, e deveria ser disposto em relação à quantidade de polímero utilizado e também no que diz respeito ao tamanho do implante. Para implantes cilíndricos de 2 mm de espessura e 11 milímetros de diâmetro de 500 mm formado grânulos de titânio de grau médico num banho de extracção de 200 ml é necessário. Para estudar a migração de células, PKH26 é a melhor opção para os estudos de migração a longo prazo enquanto Calcein-AM fornece uma melhor observação da morfologia celular. Enquantontification de movimento das células em direção z é uma indireta na medida vitro do controle sobre o movimento celular. Além disso, este sistema pode ser usado com as células endoteliais para a quantificação de na vascularização in vitro dos implantes, ou por sementeira directa ou utilizando ensaios padrão da angiogénese utilizando gel de encapsulamento 24.
Existem vários métodos de formação disponíveis, tais como nanofibras electrospinning ou separação de fases, mas electrospinning de colagénio é geralmente considerado para desnaturar fibrilas de colagénio. Utilização de uma estrutura de base de polielectrólito assegura a prevenção da desnaturação, proporcionando a estrutura fibrilar necessário, com elevado grau de precisão. Também métodos automontados são mais fáceis de adaptar para as formas de implantes complexos. Camadas de filme sobre estruturas porosas são métodos simples para desenvolver ensaios transwell-like com mais controle sobre as interações entre os componentes celulares. É possível observar com confocal microscopia a camada superior sobre o implante. Isto pode ser usado para observar a interacção das células primárias correspondentes com as multicamadas em contacto com o implante, tais como células epiteliais ou células endoteliais. Tanto as células 25 isoladas ou disponíveis comercialmente podem ser utilizados. Esta camada de película que proporciona uma superfície de um revestimento interior por um órgão tubular pode ser desenvolvida. Por exemplo, neste caso específico, o objectivo foi o de desenvolver uma membrana artificial para a traqueia, e esta estrutura mostrou ser adequado para o epitélio respiratório 23.
Espessura da camada é de um nível em que o filme é grossa o suficiente para agir como uma barreira (24 bi-camadas). Em ambos titânio apenas e titânio / PLLA implantes, devido à hidrofobicidade do substrato uma camada de película relativamente plano pode ser formado sobre os implantes, em que os poros contribuem para a estabilidade da interface entre a estrutura e a camada de filme recém-formado. Entre a reticulação disponível mimthods, genipin reticulação é o mais adequado para experiências com animais. Outros métodos de ligação cruzada tais como glutaraldeído, EDC / NHS pode também ser utilizado, mas geralmente resultam em menos a ligação de células. Outra possibilidade é a utilização de colagénio photocrosslinkable 26.
Sequenciamento de proteínas é um método promissor para o monitoramento do implante, uma vez que pode fornecer mais compreensão em profundidade. De acordo com a natureza das proteínas obtidas, é possível inferir os efeitos sistémicos do implante e também acompanhar de perto possíveis infecções que são especialmente importantes para os casos em que o implante não está numa zona selada, como no caso de implantes de traqueia . A detecção precoce das infecções pode levar a prevenção de complicações relacionadas à infecção em tempo hábil. O perfil de HPLC podem proporcionar mais informação em relação à caracterização única de uma dada proteína, tais como a PCR ou CGA como vários picos com várias proteínas de interesse podem ser obtidosed com este método. Por exemplo, as cadeias alfa e beta da hemoglobina e meia para coelhos com implantes traqueais mostraram tendências semelhantes com as leituras de PCR em nosso modelo de substituição completa traqueal. Tal versatilidade iria fornecer um local para a determinação de efeito sistêmico minutos com grande precisão, com a melhoria das técnicas descritas.
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Disclosures
NE Vrana é um funcionário da Protip SAS.
Acknowledgments
Autores gostariam de agradecer ao Dr. Andre Walder e Nicolas Perrin para a fabricação de implantes de titânio, K. Benmlih para o acúmulo dos moldes de teflon e Dr. G. Prevost por sua ajuda com experiências com animais. Reconhecemos também a Região Alsácia e PMNA (Pólo Materiaux et Nanociências d'Alsace) para a contribuição financeira.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss | ||
Table 1. List of Materials and Reagents. |
|||
References
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).
- Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications. Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).
- Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).
- Janssen, L. M., et al. Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).
- Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28, 2810-2820 (2007).
- Schultz, P., et al. Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis. Biomaterials. 26, 2621-2630 (2005).
- Müller, S., et al. VEGF-Functionalized Polyelectrolyte Multilayers as Proangiogenic Prosthetic Coatings. Advanced Functional Materials. 18, 1767-1775 (2008).
- Mills, R. J., Frith, J. E., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J. Effect of Geometric Challenges on Cell Migration. Tissue Engineering Part C-Methods. 17, 999-1010 (2011).
- O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26, 433-441 (2005).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26, 5474-5491 (2005).
- Budyanto, L., Goh, Y. Q., Ooi, C. P. Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid - liquid phase separation and freeze extraction. J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Chaubaroux, C., et al. Collagen-Based Fibrillar Multilayer Films Cross-Linked by a Natural Agent. Biomacromolecules. 13, 2128-2135 (2012).
- Huang, Y., Siewe, M., Madihally, S. V. Effect of spatial architecture on cellular colonization. Biotechnology and Bioengineering. 93, 64-75 (2006).
- Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Unger, R. E. Co-culture systems for vascularization - Learning from nature. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, 291-299 (2011).
- Lavalle, P., et al. Dynamic Aspects of Films Prepared by a Sequential Deposition of Species: Perspectives for Smart and Responsive Materials. Advanced Materials. 23, 1191-1221 (2011).
- Zhang, D., et al. Serum concentration of chromogranin A at admission: An early biomarker of severity in critically ill patients. Annals of Medicine. 41, 38-44 (2009).
- Goh, Y., Ooi, C. Fabrication and characterization of porous poly(l -lactide) scaffolds using solid - liquid phase separation. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2445-2452 (2008).
- Vrana, N. E., et al. Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions. Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).
- Dupret-Bories, A., et al. Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep. J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).
- Gasnier, C. Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules. Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).
- Vrana, N. E. Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement. PLoS ONE. 6, e20480 (2011).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032 (2012).
- Dong, C. -M., et al. Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen. Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).
